Diese Studie wurde durch das US Department of Energy (DE-FG02-09ER09-08 und DE-PS02-09ER09-18), die Jonsson Comprehensive Cancer Center an der UCLA und der Industrie-Universität Cooperative Research Program (UC Discovery-Grant, bio07 unterstützt -10665). Wir danken Dr. Nagichettiar Satyamurthy und Mitarbeiter an der UCLA Biomedical Cyclotron-Fazilität für die Bereitstellung der F-18 Radioisotop und viele aufschlussreiche Diskussionen. Wir danken Drs. Michael Collins, Greg Leblanc, Joseph Lambert, und Keller Barnhardt von CEM für die technische Beratung und Unterstützung. Wir danken Dirk Williams, Darin Williams, Drs. Joseph Hong Dun Lin und Michael van Dam für die Gestaltung und Bearbeitung von Teilen zu modifizieren CEM Mikrowellen-Reaktor und für SPE Reinigung Module.

1. Erste Vorbereitungen <ol><li> Ein V-Vial (5-mL) RV1 (unter Rühren bar) als Haupt-Reaktionsgefäß für die Durchführung von Mikrowellen-Synthese verwendet. Es ist eine PEEK-Adapter mit sieben Eingang / Ausgang-Ports angeschlossen verbindet und legte innerhalb der Mikrowellenkavität (siehe Abbildung 2). RV2 auf SPE-Kartusche (I) angeschlossen ist, um das Rohprodukt zu sammeln [18 F] SFB. RV3 ist SPE-Kartusche (II) für die Erhebung der endgültigen [18 F] SFB-Lösung verbunden sind. Es kann in einem warmen Wasserbad (40 ° C), um die entsprechende Lösung vor der Rekonstitution in PBS-Puffer-Konzentrat gelegt werden, vor allem für die nachgelagerten Markierung von Biomolekülen. </li><li> Setup für das Sammeln Rohöl [18 F] SFB: Füllen Sie MeCN / H 2 O [6 mL; 1:4 (v: v)]-Lösung, 5% ige wässrige AcOH (8 mL), MeCN (2 mL) für Reservoir A, B und C sind. Dann aktivieren Sie eine SPE-Kartusche (I) (Polystyrol, Merck LiCholut EN) mit Ethanol (10 ml), gefolgt von 5% ige wässrige AcOH (10 ml) gewaschen, gefolgt. </li><li> Setup für das Sammeln gereinigt [18 F] SFB: Bereiten Reservoir D und E mit 10 ml H 2 O und 3 ml Diethylether bzw. gefüllt. Die zweite SPE-Kartusche (II) (Polystyrol, Merck LiCholut EN) ist nach dem gleichen Verfahren bereits erwähnt aktiviert. </li><li> Starten Sie das HPLC (Elutionspuffer: MeCN / H 2 O, 1:1 (v / v) mit 0,2% TFA; Flussrate: 3 ml / min) für Pre-Konditionierung der HPLC-Säule [a reverse-phase semi-präparative Säule (Luna, 5 um C18 (2) 100 A, 250 x 10 mm), Phenomenex, Torrance, CA, USA]. </li></ol> 2. Zubereitung von getrockneten [dh nicht-Träger-added, (NCA)] [18 F] Fluorid <ol><li> [18 F] Fluorid-Lösung in [18 O] H 2 O (100 mL) wurde zu einer Mischung von Kryptofix 222 (20 mg), 1M wässrigen K 2 CO 3 (26 ul) und MeCN (0,8 ml) in einer Eppendorf aufgenommen Rohr. Die gesamte Lösung wird dann auch vor der Übertragung auf die RV1 über den Zulauf der Linie 1 gemischt. Die [18 F] Fluorid-Lösung kann auch durch ein anionisches Austauschpatrone (zB QMA-light Sep-Pak von Waters) übergeben werden, um die Fluorid-18-Trap und dann mit einem Gemisch von K 2 CO 3 und Kryptofix in MeCN eluiert. </li><li> Führen Sie die Trocknung Sequenz (20W, 3 min) unter der Mikrowelle Programm zur Bekämpfung der Restwasser in RV1 entfernen [unter Vakuum]. Nach dem Abkühlen als System-Temperatur unter 50 ° C, zusätzliche MeCN (1,0 ml) wurde in den Reaktor eingebracht und die Sequenz wird einmal wiederholt. </li></ol> 3. Synthese von Ethyl 4 - [18 F] fluorbenzoat <ol><li> Um eine DMSO-Lösung (0,4 ml) enthält, Ethyl-4 - (N, N, N-Trimethylammonium) benzoat Triflat (1,5 mg) wurde in RV1 via Zuleitung 2 hinzugefügt. </li><li> Führen Sie den Labeling-Sequenz (50W, 1 min) unter der Mikrowelle Steuerprogramm unter Rühren Schiff Kühlung und alle Ventile geschlossen, um Ethyl-4 leisten - [18 F] fluorbenzoat ([18 F] 2). </li></ol> 4. Synthese von Kalium-4 - [18 F] fluorbenzoat <ol><li> Um eine DMSO-Lösung (0,5 ml) enthält KOtBu (13 mg) wurde in RV1 über Zuleitung 3 hinzugefügt. </li><li> Execute DEPROTECT Programm (40 W, 1 min) unter der Mikrowelle Steuerprogramm unter Rühren Schiff Kühlung und alle Ventile geschlossen, um die 4 leisten - [18 F] fluorbenzoat Salz ([18 F] 3). </li></ol> 5. Synthese von Rohöl [18 F] SFB <ol><li> Um eine Acetonitril-Lösung (2,5 ml) enthält TSTU (30 mg) wurde RV1 über den Zulauf Linie 6 aufgenommen. TSTU ist feuchtigkeits-und lichtempfindlich. Es sollte in kleine Fläschchen aliquotiert und bei 4 ° C in einem geschlossenen Behälter mit Aluminiumfolie abgedeckt. </li><li> Execute Coupling-Sequenz (30W, 2 min) unter der Mikrowelle Steuerprogramm unter Rühren Schiff Kühlung und alle Ventile geschlossen, um das rohe [18 F] SFB leisten. </li></ol> 6. Die Herstellung der SPE-gereinigt [18 F] SFB <ol><li> 5% ige wässrige AcOH (1,0 ml) wurde RV1 über den Zulauf Linie 7 zum Reaktionsgemisch neutralisieren. Die Lösung wurde dann in die Durchstechflasche B mit 8 ml 5% ige wässrige AcOH (Abbildung 2) übertragen. </li><li> Pass der verdünnten Reaktionsmischung durch SPE-Kartusche (I) zu fangen Rohöl [18 F] SFB mit Stickstoff (10 psi). </li><li> WASH SPE-Kartusche (I) mit einer Mischung aus MeCN und H 2 O [10 mL, 1:4 (v: v)] aus dem Reservoir A. </li><li> [18 F] SFB wurde in RV2 eluiert mit MeCN (2 mL) aus dem Vorratsbehälter C. </li></ol> 7. Reinigung von Roh-[18 F] SFB mit Radio-HPLC <ol><li> Verdünnen Sie entweder rohe [18 F] SFB oder SPE-gereinigt [18 F] SFB mit H 2 O (2 mL) in RV2 und übertragen Sie die Mischung in die HPLC-Schleife (5 mL). Die Lösung wurde in Radio-HPLC injiziert [MeCN / H 2 O, 1:1 (v / v) mit 0,2% TFA; Flussrate: 3 ml / min]. </li><li> Sammeln Sie die Fraktion, die gereinigt [18 F] SFB (Retention time: 8-10 Minuten) in die Durchstechflasche D (mit 10 ml H 2 O vorgefüllt) (Abbildung 2). Kritische Schritt: Wenn richtig ausgeführt, der Anteil Volumen gesammelt hier sollte 4-5 ml sein. </li><li> Pass der verdünnten Reaktionsmischung durch SPE-Kartusche (II) zu fangen gereinigt [18 F] SFB mit Stickstoff (10 psi). Trocknen Sie die Patrone mit einem Strom von Stickstoff für 2-3 Minuten. </li><li> [18 F] SFB wurde in RV3 eluiert mit Diethylether (3 mL) aus dem Vorratsbehälter E.. </li><li> Das Lösungsmittel wird in RV3 bis zur Trockenheit durch einen leichten Stickstoffstrom (10 psi) mit einem Wasserbad (40 ° C). Die endgültige getrocknet [18 F] SFB können in PBS-Puffer für die nachgelagerten Anwendungen wiederhergestellt werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Wir entwickelten eine vereinfachte, schnelle Ein-Topf-Verfahren zur Synthese von [18 F] SFB mit einer Entschützung Strategie unter wasserfreien Bedingungen und Mikrowellenheizung bei jedem radiochemischen / chemische Umwandlung. Abbildung 1 zeigt die Details unserer Radiosynthese. Die Identität des Endproduktes wurde durch Vergleich der HPLC-Retentionszeit mit einem nicht-radioaktiven SFB Referenz bestätigt. Das gereinigte [18 F] SFB wurde auch durch Radio-TLC und HPLC-analysiert, um seine radiochemische und chemische Reinheit zu bestimmen. Das JRK des [18 F] SFB betrug 35 ± 5% innerhalb von 60 min nach HPLC-Reinigung (n&gt; 30), mit hohen radiochemischen Reinheit (&gt; 99%) und gute chemische Reinheit (siehe UV-Spur in das HPLC-Profil, Bild 3 ). Die spezifische Aktivität betrug ca.. 67-330 GBq / mmol (1,8 bis 9,0 Ci / mmol), je nach Ausgangsmaterial Radioaktivität. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Mikrowellen-unterstützte Ein-Topf-Radiosynthese [18 F] SFB. Erstens, die Radiofluorierung von Ethyl 4 - (N, N, N-Trimethylammonium) benzoat Triflat (1) unter Mikrowellenheizung (50 W, 1 min) in Gegenwart von durchgeführt [K ⊃ 2.2.2] [18 F] F - Komplex in Dimethylsulfoxid (DMSO), um Ethyl-4 leisten - [18 F] fluorbenzoat ([18 F] 2). Ohne weitere Reinigung wurde einer DMSO-Lösung von Kalium-tert-butylat (t BuOK) zugegeben und das Reaktionsgefäß wurde Mikrowelle bestrahlt (40 W, 1 min) auf die wasserfreie Entschützung abzuschließen. Die endgültige Umwandlung von [18 F] 3 in [18 F] SFB wurde unter Verwendung von O-(N-Succinimidyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TSPO) Aktivierung. TSTU in Acetonitril wurde zu der Reaktionsmischung gegeben, die die 4 - [18 F] fluorbenzoat ([18 F] 3) Salz, das letzte Syntheseschritt ergab Rohöl [18 F] SFB nach dem Erhitzen (30 W, 2 min). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die schematische Darstellung der Einrichtung für Mikrowellen-unterstützte Ein-Topf-[18 F] SFB-Synthese. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Radio-HPL-Chromatogramme der letzten [18 F] SFB. Top: UV-Signal bei 254 nm, unten: radioaktives Signal; Einschub: UV-Signal bei 254 nm (x 33,3). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> . Tabelle 1 Zusammenfassung der [18 F] SFB radiosyntheses in der Literatur mit Alkyl 4 gemeldet - (Trimethylammonium) benzoat Triflat als Vorläufer.

Diese Methode hat für die US-Patentanmeldung eingereicht.

Dieser vereinfachte dreistufige, Ein-Topf-Radiosynthese der 18 F-Acylierungsreagenz [18 F] SFB wird auf der Grundlage nicht-wässrigen Chemie entwickelt. Dieser Prozess hat eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit und verlässlich für die Herstellung von verwendet werden [18 F] SFB in automatisierten Radiochemie-Module wegen zwei wichtigen Änderungen wie Anhängerschaft beschrieben: 1. Wir beschäftigen ein Entschützung / Verseifung Schritt in wasserfreiem KOtBu / DMSO-System für die g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Essigsäure in wässriger Lösung (5%, v / v) </td><td> Fischer </td><td> A38-500 </td><td> Vorbereitet in unserem Labor </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 75-05-8 </td><td></td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 14775 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472301 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyl 4 - (N, N, N-Trimethylammonium) benzoat Triflat </td><td> Vorbereitet in Labor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1 ,10-Diazabicyclo [8.8.8] hexacosan (K222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 29,111-0 </td><td></td></tr><tr><td> O - (N-Succinimidyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TSPO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 105832-38-0 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumcarbonat in wässriger Lösung (1M) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 209619 </td><td> Vorbereitet in unserem Labor </td></tr><tr><td> Kalium-tert-butylat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 156671 </td><td></td></tr></tbody></table>

microwave-assisted one-pot synthesis of n-succinimidyl-4-[18f]fluorobenzoate ([18f]sfb)

Biomoleküle, einschließlich Peptide, 1-9 Eiweiß, 10,11 und Antikörpern und deren Fragmenten entwickelt, sind 12-14 gewinnt an Bedeutung, da beide potenzielle Therapeutika und molekulare Bildgebung. Vor allem, wenn sie mit Positronen-emittierenden Radioisotopen (zB Cu-64, Ga-68 oder F-18) gekennzeichnet sind, können sie als Sonden für die gezielte Darstellung von vielen physiologischen und pathologischen Prozessen verwendet werden. 15-18 Daher erhebliche Anstrengungen unternommen das sich mit der Synthese und Erforschung von 18 F-markierter Biomoleküle. Zwar gibt es elegante Beispiele für die direkte 18 F-Markierung von Peptiden, 19-22 die harschen Reaktionsbedingungen sind (dh, organische Lösungsmittel, extreme pH-Wert, hohe Temperatur) sind mit Direktwahltelefon Radiofluorierung verbunden meist mit fragilen Proteinproben unvereinbar. Bis heute bleibt daher der Einbau von radioaktiv markierten prosthetischen Gruppen in Biomolekülen die Methode der Wahl. 23,24 N-Succinimidyl-4-[18 F] fluorbenzoat ([18 F] SFB), 25-37 ein Bolton-Hunter-Reagenz geben, die mit den primären Aminogruppen von Biomolekülen reagiert, ist ein sehr vielseitiges prosthetische Gruppe für die 18 F-Markierung der ein breites Spektrum an biologischen Einheiten, in Bezug auf seine offensichtlich in vivo Stabilität und hohe radioaktive Markierung erhalten. Nach der Markierung mit [18 F] SFB, die daraus resultierenden [18 F] fluorobenzoylated Biomoleküle könnten als potenzielle PET-Tracer für in-vivo-Bildgebung Studien untersucht werden. 1 Die meisten [18 F] SFB radiosyntheses in der aktuellen Literatur beschrieben sind, erfordern zwei oder sogar drei Reaktoren und mehrere Reinigungen, indem Sie entweder Festphasenextraktion (SPE) oder High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). Solche langwierigen Prozesse behindern ihre Routine Produktion und breite Anwendung in der Markierung von Biomolekülen. Obwohl mehrere Modul-assistierte [18 F] SFB Synthesen berichtet worden, 29-32, 41-42 sind sie vor allem bei komplizierten und langwierigen Verfahren mit teuren handelsüblichen Radiochemie Boxen (Tabelle 1). Daher eine weitere Vereinfachung der Radiosynthese [18 F] SFB mit einem Low-Cost-Setup wäre sehr vorteilhaft für die Anpassung an einen automatisierten Prozess. Hier berichten wir über eine präzise Herstellung von [18 F] SFB, auf einem vereinfachten Ein-Topf-Mikrowellen-unterstützte Synthese (Abbildung 1). Unser Ansatz erfordert keine Reinigung zwischen den einzelnen Schritten oder wässrigen Reagenzien. Darüber hinaus Mikrowellenbestrahlung, die bei der Synthese von mehreren PET-Tracer verwendet wurde, kann 38-41 führt zu einer höheren RCYs und bessere Selektivität als die entsprechenden thermischen Reaktionen, oder sie bieten ähnliche Erträge in kürzeren Reaktionszeiten. 38 Vor allem, wenn Markierung von Biomolekülen , könnte die Zeit gespeichert, um spätere Biokonjugation oder PET-Bildgebung Schritt umgeleitet werden 28,43 Die Neuheit unserer verbesserten [18 F] SFB-Synthese ist zweifach: (1). wasserfreie Entschützung Strategie erfordert keine Reinigung des Zwischenprodukts (s) zwischen jeden Schritt und (2) die Mikrowellen-unterstützte radiochemische Transformationen ermöglichen die schnelle, zuverlässige Produktion von [18 F] SFB.

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Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Eine einfache, one-pot Synthese von N-Succinimidyl-4-[<sup&gt; 18</sup&gt; F] fluorbenzoat ([<sup&gt; 18</sup&gt; F] SFB) wurde auf Basis einer nicht-wässrigen, Drei-Stufen-radiochemische Verfahren entwickelt. Durch Mikrowellen-Erhitzung, kann das gesamte Verfahren in weniger als 30 min oder 60 min mit weiteren Reinigung durch präparative HPLC abgeschlossen sein. Der Zerfall korrigierten radiochemischen Ausbeuten (RCYs) waren 35-5% (n&gt; 30).

Mikrowellen-unterstützte Ein-Topf-Synthese von N-Succinimidyl-4-[ 18 F] fluorbenzoat ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

Research

JoVE Journal

Biology

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

12.9K Aufrufe.  University of California at Los Angeles. Eine einfache, one-pot Synthese von N-Succinimidyl-4-[ 18 F] fluorbenzoat ([ 18 F] SFB) wurde auf Basis einer nicht-wässrigen, Drei-Stufen-radiochemische Verfahren entwickelt. Durch Mikrowellen-Erhitzung, kann das gesamte Verfahren in weniger als 30 min oder 60 min mit weiteren Reinigung durch präparative HPLC abgeschlossen sein. Der Zerfall korrigierten radiochemischen Ausbeuten (RCYs) waren 35-5% (n> 30).

Serie: Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Optimierung der Ugi-Reaktion mit Parallel Synthese und Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Forschung

Biologie

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

Synthese eines<em&gt; In vivo</em&gt; MRT-Probe nachweisbar Apoptose

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Festphasensynthese eines funktionalisierten Bis-Peptids unter Verwendung von &quot;Safety-Catch&quot;-Methodik

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

Bewertung der de novo Proteinsyntheseraten bei Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...