Unsere Forschung im Labor wird durch die Interne Research Program des NIH, National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism unterstützt.

<html> I. Vorbereitung zur Injektion Dieser Abschnitt beschreibt die vorbereitenden Schritte, die vor der Injektion cDNA in den Zellkern von Neuronen ergriffen werden müssen. Die Isolierung Verfahren für die Neuronen würde den Rahmen dieses Artikels, aber es ist wichtig, dass Neuronen dissoziiert in einzelne Zellen und die Einhaltung auch zu der unteren Fläche von 35 mm Zellkulturschalen (siehe Diskussion für hilfreiche Tipps, um dieses Ziel zu erreichen). Obwohl eine Vielzahl von verschiedenen Neuronen möglicherweise genutzt werden könnten, sind periphere Ganglien, wie die überlegene Halsganglien (SCG) oder der Spinalganglien für die Präparation bevorzugt, weil sie bequem zugänglich und ergeben eine große Anzahl von Neuronen. Zusätzliche Vorteile der Verwendung von SCG Neuronen sind, dass sie eine relativ homogene Population von Zellen und 1,2,3,4 gut charakterisierten. A. Herstellung von Plasmid-cDNA zur Injektion <ol><li> Um zu verhindern, Verschmutzung oder Ausfall der DNA, sollte Handschuhe während der Vorbereitung getragen werden. </li><li> DNA, die das Protein von Interesse in einen geeigneten Säugerexpressionsvektor, wie PCI (Promega, Madison, WI), nach der Verordnung über die hoch und konstitutiv aktiven Cytomegalievirus (CMV)-Promotor subkloniert. Wenn das Protein nicht gekennzeichnet ist, ein Reporter-Plasmid, die Verschlüsselung mit EGFP zum Beispiel (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), co-injiziert, um erfolgreiche Injektion und Expression zu bestätigen. DNA isoliert mit einer hochwertigen Trennsäule (zB QIAfilter Midi-Prep-Kit, Qiagen, Chatsworth, CA) und weiter gereinigt durch eine zentrifugale Filtereinheit mit einem PVDF-Filter (0,1 um, Millipore, Bedford, MA), um Partikel in den entfernen Plasmid-Präparation, die Injektion Pipetten während der Injektion Prozess zu behindern. Plasmide sind bei -20 ° C bei einer Konzentration von etwa 1 ug / ul in eine geeignete DNA Pufferspeicher (: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 zB TE-Puffer) gespeichert. </li><li> Unmittelbar vor der Mikroinjektion werden Plasmid-cDNAs verdünnt und auf die gewünschte Endkonzentration in TE-Puffer oder H 2 O. gemischt In der Regel 5-10 ng / ul des Reportergens ist ausreichend, um injizierten Zellen Etikett, und die gesamte Konzentration der cDNA injiziert werden sollte nicht mehr als 200 ng / ul seit DNA ist zähflüssig in hohen Konzentrationen und kann die Injektion Pipetten verstopfen. Ein kleines Volumen der cDNA für die Injektion (5-10 ul) wird durch Mischen von Tropfen der Lösung auf der sauberen Oberfläche ein kleines Stück Parafilm (Seite unter dem Papierträger) vorbereitet. Mischen Sie die Tropfen der Lösung zusammen durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals mit einem pipetor und vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen beim Mischen. </li><li> Mit einem Microloader Pipettenspitze (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), übertragen Sie die cDNA-Lösung, um eine speziell vorbereitete Hämatokrit Rohr (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Siehe Materialien Abschnitt Anweisungen zur Vorbereitung Hämatokritröhrchen (Werkstoff-Tabelle). Setzen Sie den Hämatokrit Rohr mit dem cDNA-Injektionslösung in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 15-30 min bei 10 000 g in einer Mikrozentrifuge mit einem festen Winkel oder Ausschwingrotor (Eppendorf) ausgestattet, bei Raumtemperatur (20-24 ° C), um Schmutzpartikel in der cDNA-Lösung, kann der Block Mikroinjektion Pipette. Die cDNA-Injektionslösung kann bei Raumtemperatur während der Injektion Sitzung gehalten werden. </li></ol> B. Herstellung der Injektion Pipetten <ol><li> Einweg-Glas-Mikroinjektion Pipetten sind im Handel erhältlich (z. B. Femtotips, Eppendorf), die praktisch, aber teuer ($ 10 pro Mikroinjektion Pipette). Injection Pipetten können im Labor unter Verwendung eines programmierbaren P-97 Flaming Brown pipet Puller (Sutter Instrument Company, Novato, CA) und filamented, dünnwandige Borosilikatglas Kapillaren (World Precision Instruments, Sarasota, FL) hergestellt werden. Diese Option ist kostengünstiger und ermöglicht die Steuerung der Mikroinjektion pipet Form und Größe. </li><li> Ein Zwei-Stufen-Programm wird verwendet, um schmale Mikroinjektion Pipettenspitzen zu ziehen. Seit der Eröffnung der Mikroinjektion Pipetten ist zu schmal, um unter einem Lichtmikroskop untersucht, die Qualität der Injektion Pipetten direkt durch die Injektion von ein paar Zellen, bevor das Programm die Einstellungen abgeschlossen sind ausgewertet werden. Die folgenden sind ungefähre Einstellungen für Wärme, ziehen, Geschwindigkeit und Zeit-Einstellungen: (Pull-1) 600, 115, 15, 250; (Pull-2) 640, 130, 65, 200. Diese Einstellungen variieren mit unterschiedlichen Chargen von Glas und von der Beschaffenheit der Heizfaden in der Abzieher und sollte nach Bedarf eingestellt werden. Weitere Details finden Sie 5. </li><li> Ziehen Sie mehrere (2-5) Injektion Pipetten pro Schale von Neuronen, die injiziert, im Falle der Beschädigung oder Probleme während der Injektion Sitzung. Shop Injektion Pipetten in einem abgedeckten Behälter für das Eindringen von Staub Mikroinjektion Pipettenspitze zu verhindern. </li></ol> II. Intranukleäre Mikroinjektion Zelt &quot;&gt; Dieser Abschnitt erläutert die Verfahren der Injektion von cDNA in den Zellkern von Neuronen. Eine grundlegende Mikroinjektion Set-up umfasst eine umgekehrte Phasen-Kontrast-Mikroskop (zB Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY), um den Prozess zu visualisieren, Mikromanipulator (z. B. Eppendorf 5171), um die Bewegung der Injektion Pipette und einem Injektor (zB Eppendorf FemtoJet Express) Kontrolle der cDNA-Lösung aus der Pipette zu vertreiben. Anschließen der Injektor den Mikromanipulator erlaubt die Synchronisation der beiden letztgenannten Prozesse während der Injektionen. Andere optional, aber dringend empfohlen, gehören Komponenten montierten Video-Überwachungssystem (CCD-Kamera, Cohu Inc., San Diego, CA; Schwarz-Weiß-Video-Monitor, Sony Corporation, Tokio, Japan). Dieses System ist nicht eine absolute Voraussetzung für Injektionszwecke; bietet aber die schwarzen und weißen Monitor mit hohem Kontrast für bessere Visualisierung des Zellkerns und bietet eine komfortablere Seherlebnis bei langen Injektion Sitzungen. Darüber hinaus, ein Laptop-Computer-Software, um eine Hand-held-Controller zu betreiben, um semi-eingesetzt werden können Automatisierung der Einspritzung (siehe Diskussion für weitere Details). Die ideale Zeit für SCG Neuronen injiziert wird 3-6 Stunden nach der Dissoziation. In diesem Stadium werden die Zellen kugelig, dicht an der Unterseite der Schale befestigt, und der Kern ist deutlich sichtbar, unter einem Phasen-Kontrast-Mikroskop, als eine zentrale runde Organelle mit einem dunklen Membran, die ein einzelnes oder mehrere Nukleolen (Abb. 1A). <ol><li> Legen Sie eine Schüssel mit dissoziierten Neuronen in der Mitte des Mikroskoptisches. Stellen Sie den Fokus und Optimierung der Phasenkontrast-Optik des Mikroskops so den Kernen der Nervenzellen deutlich sichtbar sind. </li><li> Pipet 2 ul vorbereitet cDNA-Lösung in eine Mikroinjektion Pipette mit einem Microloader Pipettenspitze. Vermeiden Sie die Erstellung Lösung in der Nähe der Unterseite des Hämatokrit Rohr, da dies zu schüren Partikel, die während der Zentrifugation angesiedelt. Der Faden in der Mikroinjektion Pipetten sollten bei der Erstellung Lösung für die Spitze Hilfe, aber wenn kleine Luftblasen bestehen, sanft Flick die Seite des Glases, um sie zu vertreiben. </li><li> Legen Sie die Mikroinjektion Pipette in die Kapillare Inhaber der Injektor und sichern Sie die Halterung an der Mikromanipulator. Der Halter ist in einem 45 ° Winkel fixiert. </li><li> Senken Sie die Mikroinjektion Pipette in die Schüssel. Wie der Pipette in die Nährlösung, ist ein Meniskus gebildet, wirkt sich auf die Brechung des Lichts und senkt die Bildqualität der Neuronen. Um dieses Problem zu beheben, kann die Phase Ring Revolver leicht versetzt werden, bis die Kerne von Neuronen deutlich wieder sichtbar werden. </li><li> Einige Einspritzsysteme haben eine &quot;saubere&quot;-Funktion, die maximale Luftdruck von der Mikroinjektion Pipettenspitze für eine kurze Dauer gilt. Verwenden Sie diese Funktion, um die Pipette von Schutt vor Beginn und während der Injektion, wenn die Spitze scheint verstopft zu löschen. Wenn ausgeräumt Flüssigkeit ist nicht auf dem Bildschirm sichtbar, wenn Sie diese Funktion mit einer neuen Injektion Pipette ersetzen. </li><li> Zentrum der Mikroinjektion Pipette in die Betrachtung überwachen und richten Sie die Spitze neben einem Neuron und in der gleichen Bildebene als Nukleolus. Setzen Sie diese Position als die untere z-Achse Begrenzung der Mikromanipulator. Diese Position ist die Tiefe der Mikroinjektion Pipette während Injektionen voraus. Positionieren Sie nun die Spitze etwa 30 um über diesen Punkt, so dass die Mikroinjektion pipet löscht die Spitze der Neuronen. </li><li> Die &quot;injizieren&quot; Modus einer Eppendorf 5171 Mikromanipulator kann mit den folgenden Einstellungen definiert werden, um intranukleären Injektionen durchführen. Die Injektion Funktion aktiviert ist, während die aufspießen Funktion links ist. Eine diagonale Injektion Weg (entlang der x-und z-Achse) ergibt den geringsten Zellschäden und damit die axiale Modus sollte für Injektionen verwendet werden. Eine Injektion von 300 mu m / s ist ausreichend, und synchronisieren Druckaufbau, wenn die Mikroinjektion pipet Erreichen des eingestellten z-Achse zu beschränken. </li><li> Der Injektor steuert die Menge des cDNA-Lösung in den Zellkern gespritzt. In der &quot;automatischen&quot; injection-Modus wird die Abgabe von DNA zeit-und initiiert durch die angeschlossene Mikromanipulator. Der Einspritzdruck (Pi) sollte zwischen 100 bis 200 Hektopascal (; 1 hPa ~ 0,015 psi hPa); gesetzt werden höhere Einspritzdrücke nicht verbessern Erfolgsquoten oder Qualität der Injektionen und andere Probleme mit der Mikroinjektion Pipettenspitze Größe oder DNA-Reinheit zeigen . Ein Einspritzdauer (ti) von 0,3 s und eine Entschädigung Druck (Pc) von 30 hPa, die einen konstanten positiven Druck auf die Eingabe von verschließenden Partikel aus dem Kulturmedium in die Pipettenspitze zu vermeiden liefert, verwendet werden sollte. </li><li> Position des Neurons unter der Spitze der Mikroinjektion Pipette unter dem Mikroskop die xy-Achse Bühne Kontrolle injiziert werden. Richten Sie die Spitze der Pipette über der Mitte des Kerns durch die Konzentration hin und her zwischen ter Spitze und der Nucleoli. </li><li> Inject den Zellkern durch Drücken der Taste spritzen (am Mikromanipulator). Für die Injektion Schritt werden die Bewegungen der Mikroinjektion Pipette und die Freisetzung von cDNA-Lösung durch den Mikromanipulator gesteuert. Es ist schwierig, erfolgreiche intranukleären Injektionen mit bloßem Auge zu bestätigen, sondern die Injektion der relativ niedrige Viskosität cDNA-Lösung (im Vergleich zu den viskosen nuklearen Umwelt), erscheint oft als ein weißer Fahne unter Phasen-Kontrast-Optik und kann als Indikator für die Injektion verwendet werden in den Zellkern. Manchmal ist die Mikroinjektion Pipette dringt nicht in die Kernmembran und einfach stupst den Zellkern. Eine zweite Injektion Versuch an der gleichen Stelle kann auf eine erfolgreiche Injektion von DNA in den Zellkern führen. Schwellung der Zelle ist in der Regel Anzeichen für unbeabsichtigte zytoplasmatische Injektion. Auch ist von Bedeutung nuklearer Schwellung nicht gut von Neuronen und führt in der Regel den Zelltod bald darauf geduldet; damit der Einspritzdruck und die Dauer nicht überschreiten sollte die vorgeschlagenen Werte. </li><li> Weiter Injektion Neuronen durch Neupositionierung des Mikroskoptisches zum nächsten Neuron unter der Mikroinjektion pipet auszurichten. Systematisch durch das Gericht zu navigieren, um ca. 50-100 Kernen vor der Rückkehr der Schale von Neuronen in den Inkubator für Inkubation über Nacht zu injizieren. Erfolgreich injiziert Neuronen identifiziert den folgenden Tag durch die Expression des Reportergens werden. </li></ol> III. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Ganglion cervicale superius (SCG) Neuronen. Phasenkontrast-Bild der SCG Neuronen 3 Stunden nach der Dissoziation (A). In diesem Stadium ist der Kern deutlich sichtbar, welche Hilfsmittel Ausrichtung der Mikroinjektion Pipettenspitze. Der Kern erscheint in der Mitte von Neuronen mit einem einzigen (links) oder mehrere (rechts) dunkel Nucleoli. SCG Neuronen 16 Stunden nach der Injektion von EGFP cDNA in den Zellkern (B). Left, SCG Neuronen unter Phasenkontrast-Beleuchtung betrachtet. Richtig, epifluoreszenten Bild der gleichen Neuronen zeigen erfolgreiche Injektion und die daraus resultierenden EGFP-Expression in einem Neuron. Weiß Maßstab ist 20 um. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" border="0" /> Abbildung 2: Whole-cell-Aufnahmen von Strömen durch heterolog exprimiert G-Protein-gekoppelte einwärts gleichrichtende K + (GIRK) Kanäle von SCG Neuronen. GIRK Ströme (I GIRK) wurden von einer 200 ms Spannungsrampe von -140 bis +40 mV aus einem Betrieb von -60 mV (Einschub A) nach der Aktivierung des endogenen α 2-Adrenozeptoren durch Noradrenalin (NE, 10 uM) hervorgerufen . Überlagerte Spuren sind Aufnahmen aus dem gleichen Neuron und geben vor (schwarz) und nach Anwendung entweder NE allein (blau) oder NE plus 10 mM Ba 2 + (rot). Die gestrichelten Linien zeigen den stromlosen Ebene. Für die Aufnahme von I GIRK, die externe Lösung enthielt (in mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 Glukose, 15 Saccharose, und 0,0003 TTX, eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH. Die interne Aufzeichnung enthielt (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP und 0,3 Na 2 GTP, eingestellt auf pH 7,2 mit KOH. Der Mangel an aktuellen, hervorgerufen durch die Spannung Rampe in Gegenwart von NE in injizierten SCG Neuronen (A) zeigt, dass SCG Neuronen exprimieren keine endogene GIRK Kanäle. Erfolgreiche Injektion von Plasmid-cDNA ein funktionelles GIRK Kanal 11 gibt Anlass zu großer Ströme während der Spannungsrampe wann NE (B, links) ausgesetzt. Strömungen sind die typischen Merkmale der Ströme durch GIRK Kanäle: Aktivierung durch ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonist (NE), nach innen Berichtigung, und Block von Strömen durch die vermeintliche GIRK-Kanal-Blocker, Ba 2 + (B, rechts rote Kurve). Offene und gefüllte Kreise vertrete ich im Betrieb und Spitzenstrom GIRK jeweils. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

Gemeinsame Probleme und Anregungen: Wie bereits erwähnt, erfolgreiche nukleare Injektionen abhängig, die Zellen adhärent Zellkulturplatten. Verschiebung des Beginns der Injektionen ein paar Stunden nach der Zelle Dissoziation Verfahren ermöglicht Neuronen auf den Grund der Gerichte zu halten. Darüber hinaus Beschichtung Gerichte mit 0,1 mg / ml mit hohem Molekulargewicht Poly-L-Lysin (Sigma, St. Louis, MO) aids Haftung von Neuronen an der Bodenfläche der Gerichte. Blockierung der Mikroinjektion Pipetten, vor allem wenn man versucht, eine hohe Konzentration von DNA injiziert, kann ein häufiges Problem sein. Die Verwendung hochwertiger Trennsäulen zu isolieren und zu reinigen Plasmid-DNA, und die Durchführung der zusätzlichen Reinigungsschritten erwähnt (Spin-Filter, Spinnen in Hämatokritröhrchen) kann helfen, um Partikel vor der Injektion zu entfernen. Während Injektionen, die &quot;clean&quot; Funktion des Drucks Injektor (für 0,2 s ist ausreichend) sein, aber wenn das nicht das Problem weiterhin besteht, eine neue Injektion Pipette verwendet werden. Wenn die Mehrheit der Mikroinjektion Pipetten bei einer Injektion Sitzung verstopft werden, sollten Sie verändern die Einstellungen des Glaspipette puller zu Mikroinjektion Pipettenspitzen mit einer größeren Öffnung zu erzeugen. Ein weiteres Problem, dass während der nuklearen Injektionen stellt sich den Unebenheiten der Bodenoberfläche Gewebekulturschalen. Diese Variabilität wirkt sich direkt auf die Zielgenauigkeit der Injektion Pipettenspitzen in den Zellkern, da die Tiefe der Pipette durchläuft während der Injektion fixiert ist. Daher muss dieser z-Achse begrenzen im Laufe der Injektionen innerhalb der gleichen Schale eingestellt werden. Es wird deutlich, wenn eine Anpassung notwendig ist: Es wird kein Hinweis auf nukleare Injektion (keine weißen Fahne in den Zellkern oder die Zelle ist völlig verfehlt) werden, oder die Injektion Pipettenspitze in die Nähe des Boden der Schale (Komprimieren der Zelle oder gar Abstürzen der Pipettenspitze in die Unterseite der Schale). Glass-Klonzylinder (. OD 10 mm, Kat. Nr. 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, New Jersey) können während der Beschichtung von Neuronen verwendet werden, um sie in einem kleineren, begrenzten Bereich beschränken, daher die Minimierung der erforderlichen Abstand zu bewegen die Injektion Pipette zwischen den Injektionen. Diese Klonzylinder sind vor der Durchführung microinjections entfernt. Nachteile der Technik: Intranukleäre microinjections sind technisch anspruchsvoll, das erfordert Geduld und ein hohes Maß an manueller Geschicklichkeit durch den Betreiber. Kenntnisse im Umgang mit dieser Technik, wie bei jeder anderen Fähigkeit, kommt mit der Praxis. So ist es ratsam, nukleare Injektionen des Reportergens alleine üben, bevor eigentlichen Experimente. Zur weiteren Unterstützung der Einspritzvorgang, kann es möglich sein, die Schritte der Mikromanipulator und Injektor in ein Computerprogramm zu konsolidieren. Programme wie Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) können genutzt werden, um die Mikroinjektion Einstellungen zu speichern und zu multifunktionalen Controller (ShuttlePro, Contour Design, Windham, NH), um semi-automatisiert den Einspritzvorgang Programm (siehe 6,7,8 für weitere Details). Ein weiterer Nachteil der intranukleären Mikroinjektionstechnik ist die geringe Erfolgsquote. Etwa 10-20% der versuchten nuklearen Injektionen führen zu Proteinexpression. Während dieser Effizienz kann ausreichend sein, für Anwendungen, die keine eine große Anzahl von exprimierenden Zellen, Elektrophysiologie zum Beispiel für verschiedene biochemische Assays kann dies nicht ausreichend sein. Anwendungen der Technik: Trotz seiner Nachteile ist intranukleären Mikroinjektion von DNA eine äußerst nützliche Technik für heterolog Expression von Proteinen in Nervenzellen. Hohe Konzentrationen von Protein-Expression mit nuklearen microinjections wegen der großen Zahl von Plasmiden in den Zellkern während der Injektionen, eine höchst aktive CMV-Promotor Regulation der Gentranskription und lange Stabilität von Plasmiden in den Zellkern freigesetzt erreicht. Protein-Überexpression ist besonders nützlich in dominant-negative Experimente, bei denen ein hohes Maß an heterologen Proteinen benötigt, um das endogene Protein zu überwältigen sind. Ein weiterer Vorteil der intranukleären Injektionen ist die Fähigkeit, ein konsistentes Anteil der cDNA-Konstrukte in den Zellkern zu liefern, wenn mehrere Konstrukte injiziert werden. Mit anderen Transfektionsmethoden, ist es schwierig, reproduzierbar einführen derselbe Anteil der einzelnen DNA-Konstrukt in verschiedene Zellen innerhalb des gleichen Teller und zwischen Transfektionen. Direkte Injektion von cDNA-Lösung in den Zellkern beseitigt diese Quelle der Variabilität und erlaubt das Verhältnis der exprimierten Proteine ​​effektiv titriert werden. Traditionelle Methoden der Transfektion nur begrenzt wirksam post-mitotischen Zellen wegen der geringen Aufnahme von DNA in den Zellkern 9 und chemischen Toxizität mit der Transfektion Reag verbundenEltern 10. Nuclear microinjections Überwindung dieser Probleme durch die Einführung von genetischem Material mechanisch in den Zellkern. Obwohl diese Technik ist komplizierter, die Fähigkeit, die Wirkung eines Proteins in einer funktionellen biologischen System zu studieren, mit endogenen Signalwege komplette, mehr als entschädigt für die mühsame Natur dieser Technik. Alle Experimente an Tieren wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guidelines for Animal Care und Nutzung durchgeführt.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

Primäre neuronale Zellkulturen sind wertvolle Werkzeuge, um Protein-Funktion zu untersuchen, da sie eine biologisch relevanten System im Vergleich zu immortalisierten Zelllinien zu vertreten. Allerdings verhindert die post-mitotischen Natur der primären Neuronen effektiv heterologen Proteinexpression mit gängigen Verfahren wie Elektroporation oder chemisch-vermittelte Transfektion. Daher müssen andere Techniken eingesetzt werden, um effektiv zum Ausdruck Proteine ​​in diesen nicht-teilenden Zellen. In diesem Artikel beschreiben wir die notwendigen Schritte zur intranukleären Injektionen von cDNA-Konstrukten in dissoziierten Erwachsenen sympathischen Neuronen durchzuführen. Diese Technik, die auf verschiedene Arten von Neuronen angewendet worden ist, kann erfolgreich induzieren heterologen Proteinexpression. Die erforderlichen Anlagen für die Mikroinjektion umfasst auch eine inverse Mikroskop auf Zellen, einer Glas-Pipette mit cDNA-Lösung, die zu einer N 2 (g) Druck Lieferzeiten verbunden ist gefüllt, und einem Mikromanipulator zu visualisieren. Der Mikromanipulator koordiniert die Injektion Bewegung Mikroinjektion Pipette mit einem kurzen Puls von unter Druck N 2 bis cDNA-Lösung aus der Pipettenspitze auszuwerfen. Diese Technik hat nicht die Toxizität mit vielen anderen Transfektion Methoden verbunden und erlaubt es, mehrere DNA-Konstrukte, um eine konsistente Verhältnis ausgedrückt werden. Die geringe Zahl der injizierten Zellen ist die Mikroinjektion Verfahren auch für die einzelne Zelle Studien wie elektrophysiologischen Ableitungen und optische Bildgebung geeignet, aber nicht ideal für biochemische Assays, die eine größere Anzahl von Zellen und höhere Transfektionseffizienz zu verlangen. Obwohl intranukleären microinjections eine Investition von Ausrüstung und Zeit erfordern, macht die Fähigkeit, ein hohes Maß an heterologen Proteinexpression in einem physiologisch relevanten Umfeld zu erreichen diese Technik ein sehr nützliches Werkzeug, um Protein-Funktion zu untersuchen.

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Direkte intranukleären Injektion von cDNA ist eine effektive Transfektion Technik zur post-mitotischen Zellen. Diese Methode bietet ein hohes Maß an heterologen Proteinexpression von einzelnen oder mehreren cDNA-Konstrukte und ermöglicht Protein-Funktion, um in einem physiologisch relevanten Umfeld mit einer Vielzahl von Einzel-Zell-Assays untersucht werden.

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Aufrufe.  National Institutes of Health (NIH). Direkte intranukleären Injektion von cDNA ist eine effektive Transfektion Technik zur post-mitotischen Zellen. Diese Methode bietet ein hohes Maß an heterologen Proteinexpression von einzelnen oder mehreren cDNA-Konstrukte und ermöglicht Protein-Funktion, um in einem physiologisch relevanten Umfeld mit einer Vielzahl von Einzel-Zell-Assays untersucht werden.

Serie: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Forschung

Biologie

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.