Die kleine Rho GTPase ist ein Protein einer Superfamilie mit unterschiedlicher Zellfunktion. Zum Beispiel sind diese Proteine an der Regulierung des Zellschicksals, der zellulären Reaktion auf einen Stress, der zellulären Beweglichkeit und des Zellzyklus beteiligt. Die Aktivität eines kleinen Rho GTPase Proteins wird durch post-translationale Modifikation reguliert.
Diese Änderungen sind mit einer strengen Regulierung ihrer Tätigkeit verbunden. Als Beispiel sind Proteinpränylierung und GTP-Bindung die wichtigste Post-Translation-Modifikation dieser Proteine. Mein Labor hat vor kurzem eine einfache Methode modifiziert und entwickelt, um die post-translationale Modifikation dieser Superfamilienproteine zu untersuchen.
Zu diesem Zweck haben wir 251 Glioblastom-Zelllinien verwendet und sie mit Simvastatin gezielt und die posttranslationale Modifikation dieser Proteine gemessen. Die Methode beinhaltet subzelluläre Fraktionierung und GTP gebundenes Protein zu dieser Protein-Superfamilie. Zu diesem Zweck haben wir die Lokalisierung von RhoA und GTP, die an RhoA gebunden sind, verwendet, um die post-translationale Modifikation dieses Proteins zu messen.
Entfernen Sie Zellen aus dem 37-Grad-Inkubator. Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop an, um die Konfluenz zu bestätigen. Die Zellen sollten zu 70 bis 80 Prozent konfluent sein.
Waschen Sie die Zellen einmal mit kaltem PBS. Fügen Sie fünf Milliliter EDTA hinzu, und legen Sie die Zellen für fünf Minuten wieder in den 37-Grad-Inkubator. Nach fünf Minuten Inkubation, sammeln EDTA mit Zellen in einem 15 mil Rohr.
Legen Sie das Rohr in eine Eisbox, und fahren Sie mit der Zentrifuge fort. Richten Sie die Zentrifuge auf 1500g bei vier Grad ein, und drehen Sie die Zellen für fünf Minuten. Entfernen Sie nach der Drehung das Supernate, und fügen Sie einen Milliliter kalten PBS hinzu.
Trituieren Sie die Zellen gut. Übertragen Sie die Zellmischung in ein neues, beschriftetes 1,5-Milliliter-Rohr. Fahren Sie nach der Übertragung mit der Zentrifuge fort.
Stellen Sie die Zentrifuge auf 1500g bei vier Grad ein, und drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang. Überprüfen Sie die Pelletgröße. Legen Sie die Proben auf Eis.
Entsorgen Sie das Supernate vollständig, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie Buffer One hinzu. Gut mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen.
Fahren Sie mit der Beschallung fort. Stellen Sie den Beschallungsgerät für fünf Zyklen und jeweils fünf Sekunden ein, und wiederholen Sie ihn dreimal. Die Beschallung sollte auf Eis gehen, wird aber zur Veranschaulichung nicht im Video gezeigt.
Fahren Sie mit der Ultrazentrifuge fort. Verwenden Sie eine Ultrazentrifuge, um die Zellhomogenate in zytoplasmatische und Membranfraktionen zu trennen. Stellen Sie die Zentrifuge für 35 Minuten auf 100.000g auf, bei vier Grad.
Überprüfen Sie die Pelletgröße. Trennen Sie das Supernate. Sammeln Sie die Supernate vollständig, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
Das Supernat ist die zytosolische Fraktion. Legen Sie das Supernate in ein neu beschriftetes Rohr. Fügen Sie Buffer Two zum Pellet hinzu.
Dies ist die Membranfraktion. Gut mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Fahren Sie mit der Proteinbestimmung und der Westlichen Blot-Probenvorbereitung fort.
Laden Sie die Proben mit einem 15%gel auf eine SDS-PAGE. Bestätigen Sie den Proteintransfer, indem Sie den Molekulargewichtsmarker visualisieren oder einen Ponceau-Fleck verwenden. Fügen Sie primäre Antikörper für die Immunoblotting-Analyse hinzu.
Wir verwenden Rac1/2/3, Cdc42 und RhoA. Bringen Sie die Kulturplatten aus dem Brutkasten. Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop an, um die Konfluenz zu bestätigen.
Die Zellen sollten 70 bis 80 % konfluent sein. Legen Sie die Kulturplatte auf Eis. Die Medien ansaugen und die Zellen mit eiskaltem PBS-pH-PH auf 7,2 waschen.
Aspirieren Sie die PBS. Neigen Sie die Platten für eine zusätzliche Minute auf Eis, um alle Reste von PBS zu entfernen. Rest-PBS wirkt sich negativ auf diesen Test aus.
Lyse die Zellen in einem geeigneten Volumen von eiskalten Lysepuffer mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren. Erntezelle lysiert mit dem Zellschaber. Neigen Sie die Kulturplatte für diese Technik.
Das Lysat in eine beschriftete, eiskalte Kryoröhre geben und auf Eis halten. Mit einem Wirbel gründlich mischen. Halten Sie 10 Mikroliter des Lysats für einen Proteintest.
Fangen Sie das verbleibende Zelllysat in flüssigem Stickstoff ein. Übertragen Sie die Snap-Gefrorenen Kryotubes in einen Gefrierschrank von minus 80. Speichern Sie diese Beispiele.
Beachten Sie, dass Proben nicht länger als 14 Tage gelagert werden sollten. Bereiten Sie Zelllysate von den anderen Kulturplatten vor, indem Sie die Schritte eins bis acht nacheinander wiederholen. Arbeiten Sie schnell und lassen Sie die Proben nie länger als 10 Minuten auf Eis.
Behandeln Sie niemals alle Kulturplatten gleichzeitig. Messen Sie die Proteinkonzentration. Berechnen Sie das Volumen des Lysepuffers, um die Proteinkonzentration zwischen den Proben zu normalisieren.
Hinweis: Ein Milligramm pro Milliliter ist in der Regel das beste, aber 0,3 bis zwei Milligramm pro Milliliter können nachweisbar sein. Bereiten Sie ein leeres Steuerelement vor, indem Sie 60 Mikroliter Lysepuffer und 60 Mikroliter Bindungspuffer zu einem Mikrorohr hinzufügen. Bereiten Sie eine positive Kontrolle vor, indem Sie 12 Mikroliter Rho-Kontrollprotein, 48 Mikroliter Lysepuffer und 60 Mikroliter Bindungspuffer hinzufügen.
Nehmen Sie die Rho Affinitätsplatte aus ihrem Beutel und legen Sie sie auf Eis. Das Pulver in den Brunnen mit 100 Mikrolitereeis kalt destilliertem Wasser auflösen. Halten Sie die Platte auf Eis.
Tauen Sie die Snap gefrorene Zelle lysiert in einem Wasserbad auf 25 Grad Celsius eingestellt. Fügen Sie die berechnete Menge des eiskalten Lysepuffers zu jeder Probe hinzu, um die Proteinkonzentration zu normalisieren. 60 Mikroliter normalisierter Eiskaltproben auf Mikroröhren übertragen und 60 Mikroliter Bindungspuffer hinzufügen.
Mischen Sie gründlich, und halten Sie auf Eis. Entfernen Sie das Wasser vollständig von der Mikroplatte durch kräftiges Flicken, gefolgt von fünf bis sieben harten Wasserhähnen auf einer Labormatte. Fügen Sie 50 Mikroliter der normalisierten Proben, eine leere Steuerung und eine positive Kontrolle zu den Bohrungen in doppelter Ausführung hinzu.
Legen Sie die Platte 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einen Orbital-Shaker. Hinweis: Die Geschwindigkeit des Shakers sollte auf 300 Rpm eingestellt werden. Löschen Sie die Proben von der Platte durch Flicken, und waschen Sie zweimal mit 200 Mikroliter Raumtemperatur Waschpuffer.
Entfernen Sie den Waschpuffer nach jeder Wäsche durch Streichen, anschließend klopfen, und halten Sie die Platte auf der Bank bei Raumtemperatur. Fügen Sie 200 Mikroliter Raumtemperatur Antigen-präsentierenden Puffer in jeden Brunnen, und inkubieren bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Streichen Sie die Lösung aus den Brunnen und waschen Sie dreimal mit 200 Mikroliter Raumtemperatur Waschpuffer.
Fügen Sie 50 Mikroliter frisch zubereiteten ein bis 250 Anti-RhoA Primärantikörper zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie die Platte auf einem Orbital-Shaker für 45 Minuten bei 300 Rpm, eingestellt auf 25 Grad Celsius. Streichen Sie die Lösung aus den Brunnen und waschen Sie dreimal mit 200 Mikroliter Waschpuffer bei Raumtemperatur.
Fügen Sie 50 Mikroliter frisch zubereiteten bis 250 Anti-RhoA Sekundärantikörper zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie die Platte auf einen Orbital-Shaker für 45 Minuten, bei 300 Umdrehungen pro Minute, eingestellt auf 25 Grad Celsius. Bereiten Sie das HRP-Detektionsreagenz vor, indem Sie gleiche Volumina von Reagenz A und Reagenz B.Flick aus jedem Brunnen herausmischen und dreimal mit 200 Mikroliter Raumtemperatur-Waschpuffer waschen.
Fügen Sie jedem Brunnen 50 Mikroliter frisch zubereitetes HRP-Detektionsreagenz hinzu. Lesen Sie das Lumineszenzsignal innerhalb von drei bis fünf Minuten, um ein maximales Signal zu erhalten. Analysieren Sie die Ergebnisse mit einem geeigneten Softwarepaket.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass Simvastatin die Lokalisation von RhoA in der Membranfraktion verringerte. Was zugenommen hat, ist die Akkumulation in der zytosolischen Fraktion. Interessanterweise, Simvastatin erhöhte GTP gebunden an die RhoA.Warum?
Wir erwarten, dass Simvastatin diese Aktivität verringert. Es ist sehr wichtig, dass sie sowohl die subzelluläre Lokalisation dieses Proteins messen als auch die GTP-Bindung an dieses Protein messen, um eine abschließende Bewertung der Aktivität der kleinen Rho GTPases zu haben.
