Diese Arbeit wurde finanziell durch die ANR (Agence nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathien), FEDER in PACA und Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encéphale) unterstützt. Wir danken danken Marie Pierre Blanchard (Jean Roche-Institut) für ihre effiziente Hilfe bei Zeitraffer Aufnahme.

1. Sammlung der Riechschleimhaut in Ratten <ol><li> Beginnen Sie mit der Vorbereitung drei 35 mm Petrischalen mit DMEM / HAM F12 Kulturmedium in einer sauberen Kultur Haube gefüllt. </li><li> Jede Methode der Sterbehilfe müssen im Voraus von der Institution Tier in Pflege und Gebrauch Ausschuss genehmigt und durchgeführt von qualifiziertem Personal. Nachdem die Ratte hat tiefe Narkose mit Natrium-Pentobarbital oder anderen injizierbaren Formen der Anästhesie wie Ketamin / Xylazin eingegeben, enthaupten und die Haut abziehen. Inhalant Anästhetika sollten vermieden werden. Angemessenheit der Narkose wird von toe Prise beurteilt werden, bevor Enthauptung. Entfernen Sie den Unterkiefer mit der Schere und mit der Hilfe von einem Luer, beseitigen die Gesichtsmuskeln auf beiden Seiten. </li><li> Ausgehend von der Rückseite der Schneidezähne, mit einem Luer den Knochen für die Nasenhöhle, eine Seite zu einem Zeitpunkt, zu entfernen. Die olfaktorischen Nasenmuscheln in Sicht kommen, wie orange / braun Organe in den Rücken der Nase entfernt. </li><li> Zart verwerfen die Nasenmuscheln mit einer Pinzette. Mit einer 26-Gauge-Nadel, isolieren die Riechschleimhaut liegt auf der Scheidewand, indem das Gewebe an drei Fronten: den Bogen von der Senkrechten Platte, der Lamina cribrosa und der Decke der Nasenhöhle. </li><li> Sammeln Biopsien auf beiden Seiten und übertragen Sie sie in einem DMEM / HAM F12 gefüllte Petrischale. Dieser Vorgang sollte nicht länger als 10 Minuten vom Beginn Euthanasie. </li><li> Nun, um den Schleim zu entfernen, übertragen Sie die Biopsien zweimal in Medium gefüllte Petrischalen. </li></ol> 2. Sammlung der Riechschleimhaut in Humans <ol><li> Dieses Verfahren sollte von einem Hals, Nasen, Ohren (HNO) Chirurgen durchgeführt werden, in Übereinstimmung mit den einschlägigen lokalen Ethikkommission (s), und jede ambulante sollten eine Einverständniserklärung zu unterschreiben. </li><li> Mit einem 0 ° oder 30 ° starren Endoskop (4 mm Durchmesser), überprüfen Sie beide Nasenhöhlen und bewerten die vermeintliche Anwesenheit von Polypen oder entzündlichen Läsionen. Wählen Sie den besten Nasenhöhle, unter Berücksichtigung der Abweichung der Nasenscheidewand. </li><li> Mit einem Baumwoll-Applikator, gelten ein Lokalanästhetikum wie Lidocain mit Adrenalin, für 10 Minuten. </li><li> Mit einem throughcut Siebbein Pinzette, sammeln zwei Quadratmillimeter Biopsie entweder an der Wurzel der medialen Seite der mittleren Muschel oder auf das Septum in den dorsomedialen Bereich. </li><li> Die olfaktorischen Biopsie wird dann übertragen, mit einer sterilen Kanüle, in ein steriles 2 ml Röhrchen mit 1 ml DMEM / HAM F12 gefüllt. Tipp der Röhre auf den Kopf, um sicherzustellen, dass die Biopsie in das Kulturmedium eingetaucht ist. </li><li> Stecken Sie das Rohr in einem Kühlcontainer und transportieren sie zu den Forschungslabors. In diesem Stadium kann die Biopsie per se für vergleichende molekulare Studien über spezifische Krankheiten des Gehirns konzentriert oder verarbeitet zur Erzeugung von Stammzellen verwendet werden. </li></ol> 3. Isolation der olfaktorischen Stammzellen aus menschlichen und Rat Mucosa <ol><li> Waschen Sie die Biopsien in DMEM / HAM F12. Inkubieren Sie die Biopsien in einer Petrischale mit 1 ml Dispase II-Lösung (2,4 IU / ml) gefüllt, für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Klicken Sie dann unter einem Binokular mit einem gebeugten invertierten Licht, ist das Riechepithel von der darunter liegenden Lamina propria mit einem Mikro Spatel entfernt. </li><li> Das Riechepithel ist dünner und sieht über einem schwarzen Hintergrund transparent gegenüber der Lamina propria, die gestreiften ist orange / braun. Über einem weißen Hintergrund, sieht das Epithel grau und der Lamina propria, braun. </li><li> Einmal gereinigt, Übertragung der Lamina propria in eine Petrischale mit DMEM / HAM F12 gefüllt. </li><li> Wenn das Gewebe von einem Nagetier, dann schneiden die Lamina propria in kleine Stücke mit zwei 25-Gauge-Nadeln. Dann übertragen Sie die Stücke in ein 15 ml Röhrchen mit 1 ml Kollagenase IA gefüllt. </li><li> In der Röhre, mit einer sterilen Plastik-Pipette, distanzieren Gewebe. Dann inkubieren das Rohr 10 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Zur Beendigung der Dissoziation, schaukeln die Röhre und stell 9 ml Ca-freien und Mg-freiem PBS und Zentrifuge bei 200 g für 5 Minuten. </li><li> Zellpellet in DMEM / HAM F12 Kulturmedium mit 10% fötalem Kälberserum, Antibiotika und Platte auf Kunststoff-Kulturschalen ergänzt. </li><li> Nun, wenn das Gewebe ein Mensch ist, dann schneiden die Lamina propria in 3 bis 4 Stücke mit einer Dicke im Bereich von 200 bis 500 um. </li><li> Legen Sie jeden Streifen in eine eigene 2 cm Durchmesser Kulturschale und decken das Gewebe mit einer sterilen 1,3 cm Durchmesser Glasdeckgläschen. </li><li> Dann fügen Sie 500 ul Kulturmedium (DMEM / HAM F12 mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt) zu jeder Kulturschale. </li><li> Für beide Gewebetyp, erneuern das Kulturmedium alle 2 bis 3 Tagen. </li><li> Fünf bis sieben Tage nach, werden Stammzellen beginnen, die Kulturschale eindringen und nach zwei Wochen sollten sie konfluent. Wenn Konfluenz ist, Durchgang erreicht und den Transfer der Zellen auf Kulturflaschen. </li></ol> 4. Sphere Formation und Neuronale différéntiation der olfaktorischen Stem Cells <ol><li> Zur Erzeugung von Stammzellen Kugeln, inkubieren Sie die Flaschen für 2 Stunden bei 37 ° C mit Poly-L-Lysin. (TEXT: 5 g/cm2). </li><li> Platte die Zellen bei einer Dichte von 16.000 Zellen pro Quadratzentimeter in den behandelten Flaschen. </li><li> Alle zwei Tage, füttern Sie die Zellen mit 0,2 ml pro Quadratzentimeter ergänzt Medium (DMEM / HAM F12 ergänzt mit Insulin, Transferrin, Selen (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) und FGF2 (50 ng / ml)). </li><li> Zwei bis fünf Tage später, sammeln schwimmende Zelle Kugeln und entweder neu Platte oder distanzieren sie vor der Transplantation in Tiermodellen der Zelltherapie. </li><li> Zur Unterscheidung olfaktorische Stammzellen in Neuronen-ähnliche Zellen, kultivieren sie für 21 Tage in Neurobasal Medium mit B-27, Penicillin, Streptomycin, Glutamin und Glutamat. </li><li> Dann machen Medium wechselt alle 3 Tage. Neuron-ähnliche Zellen sollte nach zwei vor drei Wochen erscheinen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Nasal menschlichen Explantat-entwachsen Stammzellen (Abbildung 2A) werden sich schnell teilenden und Konfluenz kann innerhalb 1-2 Wochen erreicht werden. Ein wesentliches Merkmal der Stammzell-Seins, Nestin Ausdruck ausgewertet wurde (Abbildung 2B). Wenn auf Poly-L-Lysin mit einem serumfreien Kulturmedium mit EGF (50 ng / ml) und FGF2 (50 ng / ml) ergänzt gewachsen, geben olfaktorische Stammzellen entstehen Kugeln (Abbildung 2C). Wenn in serum-haltigem Kulturmedium gezüchtet neu vergoldet Sphären führen zu GFAP-exprimierenden Zellen (~ 50%), Tubulin-exprimierenden Zellen (~ 10-15%) und O4-exprimierenden Zellen (~ 2-5%) 9 (Figures 2D-F). Allerdings kann das Schicksal der Kugel-abgeleiteten Zellen verändert werden. Zum Beispiel, wenn in einem Neurobasal Kulturmedium mit B27 und Glutamat, die meisten von der Nasen-olfaktorische Stammzellen in Neuronen-ähnliche Zellen, die β-III Tubulin (Abbildung 2G) und MAP2 (Abb. 2H) ergänzt gewachsen. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Gesamtkonzept des Experiments. Riechschleimhaut Biopsien sind aus Ratte oder des Menschen Nasenhöhle herausgeschnitten. Explantate können per se für vergleichende molekulare Untersuchungen mit dem Ziel, Biomarker bei Schädigungen des Gehirns zu identifizieren verwendet werden. Zur Isolierung olfaktorische Stammzellen sind die Wechselwirkungen zwischen der Lamina propria und der neuro-Epithel mit der Dispase II Enzyms gestört, und nach 45 Minuten, das Epithel mit einem Mikro-Spatel entfernt. Nager olfaktorische Stammzellen werden durch Dissoziation der Lamina propria mit Kollagenase IA ausgewählt. Für menschliches Gewebe, sind Stücke von olfaktorischen Lamina propria unter Deckglas kultiviert, bis entwachsen Stammzellen die ganze Invasion gut. Nach Proliferation, mit einem geeigneten Nährmedium, können olfaktorische Stammzellen zu erzeugen Kugeln oder differenzieren sich in Neuronen-ähnliche Zellen. Olfaktorische Stammzellen kann i verwendet werden) in der Reparatur Hirnerkrankungen oder Trauma oder ii) Identifizierung molekularer Marker für Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die Abbildungen sind mit Hilfe von Servier Medical Art gemacht. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Kultur und Differenzierung von humanen nasalen olfaktorische Stammzellen. Menschliche Stammzellen wächst aus der Lamina propria Explantation (A) sind schnell teilenden, wenn in einem Serum-haltigem Medium kultiviert. Stammzellen drücken die Stammzell-Seins Nestin (B). Wenn auf Poly-L-Lysin-beschichtete Kunststoff beschichtet und kultiviert in einem serumfreien Kulturmedium mit EGF und FGF2 ergänzt, erzeugen olfaktorische Stammzellen Kugeln (C). Sphere-abgeleiteten Zellen, wenn in serum-haltigem Kulturmedium vernickelt, führen zu GFAP-exprimierenden Zellen (~ 50%), Tubulin-exprimierenden Zellen (~ 10-15%) und O4-exprimierenden Zellen (~ 2-5%) 9 (DF). Wenn in einem Neurobasal Kulturmedium mit B27 und Glutamat ergänzt gewachsen, unterscheiden sie sich in Neuron-ähnliche Zellen, die β-III Tubulin (G) und MAP2 (H).

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R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss.">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li><li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice.">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li><li>Bianco, J. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellten Verfahren stellen die Nager und die menschliche Riechschleimhaut ein nützliches Modell für die klinische Erforschung der Ursachen von neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen sowie ein Werkzeug für die Reparatur der pathologischen oder traumatisierte Gehirn. Das Protokoll ist relativ einfach und kann leicht durchgeführt werden durch einen erfahrenen Zellbiologe. Die Erfolgsrate für die Biopsie und Kultur Techniken ist hoch. Kritische Schritte <ul><li> Für die Sammlung von Nagetier Riechschleimhaut, empfiehlt es sich nicht um eine Frist von 10 Minuten zwischen Euthanasie und die endgültige Entfernung der olfaktorischen Gewebe überschreiten. </li><li> Die Dissoziation der Nager olfaktorischen Lamina propria ist in der Regel nach 10 min erreicht. Inkubation in Kollagenase IA. Wenn nicht, empfehlen wir sammeln am Tag nach der Überstand, in dem undissoziierten Bits Lamina propria float, Zentrifuge bei 200 g und mechanisch distanzieren die schwimmende Lamina mit einer Pasteurpipette vor Neuplattierungen die Zellen in einen neuen Brunnen. Die ersten gut mit den bereits anhaftenden Zellen mit frischem Nährmedium gefüllt ist. </li><li> Für den menschlichen Lamina propria, die kompakter als das Nagetier Gewebe ist, raten wir von einer enzymatischen Dissoziation. Das Gewebe wird in Scheiben geschnitten und jedes Explantat wird zwischen dem unteren Rand der Plastikschale und einem Deckglas eingefügt. Erfolgreiche Kulturen gehören Explantate deren Dickenbereich von 200 bis 500 um. </li></ul> Mögliche Änderungen <ul><li> Das aktuelle Protokoll kann leicht modifiziert werden, um olfaktorischen Neuronen in vitro zu generieren. Zu diesem Zweck ist die neuro-Epithel nicht entfernt und das ganze Riechschleimhaut ist mit einem McIlwain Chopper (200 um Dicke) geschnitten. Jedes Explantat wird in einer Schale überzogen, teilweise für 1 Stunde getrocknet und dann mit FCS-haltigen Kulturmedium rehydriert. Während der ersten Tage nach der Beschichtung, wachsen epithelialen und mesenchymalen Zellen aus dem Explantat. Dann wird Neuron Vorläuferzellen an der Oberseite dieser Zellschicht migrieren und differenzieren zu Neuronen. </li><li> Die Reinigung des olfaktorischen Stammzellen kann mit Hilfe der Durchflusszytometrie werden. Spezifische Oberfläche Marker können aus der Liste in der Charakterisierung Papier veröffentlicht 11 abgerufen werden. </li><li> Für die Transplantation Experimenten ist es möglich, einem Stamm von Ratten, deren olfaktorische Stammzellen sind GFP-positive verwenden. Diese Rattenstamm (Sprague Dawley, eGFP getrieben von der PGK-Promotor) ist IterT (Nantes, Frankreich) zur Verfügung. Zum Einlegen des GFP-Gens in menschlichen Geruchs Stammzellen verwenden wir eine Methode auf Lentivirus Infektion. </li><li> Dieses Papier ist auf olfaktorische Ekto-mesenchymale Stammzellen. Allerdings kann ein anderer Zelltyp von Interesse, die olfaktorischen einhüllenden Zellen, aus dem gleichen Gewebe gereinigt werden. Wir beschrieben eine Methode für ihre Sammlung und Reinigung 1,17 und wir benutzten die menschliche Nase einhüllenden Zellen für eine Phase I / IIa der klinischen Entwicklung bei querschnittgelähmten Patienten 18. </li><li> Als Mitglied der mesenchymalen Stammzellen Superfamilie sind OE-MSCs können unter geeigneten Kulturbedingungen, in Adipozyten, Osteozyten und Myozyten 11 zu unterscheiden. </li></ul> Zukünftige Anwendungen <ul><li> Wir haben bereits die menschliche Geruchssinn Biopsien verwendet werden, um zelluläre und molekulare Anomalien bei Patienten mit Autismus, bipolare Störung, familiäre dysautonomia, Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer und Schizophrenie 2-7 studieren. Theoretisch können alle Erkrankungen des Gehirns untersucht mit nasal Biopsien oder peripheren olfaktorischen Stammzellen werden. </li><li> Nager und Mensch nasal olfaktorische Stammzellen haben bereits in Tiermodellen der Amnesie, Morbus Parkinson, Cochlea-Schäden und Rückenmarkstraumata 12-16 aufgepfropft. Es ist denkbar, diese Zellen in Tiermodellen der Alzheimer-Krankheit, Gehirn Ischämie, Multiple Sklerose zu verpflanzen. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td colspan="3"> Sammlung der Riechschleimhaut in Ratten </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Natrium-Pentobarbital </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 Gauge Nadel </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Zange </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Sammlung von Riechschleimhaut beim Menschen </td></tr><tr><td> Starres Endoskop </td><td> Karl Storz oder Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td> Lidocain </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adrenalin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut Siebbein Zange </td><td> Karl Storz oder Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Isolierung von olfaktorischen Stammzellen </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micro Spatel </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Sphere Bildung und neuronale Differenzierung </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> Insulin-Transferrin Selen (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Neurobasalmedium </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 Serum-Free Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Glutamat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

Die Riechschleimhaut in der Nasenhöhle befindet, ist für die Erkennung Gerüche. Es ist auch die einzige Nervengewebe, die zu der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und leicht zugänglich in jedem lebenden Individuum. Als Ergebnis ist dieses Gewebe einzigartig für jedermann mit dem Ziel, molekulare Anomalien in der pathologischen Gehirns zu identifizieren oder zu isolieren, adulte Stammzellen für die Zelltherapie. Molekulare Veränderungen bei Schädigungen des Gehirns sind oft studiert mit Nervengewebe gesammelten Proben post-mortem. Allerdings hat dieses Material zahlreiche Einschränkungen. Im Gegensatz dazu ist die Riechschleimhaut leicht zugänglich und können sicher und ohne jeglichen Verlust des Geruchssinns 1 biopsiert werden. Dementsprechend stellt die Riechschleimhaut eine &quot;offene Fenster&quot; in der erwachsenen Menschen, durch die man studieren kann Entwicklungsstörungen (zB Autismus, Schizophrenie) 2-4 oder neurodegenerative (zB Parkinson, Alzheimer) Erkrankungen 4,5. Riechschleimhaut kann entweder für vergleichende molekulare Untersuchungen 4,6 oder in vitro-Experimenten auf die Neurogenese 3,7 verwendet werden. Das Riechepithel ist auch ein Nervengewebe, dass neue Nervenzellen produziert jeden Tag, um diejenigen, die durch Umweltverschmutzung geschädigt sind, bakterielle von viralen Infektionen zu ersetzen. Diese permanente Neurogenese wird durch Vorfahren aufrechterhalten, sondern auch Stammzellen mit Wohnsitz innerhalb der beiden Kammern der Schleimhaut, nämlich die Neuroepithel und die zugrunde liegenden Lamina propria 8-10. Wir haben kürzlich eine Methode entwickelt, um die adulten Stammzellen in der Lamina propria befindet reinigen und, nachdem er bewiesen, dass sie eng mit dem Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BM-MSC) verbunden, nannten wir sie olfaktorischen Ekto-mesenchymale Stammzellen (OE- MSC) 11. Interessanterweise, wenn sie auf BM-MSCs verglichen, zeigen OE-MSCs eine hohe Proliferationsrate, einer erhöhten clonogenicity und eine Neigung zu Nervenzellen differenzieren. Wir nutzten diese Eigenschaften auf Studien gewidmet neue Kandidatengene bei Schizophrenie und Parkinson 4 enthüllen durchzuführen. Wir und andere haben auch gezeigt, dass OE-MSCs sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapie nach einer Rückenmarkstraumata 12,13, ein Cochlea-Schäden 14 oder in einem Tiermodell der Parkinson-Krankheit 15 oder Amnesie 16. In dieser Studie präsentieren wir Methoden zur Riechschleimhaut bei Ratten und Menschen Biopsie. Nach der Entnahme wird der Lamina propria enzymatisch aus dem Epithel und Stammzellen getrennt werden gereinigt, indem eine enzymatische oder nicht-enzymatische Methode. Gereinigtes olfaktorische Stammzellen können dann entweder in großer Zahl gezüchtet und Querneigung in flüssigem Stickstoff oder veranlasst Sphären Form oder differenziert in neuronale Zellen. Diese Stammzellen können auch für vergleichende omics (genomische, Transkriptom-, epigenomischen-, Proteom-) Studien verwendet werden.

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Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Wir beschreiben hier eine Methode zur Biopsieentnahme Riechschleimhaut von Ratte und Mensch Nasenhöhlen. Diese Biopsien können entweder für die Identifizierung von molekularen Anomalien bei Schädigungen des Gehirns oder Isolieren multipotente adulte Stammzellen, die für die Zell-Transplantation in Tiermodellen für Hirn-Trauma / Krankheit eingesetzt werden kann genutzt werden

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

30.5K Aufrufe.  Aix Marseille University. Wir beschreiben hier eine Methode zur Biopsieentnahme Riechschleimhaut von Ratte und Mensch Nasenhöhlen. Diese Biopsien können entweder für die Identifizierung von molekularen Anomalien bei Schädigungen des Gehirns oder Isolieren multipotente adulte Stammzellen, die für die Zell-Transplantation in Tiermodellen für Hirn-Trauma / Krankheit eingesetzt werden kann genutzt werden

Serie: Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Elektrophysiologische Messungen von einer Moth Riechsystem

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modellierung Astrozytom Pathogenese<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt; Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Riechzellen durch nasale Biopsie Combined Erhalten mit Laser-Mikrodissektion: Ein möglicher Ansatz zum Behandlungserfolg bei Mental Disorders Studieren

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...