Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health Grants R01 EB-008836 und R01 HL083895 finanziert (beide LEN). Wir könnten gerne Daryl Smith, der Universität Glasbläser, für die Herstellung der Bioreaktoren für unsere Forschung zu danken.

Autoclave Montieren und Autoklaven den Schlauch für die Flow-System und Bioreaktor Komponenten (Bioreaktor selbst und die Silikonstopfen Deckel), wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 angewiesen. Einfüllöffnung hat einen Stecker an einem Ende und einem offenen Ende auf der anderen Seite. Drei kurze Schläuche Segmente sind durch eine Silikonkappe für den Gasaustausch eingefügt. 1. Sewing PGA Mesh- <ol><li> Cut PGA Mesh 1.1cm x ~ 8cm Blatt (abhängig von Bioreaktor-Größe). </li><li> Saubere Silikonschlauch (3mm Innendurchmesser) mit destilliertem Wasser (20 Dh) und an der Luft trocknen, bevor Gebrauch. </li><li> Verwenden Sie Dexon 6,0 Naht zu PGA Mesh um den sauberen Silikonschlauch beginnend mit drei chirurgische Knoten durch einzelne Stiche folgten nähen. </li></ol> 2. PGA Gerüste Oberflächentechnik <ol><li> Dip PGA Gerüste in 1M NaOH für 1-2min und notieren Sie die Behandlungszeit und die gleichzeitig für alle PGA Gerüsten. </li><li> Spülen PGA Gerüste in dH2O Bäder für 2 Minuten 3 mal. </li><li> Pat PGA Gerüste trocken mit Kimwipes zwischen jedem Eintauchen in dH 2 O Bäder. </li><li> Dry PGA Gerüste unter Gewebekultur Haube an der Luft für 15 Minuten mit Gebläse auf dem Trockenen. </li></ol> 3. Sewing Dacron Arme <ol><li> Verwenden Sie Prolene 4,0 Naht in kleine Stücke von Dacron Manschetten (1cm) an jedes Ende der PGA Mesh mit einer Überlappung von 2-3mm zu nähen. Hinweis: Achten Sie darauf, Punktion Silikonschlauch (Abbildung 3). </li><li> Verwenden Sie die gleiche Naht zu drei Stiche rund um das freie Ende des Dacron Manschetten nähen. Achten Sie darauf, genug Nähte an den freien Enden der Prolene Naht für Schritt 5,1 (Abbildung 3) zu verlassen. </li></ol> 4. Versammlung der Bioreaktor (Tag vor Beginn des Bioreaktors Kultur) <ol><li> Soak genäht Mesh und Silikonschlauch, chirurgische Instrumente und einen dünnen Draht in einer 70% igen Ethanol-Bad für 20-30 Minuten. </li><li> Öffnen des Autoklaven Beutel mit dem Bioreaktor und tauchen Sie es in 70% Ethanol-Bad für mindestens 30 Minuten vor der Montage. Achten Sie darauf, in den Bioreaktor gründlich mit Ethanol. Exposure aller Bioreaktor Komponenten zu 70% Ethanol ist eine Ergänzung der Sterilisation Schritt. Dieser Schritt entfernt auch Endotoxin, die nicht durch Autoklavieren entfernt und ist schädlich für den Gefäßzellen. </li><li> Pull Silikonschlauch durch Seitenarme mit dünnen Draht, um es durchzuziehen. </li><li> Nehmen Bioreaktor von Ethanol-Bad (keep Mesh in Ethanol getaucht). Fix der PGA Gerüst im Inneren des Bioreaktors durch Befestigung Dacron Manschetten über die ausgestellten Glas die Lippen durch das Anziehen und Verzurren der Prolene Naht (Abb. 3). </li><li> Schließen Sie eine Seite des Bioreaktors Seitenarme zu Anschlüssen via Silikonschlauch. </li><li> Ziehen Sie anderen Seite der Silikonschlauch mit genug Spannung und legen Sie die verbleibenden zwei Anschlüsse in Silikonschlauch. Halten Sie Silikonschlauch dicht beim Einlegen Anschlüsse! </li><li> Setzen Sie Bioreaktor in Ethanol-Bad und bündig mit Ethanol durch vorsichtiges Ziehen Stecker aus der Seitenarme. </li><li> Flip-Bioreaktor über und ermöglichen eine für 10 Minuten einweichen. </li><li> Flip-Bioreaktor rechten Seite nach oben und genießen für weitere 10 Minuten. </li><li> Lassen Sie alle Ethanol. </li><li> Richten Sie drei große Petrischalen (10 cm) in Serie und Platz Bioreaktor in der Mitte Gericht zu halten das überschüssige Ethanol tropfte von den Enden der Röhren. </li><li> Flush Bioreaktor und PGA Mesh mit Gewebekulturen Wasser mit einem 5ml oder 10ml Pipette. Auch bündig Gewebekultur Wasser in Silikonschlauch. </li><li> Gut abtropfen lassen alles überschüssige Wasser in Petrischalen auf beiden Seiten des Bioreaktors. </li><li> Dry Bioreaktor über Nacht in Kapuze mit Gebläse-und UV-OFF. </li><li> Zusätzliche Hinweise: Achten Sie darauf sterile Rührstab wird im Bioreaktor. Achten Sie darauf, nicht zu &quot;schweben&quot; über den Bioreaktor von diesem Punkt an, um Verunreinigungen zu vermeiden. Cut up viel Parafilm-Streifen und genießen sie in einem kleinen 70% Ethanol-Bad (große Petrischale gut funktioniert). </li></ol> 5. Tag 1: Bioreaktor-Setup <ol><li> Legen Sie eine sterile Petrischale über die Öffnung der einzelnen Bioreaktor zur PGA Gerüst im Inneren von Verunreinigungen zu schützen. </li><li> Montieren Sie Flow-System zum Bioreaktor, wie in Abbildung 4 und Parafilm alle Anschlussfugen angegeben. <ol><li> Wipe-Anschlüsse zunächst mit Alkohol wischt. </li><li> Bringen Sie Injektionsport an Dritte, unbenutzt Arm des Bioreaktors. </li><li> Entfernen Walross Schläuche und binden Sie das blaue Ende des Kochsalzlösung verdünnt so nah an Y-Kreuzung wie möglich einzustellen. Pull Schlauchklemme in Ort, um keine Flüssigkeit zu übertragen, um diesen Teil des Rohres gewährleistet </li><li> Entfernen IV Tasche, und legen Walross-Schlauch (rot) bis weit Ende der IV-Beutel. Vergewissern Sie sich, um das Einführen Port mit Alkoholtupfer abwischen zuerst. </li><li> Bringen Sie Walross auf einer Seite des Flow-System (via weißen Ende Rohr). </li><li> Legen Sie 3-Wege-Hahn in Flow-System. </li><li> Entfernen Druckaufnehmer &amp; connect zum Dreiwegehahn. </li><li> Bringen Sie anderen Ende der Druckaufnehmer mittlere Öffnung in der Tasche. </li></ol></li><li> VerbindenBioreaktor, um den Fluss über das Y-Kreuzung. Verwenden Sie eine 60ml Spritze mit 350ml von 1% Fungizone (mix 5ml Fungizone mit 495ml PBS) bis IV Tasche hinzuzufügen. </li><li> Squeeze IV Tasche, um die fließenden System durch Anpassung der Hähne zu fließen von PBS ermöglichen Flush. Hinweis: Prüfen Sie im Bioreaktor zu gewährleisten, gibt es keine undicht. </li><li> Re-suspend 8 x10 6 SMCs (etwa ein konfluenten T75) in 1,25 ml des Mediums und Samen auf jedes PGA scafffold. Stellen Sie sicher, Zellsuspension wurde gleichmäßig tropfte auf den PGA Mesh-Dacron Kreuzung als auch auf der unteren Seite der PGA Mesh. </li><li> Wischen Rand des Bioreaktors mit Alkohol über rotierende Bioreaktor seitwärts vermeiden schweben zu wischen. </li><li> Silikon-Stopfen Deckel Montage (Abbildung 2) <ol><li> Peel Autoklavierbeutel wieder sorgfältig, um sicher nicht nach unten Deckel freizulegen. </li><li> Bringen Sie Injektionsport zu Magensonde am Stecker. </li><li> Bringen Sie PTFE 0,20 um Filter zu jedem der drei Luft-Anschlüsse. </li><li> Achten Sie darauf, nicht zu entlarven / touch unteren Deckel während dieses Prozesses. </li><li> Parafilm der Einspritzöffnung. </li></ol></li><li> Legen Sie die Silikonstopfen Deckel in Glas-Bioreaktor und stellen Sie sicher, dass die Magensonde im Inneren des Bioreaktors nicht berührt ausgesät PGA Gerüsten. Parafilm um den Deckel. </li><li> Legen Sie Bioreaktor mit dem Flow-System innerhalb des Inkubators (auf der Seite), und drehen Sie den Bioreaktor alle 5 Minuten für 25-30 Minuten. </li><li> Füllen Sie den Bioreaktor Kammer mit 400ml unserer 4-10 Kulturmedien wie beschrieben (Tabelle 1). Das Kulturmedium wird &quot;optimiert&quot; für Schweine entwickelt Arterien. </li></ol> 6. Tag 6-7: Einschalten der Pumpe, und die ersten Fütterung <ol><li> Wachsen die Samen Gerüste statisch ohne pulsatile Pumpen durch den Silikonschlauch für 6-7 Tage. Es besteht keine Notwendigkeit für mittlere ändern oder Vitamin-C-Supplementation während dieser Zeit. </li><li> Achten Sie darauf, keine Lecks vorhanden sind von PBS oder Knicken der Flow-System Schlauch vor dem Einschalten der Pumpe. </li><li> Schalten Sie die Pumpe des Flow-System und stellen Sie sicher, Einstellung der Pumpe so einstellen, dass der Druck etwa 270/-30mmHg liest. </li><li> Rekord Druck täglich während der Kultur und halten den Druck auf 270/-30mmHg. Druckmessumformer kann mit einem Computer zu lesen und zu überwachen den Druck angeschlossen werden. </li></ol> Erste Fütterung <ol start="5"><li> Montieren Injektionsport &amp; PTFE-Filter auf Futterdeckel sowohl für mittlere Veränderung und mittlere Abfall Absetzung Zwecke. </li><li> Legen Sie die Magensonde fest auf die Pumpe und stecken Sie das eine Ende der Fütterung Port des Bioreaktors und das andere Ende an die Fütterung Deckel. Achten Sie darauf, die Einspritzöffnungen mit Ethanol Tücher zu wischen. </li><li> Verwenden Sie einen bidirektionalen Masterflex-Pumpe zu Pumpe aus 200 ml Medium. Dann verwenden Sie eine neue Magensonde zu 200 ml frischem Medium zurück Pumpe in den Bioreaktor. Immer mit einer sehr langsamen Geschwindigkeit zu starten, besonders wenn Fördermedium zurück in den Bioreaktor. </li><li> Ändern Sie mittel-und Ergänzung Ascorbinsäure 2x/Woche. Um Ascorbinsäure, verwenden Sie eine 30ml Spritze nehmen Sie 25ml des Mediums und legen Sie es beiseite in das Gewebe Kapuze. Lösen Sie 25 mg Ascorbinsäure in 5 ml PBS und filtern es durch ein 0,22 um-Filter. Zunächst injizieren die sterile Ascorbinsäure in die Magensonde und fügen wieder die 25ml Medium aus früheren übernommen. Das Medium Rezept ist in Tabelle 1 angegeben. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die Schläuche und Anschlüsse für die Flow-System Montage ist oben abgebildet. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Die Silikon-Stopfen Deckel Montage ist oben abgebildet. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Schematische Darstellung Bioreaktor Montage sind oben gezeigt. Im Bioreaktor Dacron Manschetten auf das Glas Arme mit dem blauen Faden Knoten befestigt sind. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Flow-System angeschlossenen Schläuchen und Bioreaktor ist oben gezeigt. L/S18 Schlauch durch eine Masterflex Pumpe gepumpt werden und damit Motor für die Strömung. Der Drucksensor wird der Druck vor dem Eintritt in den Bioreaktor am oberen Strom zu messen. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Image of geerntet entwickelt Schiff. Engineered Schiffe erscheinen undurchsichtig sein und erreichen eine Wandstärke von ca. 250μm nach 8-Wochen-Kultur unter pulsatilen Bedingungen. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Hämatoxylin und Eosin gefärbten Querschnitten konstruiert Gefäßen. A und B sind 8-wöchigen ungepulsten und gepulste Lymphgefäße.C und D sind 4-Wochen-ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. L zeigt der luminalen Seite der Gefäße. Die Skalen bar ist 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Abbildung 7"/> Abbildung 7. Masson Flecken für Kollagen (blau) für Querschnitte von technischen Schiffe. A und B sind 8-wöchigen ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. C und D sind 4-Wochen-ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. Beachten Sie, dass der 4-wöchigen gepulsten Schiff mehr Kollagen als die nicht-gepulsten Gegenstück zeigt. Weiße Pfeile zeigen auf verbleibende PGA-Fragmente in den Gefäßen. Die Skalen bar ist 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Abbildung 8"/> Abbildung 8. Immunochemistry Färbung von SMC Markern bei Rindern entwickelt Arterien. Glatte Muskelzellen α-Aktin, Calponin-1 und der glatten Muskulatur Myosin heavy chain (SMMHC) sind frühe, mittlere und späte SMC kontraktilen Marker jeweils. Bis zum Ende des 12-Wochen-Kultur, die Zellen in der Gefäßwand ausdrücken SM α-Aktin und moderate Mengen an Calponin-1 und SMMHC. Die Waage-Bar ist 20 um. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Betrag </td></tr><tr><td> DMEM (DME / low modifiziert) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (fötales Rinderserum) hitzeinaktiviertem </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1,0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> Vitamin C (gelöst in PBS oder DMEM) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glycin / Alanin 25 mg/25 mg/10 mg (gelöst in 5 ml PBS) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1,5 pg (gelöst in1 ml PBS) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> Penicillin G auf 10.000 Einheiten / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB) bei 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor) bei 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Komponenten von &quot;4-10&quot; Medium sind in der obigen Tabelle dargestellt. Mit Ausnahme von PDGF-BB und bFGF, sind alle anderen Komponenten durch eine 0,2 um-Filter vor dem Gebrauch gefiltert werden.

<ol>
	<li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis.">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li><li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion.">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li><li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+porcine+arteries:+Effects+of+scaffold+modification.">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li><li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts.">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li><li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries.">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li><li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valent&#237;n, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors,+Intravital+Imaging,+and+Biomechanical+Modeling.">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li><li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li><li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs.">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+engineered+from+human+cells.">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li><li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).</li></ol>

Die Qualität der entwickelten Schiffe ist zu einem großen Teil von der Qualität der SMCs in Gewebekultur verwendet diktiert. Die kritischen Aspekte der SMC Phänotyp gehören kontraktilen Morphologie, niedrigen Durchgang Nummer, und die Fähigkeit, im Inneren des Bioreaktors vermehren. Wir empfehlen, dass die Passage Zahl nicht größer als P3 werden zum Zeitpunkt der Zellaussaat auf die Polymer-Gerüst. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, um zu bestätigen, dass die SMC Quellen Mykoplasmen frei vor ...

<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<th>Name of Reagent/Material</th>
 <th>Supplier</th>
 <th>Catalogue Number</th>
 </tr>
 <tr>
 	<td>FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated </td>
 <td>HyClone</td>
 <td>SH30071</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>DMEM</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>11885</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>rhFGF-basic</td>
 <td>R&amp;B</td>
 <td>234-FSE</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>rrPDGF-BB</td>
 <td>R&amp;B</td>
 <td>520-BB</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Penicilin G</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>PENNA</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Copper(II) Sulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8027</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Gylcine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8790</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>L-Alanine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7469-25G</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>L-Proline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P5607-25G</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Ascorbic Acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A4544-25G</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>HEPES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H3375-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Silicone Stopper</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>06298-24</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Masterflex tubes L/S</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>06508-16, 06508-18</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Masterflex pump</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>7553-80</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Dacron cuff</td>
 <td>Maquet</td>
 <td>174406</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>PGA felt</td>
 <td>Concordia</td>
 <td>MO000877-01</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>4-0 1.5 metric Surgipro II suture</td>
 <td>Syneture</td>
 <td>VP-557-X</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>6-0 0.7 metric Dexon suture</td>
 <td>Syneture</td>
 <td>7538-11</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>0.22&mu;m PTFE filters</td>
 <td>Whatman</td>
 <td>6780-2502</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Three Way Stop-cock</td>
 <td>Edwards Lifesciences</td>
 <td>593WSC</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Pressure Transducer</td>
 <td>Edwards Lifesciences</td>
 <td>PX212</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>IV bags</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>R4R2110</td>
 </tr>

 <tr>
 	<td>Saline dilution set</td>
 <td>Arrow</td>
 <td>W20030</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Silicone tubing</td>
 <td>Saint-Gobain</td>
 <td>F05027</td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

Viel Aufwand wurde dabei auf die Entwicklung und Fortschritt der Methodik zu regenerieren funktionale kleinem Durchmesser arterielle Bypässe. In der physiologischen Umgebung, sind sowohl mechanische als auch chemische Stimulation erforderlich, um die richtige Entwicklung und Funktionalität der arteriellen Gefäße 1,2 zu halten. Bioreaktor Kultur-Systeme von unserer Gruppe entwickelt wurden entwickelt, um Schiff Regeneration innerhalb einer genau kontrollierten chemo-mechanischen Umgebung nachahmen, die von einheimischen Schiffen zu unterstützen. Unsere Bioreaktor Montage-und Wartungsarbeiten sind recht einfach und hoch reproduzierbare 3,4. Glatte Muskelzellen (SMC) sind auf einem röhrenförmigen Polyglykolsäure (PGA) Netz, das über kompatible Silikonschlauch threaded ist und kultiviert in den Bioreaktor mit oder ohne pulsatile Stimulation für bis zu 12 Wochen geimpft. Es gibt vier Attribute, die unsere Bioreaktor von einigen Vorgängern unterscheiden. 1) Im Gegensatz zu anderen Kultur-Systemen, die nur simulieren die biochemische Umgebung von nativen Blutgefäßen, unsere Bioreaktor erzeugt auch eine physiologische pulsatile Umwelt durch die Anwendung zyklische radiale Belastung der Gefäße in der Kultur. 2) Mehrere technisch Schiffe können gleichzeitig unter verschiedenen mechanischen Bedingungen innerhalb einer kontrollierten chemischen Umgebung kultiviert werden. 3) Der Bioreaktor ermöglicht eine Mono-Schicht von Endothelzellen (EC), um einfach auf der luminalen Seite von Engineered Schiffe für die Tier-Implantation Modelle beschichtet werden. 4) Unsere Bioreaktor können auch Kultur entwickelt Schiffen mit unterschiedlichem Durchmesser Größe reichte von 1 mm bis 3 mm, wodurch der Aufwand für maßgeschneiderte einzelnen Bioreaktor zu einem bestimmten Durchmesser passen. Das konstruierte Schiffe in unserem Bioreaktor kultiviert ähneln nativen Blutgefäßen histologisch zu einem gewissen Grad. Zellen in der Gefäßwand ausdrücken reifen SMC kontraktilen Marker wie glatte Muskulatur Myosin heavy chain (SMMHC) 3. Eine erhebliche Menge an Kollagen in der extrazellulären Matrix, die für ultimative mechanische Festigkeit des konstruierten Schiffen 5 ist hinterlegt. Die biochemische Analyse zeigt auch, dass Kollagen-Gehalt von technischen Schiffe ist vergleichbar mit dem nativen Arterien 6. Wichtig ist, dass die pulsatile Bioreaktor konsequent Schiffe, die mechanischen Eigenschaften, die erfolgreiche Implantation Experimente erlauben in Tiermodellen 3,7 aufweisen regeneriert. Darüber hinaus kann dieses Bioreaktors weiter modifiziert werden, um Echtzeit-Beurteilung und Verfolgung von Kollagen Remodeling im Laufe der Zeit, nicht-invasiv mit Hilfe eines nicht-linearen optischen Mikroskopie (NLOM) 8 zu ermöglichen. Zum Abschluss sollte diese Bioreaktor als eine hervorragende Plattform, um die grundlegenden Mechanismen, die die Regeneration von funktionellen kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regulieren Studie dienen.

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Unsere Gruppe hat einen Bioreaktor Kultur-System, das die physiologische pulsatile Belastungen des Herz-Kreislauf-System, um implantierbare kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regenerieren imitiert entwickelt.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.9K Aufrufe.  Yale University. Unsere Gruppe hat einen Bioreaktor Kultur-System, das die physiologische pulsatile Belastungen des Herz-Kreislauf-System, um implantierbare kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regenerieren imitiert entwickelt.

Serie: Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Forschung

Biotechnik

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Betrieb einer Tischbioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Konstruktion und Charakterisierung eines neuartigen Bioreaktor Stimmlippen

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

A Novel Bioreaktor für High Density Anbau von Diverse mikrobiellen Gemeinschaften

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.