Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, dass es eine etikettenfreie Bildgebungstechnik einführt, die in der Lage ist, kontrastreiche Bilder mit hohen Bildraten zu erfassen, die einfacher und billiger ist als andere Techniken wie DIC und Dark Field. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach zu implementieren ist und einfach zu bedienen ist. Es ist kostengünstig und kann leicht mit Fluoreszenzmikroskopen kombiniert werden.
Die Methode wurde zur Visualisierung einzelner Mikrotubuli entwickelt. Es hat das Potenzial, für die Visualisierung großer Proteinkomplexe und Nanopartikel verwendet zu werden. Die Hauptschwierigkeit ist die Aktivierungsenergie, die benötigt wird, um mit dem Filterwürfel zu basteln, um den halbsilbernen Spiegel hinzuzufügen.
Mein Rat an jemanden, der die Technik zum ersten Mal versucht, ist es einfach zu tun. Legen Sie zunächst einen 50/50-Spiegel mit einem geeigneten Filterwürfel in das Filterrad eines Fluoreszenzmikroskops ein. Behandeln Sie den Spiegel mit Sorgfalt, wie oft haben sie eine Anti-Reflexions-Codierung.
Wenden Sie sich an ein Objektiv mit hoher Vergrößerung, das auch eine hohe numerische Blende hat. Das hier gezeigte ist ein 100-faches Ölobjektiv mit einer numerischen Blende von 1,3. Als nächstes verwenden Sie eine Rasierklinge und ein Mikroskopschlitten als gerade Kante, um drei Millimeter breite Streifen aus Kunststoffparaffinfolie zu schneiden.
Legen Sie zwei der Kunststoff-Paraffin-Filmstreifen drei Millimeter voneinander entfernt auf einen sauberen 22 mal 22 Millimeter-Abdeckungsschlupf, und legen Sie dann einen 18 mal 18 Millimeter großen Deckstreifen auf die Streifen, um einen Kanal zu bilden. Übertragen Sie den Abdeckschlupf 10 bis 30 Sekunden lang auf einen Wärmeblock bei 100 Grad Celsius, damit der Paraffinfilm einen versiegelten Kanal bildet. Mit einer Pipette in 50 Mikrogramm pro Milliliter eines Anti-Rhodamine-Antikörpers durch Perfusion fließen und das Dia für 10 Minuten inkubieren.
Waschen Sie den Kanal nach der Inkubation fünfmal mit gefiltertem BRB80, dann fließen Sie in 1%Poloxamer 407 in den gefilterten BRB80, um die Oberfläche gegen unspezifische Bindung zu blockieren und den Schlitten 10 Minuten lang zu inkubieren. Waschen Sie den Kanal erneut fünfmal mit gefiltertem BRB80. Um zu verhindern, dass die Probe austrocknet, fügen Sie zwei Tröpfchen des gefilterten BRB80 an den Enden des Kanals hinzu und fügen Sie bei Bedarf mehr Puffer hinzu.
Legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe und schalten Sie die Epi-Beleuchtungslichtquelle ein. Konzentrieren Sie sich auf die Paraffin-Filmkante, um die Probenoberfläche zu finden, und verschieben Sie dann das Feld, um die Ansicht in die Mitte der Kammer festzulegen. Sie beobachten mehrere Oberflächen, wenn das Objektiv aufgrund der Rückreflektion des Lichts von der Optik innerhalb des optischen Pfades nach oben und unten bewegt wird.
Als nächstes zentrieren Sie die Feldmembran im Sichtfeld, indem Sie sie auf halbem Weg schließen und die Stellschrauben verwenden. Sobald die Membran richtig ausgerichtet ist, öffnen Sie sie erneut. Schieben Sie dann in die Bertrand-Linse, um die hintere Brennebene zu sehen, die auch als Ausgangspupille des Objektivs bekannt ist.
Schließen Sie die Blendenmembran über die Ränder des Austrittspupillen hinaus und verwenden Sie die Stellschrauben, um die Blendenmembran in Bezug auf die Austrittspupille zu zentrieren. Doppelprüfung durch Öffnen der Blendenmembran und Anpassung ihrer Kanten an die Kanten des Austrittspupillens. Legen Sie dann die Blende membranauf etwa zwei Drittel der numerischen Blende des Ziels fest.
Stellen Sie zunächst die Belichtungszeit der Kamera auf 10 Millisekunden ein, und stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass sie den Dynamikbereich der Kamera nahezu sättigen. Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um in 10 Mikroliter GMPCPP-stabilisierten Mikrotubuli in 0,22 Mikrometer gefilterten BRB80 zu fließen. Überwachen Sie die Mikrotubuli-Bindung auf die Bildgebung der Oberfläche.
Sobald 10 bis 20 Mikrotubuli innerhalb des Sichtfeldes gebunden sind, waschen Sie die Probe zweimal mit dem gefilterten BRB80. Erfassen Sie 10 Bilder der Mikrotubuli, indem Sie einen Zeitraffer mit einer Belichtungszeit von 10 Millisekunden und einer Verzögerungsdauer von einer Sekunde für insgesamt 10 Sekunden einrichten. Erfassen Sie dann Hintergrundbilder, indem Sie die Bühne mit dem Bühnencontroller entlang der langen Achse des Kanals bewegen und gleichzeitig 100 Bilder ohne Verzögerung erfassen.
Um die Mikrotubuli-Dynamik mit Dembrain Tubulin abzubilden, beginnen Sie mit der Einstellung der Probenheiztemperatur auf 37 Grad Celsius. Mit einer Pipette fließen sie in 10 Mikroliter GMPCPP-stabilisierter Mikrotubulisamen und überwachen sie, indem Sie die Oberfläche live bebildern. Sobald 10 bis 20 Samen innerhalb des Sichtfeldes gebunden sind, waschen Sie die Probe mit dem doppelten Kanalvolumen des vorgewärmten und gefilterten BRB80.
Als nächstes fließen Sie in 10 Mikroliter des Polymerisationsmixes. Um das Wachstum der Mikrotubuli zu messen, richten Sie einen Zeitraffer mit der Erfassungssoftware ein, um alle fünf Sekunden für 15 Minuten ein Bild zu erfassen. Verbessern Sie den Kontrast, indem Sie zu jedem Zeitpunkt ein gemitteltes Bild von 10 abrufen.
Erfassen Sie Hintergrundbilder, wie im vorherigen Abschnitt gezeigt. Berechnen Sie den Median, indem Sie zum Bild gehen, Stapel auswählen, dann Z-Projekt und dann Median. Subtrahieren Sie den entsprechenden Hintergrund, indem Sie zu verarbeiten, zum Bildrechner gehen und subtrahieren aus dem Dropdown-Menü.
Stellen Sie sicher, dass die 32-Bit-Float-Ergebnisoption aktiviert ist. Erfassen Sie bei Mikrotubuli-Schrumpfung Bilder mit 100 Bildern pro Sekunde, indem Sie die Zeitverzögerung auf Null setzen und die Belichtungszeit bei 10 Millisekunden halten. Ein wichtiger Faktor für die Erfassung kontrastreicher Bilder mit der Interferenz-Induktionsmikroskopie ist die korrekte Einstellung der numerischen Blende der Beleuchtung.
Dies kann durch Die Führung der Größe des Beleuchtungsstrahls am Ausgangspupill des Objektivs erfolgen, das durch die Blendenmembrangröße gesteuert wird. Mit einer Probe von florescently-labeld stabilisierten Mikrotubuli, bringen Sie die Mikrotubuli in den Fokus mit dem Fokussierknopf des Mikroskops, während sie fluoreszierend geographieren. Stellen Sie die Kamerabelichtung auf 10 Millisekunden ein und schließen Sie die Blende auf ihre kleinste Öffnung.
Stellen Sie außerdem die Beleuchtung so ein, dass sie den Dynamikbereich der Kamera nahezu sättigt oder bis das Maximum erreicht ist. Erfassen Sie 10 Bilder, indem Sie ein Sichtfeld mit 10 oder mehr Mikrotubuli streamen. Dann erfassen Sie ein Hintergrundbild.
Ändern Sie die Größe der Membran, und passen Sie die Beleuchtungsintensität an die zuvor ermittelte Anpassung an. Erfassen Sie 10 neue Bilder und einen neuen Hintergrund. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der gesamte Bereich der Membran abgeschlossen ist.
Subtrahieren Sie für jedes erworbene Sichtfeld den entsprechenden Hintergrund und durchschnittlich die resultierenden Hintergrundsubtrahierten Bilder wie zuvor gezeigt. Berechnen Sie dann das durchschnittliche Signal-Hintergrund-Rauschverhältnis der Mikrotubuli für jede Öffnungsgröße. Stellen Sie die Membrangröße auf diejenige ein, die das höchste Signal-Hintergrund-Rauschverhältnis erzeugt.
Es ist möglich, dass es eine Reihe von Größen gibt, die einen vergleichbaren Kontrast erzeugen, wie hier gezeigt. Mit einem gut ausgerichteten Mikroskop sollten Mikrotubuli ohne Hintergrundsubtraktion sichtbar sein. Das Subtrahieren des Hintergrunds erhöht jedoch den Kontrast der Mikrotubuli.
Um den Kontrast weiter zu verbessern, können Mittelung, 4a-Filterung oder eine Kombination aus beidem verwendet werden. Die hier gezeigten Zeilenscans beschreiben die inkrementelle Verbesserung der Bildqualität. Diese beschreiben eine spürbare Reduzierung von Hintergrundgeräuschen bei jedem Verarbeitungsschritt.
Mikrotubuli-Dynamik kann in Kinographen berichtet werden, die aus Zeitrafferfilmen generiert werden. Ein Beispiel, das mit einer Bildrate von 0,2 Bildern pro Sekunde aufgenommen wurde, wird hier gezeigt. Die gestrichelten Linien markieren die Samen.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mit hohen numerischen Blendenzielen zu arbeiten. Es ist auch wichtig, die Größe des Rahmens für den Blendendurchmesser richtig auszurichten und festzulegen. Es ist einfach, IRM mit Fluoreszenz-Bildgebung zu kombinieren, um beispielsweise Mikrotubuli-bindende Proteine zu untersuchen und wie sie die Mikrotubuli-Dynamik verändern.
Die Technik reduziert Fotoschäden erheblich und ermöglicht eine höhere Bildrate Erfassung, was das Studium von markierten Biopolymeren wie Mikrotubuli über einen längeren Zeitraum mit hoher zeitlicher Auflösung und guter Tracking-Präzision erleichtert.
