עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי ANR (סוכנות הידיעות הלאומית של de la משוכלל ונדיר), AFM (העמותה Francaise Myopathies contre les), פדר ב PACA ו IRME (Institut de la משוכלל ונדיר sur Moelle épinière et l&#39;Encéphale). אנחנו בהכרת תודה תודה מארי ופייר בלנשרד (ז&#39;אן רוש המכון) על העזרה היעילה שלה במהלך ההקלטה זמן לשגות.

1. אוסף של רירית חוש הריח בחולדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין על ידי הכנת מנות three 35 מ&quot;מ פטרי מלאות בינוני F12 DMEM / HAM תרבות במנדף תרבות נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שיטה של ​​המתת חסד חייב לקבל אישור מראש על ידי טיפול בבעלי חיים של המוסד והוועדה להשתמש ובוצע על ידי טכנאי מוסמך. אחרי החולדה נכנסה הרדמה עמוקה עם צורות נתרן pentobarbital או אחר בזריקות הרדמה כגון קטמין / xylazine, לערוף ולהסיר את העור. הרדמה נשימתית יש להימנע. הלימות של הרדמה יוערכו על ידי צביטה הבוהן לפני עריפת ראש. הסר את הלסת התחתונה עם מספריים בעזרת rongeur, לחסל את שרירי הפנים משני הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהחלק האחורי של השיניים החותכות, הסר עם rongeur העצם המכסה את חלל האף, בצד אחד בכל פעם. Turbinates הריח נכנס מראה כמו כתום / חום באיברים הממוקם בחלק האחורי של האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתעלמות turbinates עם מלקחיים. בעזרת מחט מד 26, לבודד את רירית ההרחה שוכב על מחצה על ידי חיתוך הרקמה לאורך שלושה קווים: קשת הצלחת בניצב, את הצלחת cribriform ואת התקרה של חלל האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ביופסיות משני הצדדים ולהעביר אותם מנה DMEM / HAM פטרי F12 מלא. הליך זה לא אמור לקחת יותר מ 10 דקות המתת חסד את התחלתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת, על מנת להסיר את רירית, העברת ביופסיות פעמיים בינוני מלא בצלחות פטרי. </li></ol> 2. אוסף של רירית חוש הריח בבני אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך זה צריך להתבצע על ידי אף אוזן גרון (אא&quot;ג) המנתח, בהתאם רלוונטי ועדה אתית מקומית (ים) ו חוץ כל צריך לחתום על טופס הסכמה מדעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש 0 ° או 30 ° אנדוסקופ קשיח (4 מ&quot;מ קוטר), לבדוק את שני החללים באף להעריך את נוכחות המשוערת של פוליפים או נגעים דלקתיים. בחר את חלל האף הטובה ביותר, תוך התחשבות חריגה של מחיצת האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטוש צמר גפן, להחיל הרדמה מקומית, כמו לידוקאין עם אפינפרין, במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים כברתי throughcut, לאסוף שני ביופסיה מילימטר מרובע או בשורש היבט המדיאלי של חלזוני באמצע או על מחצה באזור dorsomedial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביופסיה של חוש הריח הוא הועבר לאחר מכן, באמצעות מחט סטרילית, לתוך צינור 2 מ&quot;ל סטרילי מלא 1 מ&quot;ל של DMEM / HAM F12. עצה הצינור הפוך לוודא כי הביופסיה הוא שקוע בתוך המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצינור במיכל בקירור ולהעביר אותה למעבדת מחקר. בשלב זה, ביופסיה יכולה לשמש כשלעצמה עבור מחקרים מולקולריים השוואתית מתמקדת במחלות מוח ספציפיים או מעובד להפקת בתאי גזע. </li></ol> 3. בידוד של גזע תאים רירית חוש הריח של האדם עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ביופסיות ב DMEM / HAM F12. דגירה ביופסיות בצלחת פטרי מלאות מ&quot;ל 1 של dispase II פתרון (2.4 IU / ml), במשך שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ לנתח באור הפוך diffracted, אפיתל ההרחה יוסר lamina propria הבסיסית באמצעות מרית מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיתל הריח הוא דק יותר נראה שקוף על רקע שחור לעומת lamina propria אשר פסים כתום / חום. במהלך רקע לבן, האפיתל נראה אפור lamina propria, חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטוהרים פעם אחת, להעביר את lamina propria לתוך צלחת פטרי מלאות DMEM / HAM F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הרקמה של מכרסם, ואז לחתוך את lamina propria לחתיכות קטנות עם שתי 25 מחטים מד. ואז, להעביר את חתיכות צינור 15 מ&quot;ל מלא 1 מ&quot;ל של collagenase IA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך הצינור, בעזרת פיפטה פלסטיק סטרילית, לנתק את הרקמה. ואז, דגירה הצינור במשך 10 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסיים את הניתוק, בעדינות הסלע צינור ולהוסיף 9 מ&quot;ל של Ca-Mg חופשית ללא PBS ו צנטריפוגות ב 200 גר &#39;במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במדיום F12 DMEM / HAM תרבות בתוספת סרום 10% עגל, אנטיביוטיקה העובר על צלחת צלחות תרבות הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, אם הרקמה האנושית, אז הפרוסה lamina propria לתוך 3-4 חתיכות עם עובי הנע 200-500 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס כל רצועה 2 לתוך צלחת משלו בקוטר ס&quot;מ תרבות לכסות את הרקמה עם סטרילי בקוטר 1.3 ס&quot;מ תלושי זכוכית המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, להוסיף 500 μl של המדיום תרבות (DMEM / HAM F12 בתוספת סרום 10% עגל אנטיביוטיקה עוברי) כדי בצלחת כל תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור סוג או רקמות, לחדש את המדיום תרבות כל 2 עד 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמישה עד שבעה ימים אחרי, בתאי גזע יחלו לפלוש צלחת תרבות ואחרי שבועיים הם צריכים להיות ומחוברות. Confluency כאשר הוא הגיע, מעבר ולהעביר את התאים צלוחיות תרבות. </li></ol> 4. כדור גיבוש Differe העצביתntiation בתאי גזע של חוש הריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור תא גזע התחומים, דגירה צלוחיות במשך שעתיים על 37 מעלות צלזיוס עם פולי-L-ליזין. (טקסט: 5 g/cm2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים בצפיפות של 16,000 תאים לסנטימטר מרובע של צלוחיות טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל יומיים, להאכיל את התאים עם 0.2ml לסנטימטר מרובע של המדיום שיושלם (DMEM / HAM F12 בתוספת אינסולין, transferrin, סלניום (X-ITS, 1%), EGF (50 ng / ml) ו FGF2 (50 ng / מ&quot;ל)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים עד חמישה ימים מאוחר יותר, לאסוף כדורים תא צף מחדש או צלחת או לנתק אותם לפני השתלת במודלים של בעלי חיים טיפול בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל מתאי גזע הריח לתוך נוירון כמו תאים, לטפח אותם במשך 21 ימים בתווך Neurobasal המכיל B-27, פניצילין, סטרפטומיצין גלוטמין ו - גלוטמאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לבצע שינויים בינוני כל 3 ימים. Neuron דמויי תאים אמור להופיע לאחר שבועיים עד שלושה שבועות. </li></ol> 5. נציג תוצאות: באף האנושי explant-התבגרות בתאי גזע (איור 2 א) מתחלקים במהירות confluency ניתן להגיע בתוך שבוע עד שבועיים. אחת התכונות העיקריות של stemness, הביטוי nestin, הוערך (2B איור). כאשר גדל על פולי-L-ליזין בינוני עם סרום ללא תרבות בתוספת EGF (50 ng / ml) ו FGF2 (50 ng / ml), בתאי גזע הריח להצמיח התחומים (דמות 2C). כאשר גדל בינוני סרום המכיל התרבות החדש התחומים מצופה להצמיח GFAP-להביע תאים (~ 50%), טובולין-להביע תאים (~ 10-15%) ו-O4 להביע תאים (~ 2-5%), 9 (איורים 2D-F). עם זאת, גורלו של כדור הנגזרות תאים יכול להיות שונה. לדוגמה, כאשר גדל בינוני תרבות Neurobasal בתוספת B27 ו גלוטמט, רוב התאים לאף גזע הריח לתוך תא העצב, כמו תאים להביע β-III טובולין (איור 2G) ו MAP2 (איור 2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תכנית כוללת של הניסוי. חוש הריח ביופסיות רירית הם נכרת מן החולדה או חלל האף האנושי. Explants יכולה לשמש כשלעצמה עבור מחקרים מולקולריים השוואתי במטרה לזהות סמנים ביולוגיים במחלות מוח. לבידוד בתאי גזע חוש הריח, אינטראקציות בין lamina propria ואת נוירו אפיתל הם שיבשו עם השנייה dispase האנזים, ואחרי 45 דקות, אפיתל יוסר עם מרית המיקרו. חוש הריח מכרסם בתאי גזע שנבחרו נוספת על ידי dissociating lamina propria עם collagenase IA. עבור רקמה אנושית, פיסות lamina propria חוש הריח הם תרבותי תחת זכוכית coverslip עד בתאי גזע התבגרות לפלוש כולו טוב. לאחר התפשטות, באמצעות המדיום המתאים תרבות, בתאי גזע חוש הריח יכול ליצור כדורים או להתמיין נוירון דמויי תאים. חוש הריח בתאי גזע שניתן להשתמש בהם כדי i) המוח לתקן מחלות או טראומה או ii) לזהות סמנים מולקולריים של מחלות מערכת העצבים המרכזית. איורים נעשים בעזרת אמנות רפואי Servier. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. התרבות והתמיינות של תאים אנושיים האף גזע חוש הריח. בתאי גזע האדם גדל מתוך lamina propria explant (א) מתחלקים במהירות, כאשר מעובדות בינוני סרום המכיל. בתאי גזע לבטא את stemness סמן nestin (B). כאשר מצופה פלסטיק על פולי-L-ליזין מצופה וטיפח במדיום סרום ללא תרבות בתוספת EGF ו FGF2, בתאי גזע הריח ליצור כדורים (C). כדור הנגזרות תאים, כאשר מצופה במדיום סרום המכיל תרבות, להצמיח GFAP-להביע תאים (~ 50%), טובולין-להביע תאים (~ 10-15%) ו-O4 להביע תאים (~ 2-5%) 9 (DF). כאשר גדל בינוני תרבות Neurobasal בתוספת B27 ו גלוטמט, הם להתמיין לתאי עצב, כמו הבעת β-III טובולין (G) MAP2 (H).

<ol>
	<li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons.">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li><li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett's+syndrome.">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li><li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+adhesion,+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia.">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li><li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific,+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders.">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li><li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease.">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li><li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+stem+cells,+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia.">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li><li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses.">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li><li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+olfactory+stem+cells.">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa.">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li><li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa.">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li><li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties.">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li><li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery.">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li><li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery.">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li><li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss.">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li><li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice.">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia:+a+3-year+clinical+trial.">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקות שהוצגו כאן להפוך את המכרסמים רירית ההרחה האנושית מודל שימושי עבור מחקר קליני על הגורמים מחלות התפתחותיות ו ניווניות, כמו גם כלי תיקון מוח פתולוגי או טראומה. הפרוטוקול היא פשוטה יחסית, יכול להתבצע בקלות על ידי הביולוג תא מנוסים. שיעור ההצלחה של שיטות ביופסיה ותרבות גבוהה. צעדים קריטיים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אוסף של רירית ההרחה מכרסם, מומלץ שלא יעלה על מגבלת זמן של 10 דקות בין המתת חסד לבין כריתה הסופי של רקמת ההרחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניתוק של lamina propria הריח מכרסם מושגת בדרך כלל לאחר 10 דקות. הדגירה ב collagenase IA. אם לא, אנו ממליצים לאסוף יום לאחר supernatant שבו פיסות undissociated של לצוף lamina propria, צנטריפוגה זה ב 200 גר &#39;ו - מכנית לנתק את lamina צף בעזרת פיפטה פסטר לפני replating התאים באר חדשה. גם הראשון המכיל את התאים מחוברים כבר מתמלא בינוני תרבות טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור lamina propria האדם, היא קומפקטית יותר רקמת מכרסם, אנחנו לא ממליצים דיסוציאציה האנזימטית. רקמה היא פרוסים בכל explant מוכנס בין החלק התחתון של צלחת פלסטיק זכוכית coverslip. תרבויות מוצלח כוללים explants אשר עובי בטווח 200-500 מיקרומטר. </li></ul> שינויים אפשריים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות שונה מעט על מנת לייצר נוירונים הריח במבחנה. לשם כך, נוירו אפיתל אינו מוסר את רירית ההרחה כולו פרוס עם המסוק McIlwain (200 מיקרומטר עובי). Explant כל מצופה בצלחת, מיובשים חלקית במשך שעה אחת ו rehydrated אז עם המדיום FCS המכילים תרבות. במהלך ציפוי בימים הראשונים שלאחר, תאים אפיתל mesenchymal לצמוח מתוך explant. ואז, אבות נוירון יעברו על החלק העליון של שכבה זו של תאים להתמיין לנוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור בתאי גזע חוש הריח יכולה להיות מושגת באמצעות cytometry הזרימה. סמנים ספציפיים השטח ניתן לאחזר מהרשימה שפורסם בעיתון אפיון 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הניסויים השתלה, ניתן להשתמש זן של חולדות אשר הריח בתאי גזע ה-GFP חיובי. זה זן עכברים (ספראג Dawley, eGFP מונע על ידי האמרגן PGK) זמין בכתובת ITERT (נאנט, צרפת). עבור החדרת הגן GFP בבני אדם בתאי גזע חוש הריח, אנו משתמשים בשיטה המבוססת על זיהום lentivirus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאמר זה מתמקד חיצוני mesenchymal גזע לתאי חוש הריח. עם זאת, סוג תא אחר של עניין, התאים ensheathing חוש הריח, יכול להיות מטוהרים מרקמות זהה. אנו תיאר שיטה אוסף שלהם טיהור 1,17 והיינו האדם תאים ensheathing האף לניסוי שלב I / IIa קליניים בחולים משותק 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחבר של superfamily גזע mesenchymal התא, OE-MSCs יכולים, בתנאים המתאימים תרבות, להתמיין adipocytes, osteocytes ו myocytes 11. </li></ul> יישומים עתידיים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנו כבר בשימוש ביופסיות חוש הריח האנושי ללמוד אנומליות תאית ומולקולרית בחולים עם אוטיזם, הפרעה דו קוטבית, לדיסאוטונומיה משפחתית, מחלת פרקינסון, אלצהיימר וסכיזופרניה 2-7. תיאורטית, כל המחלות במוח ניתן ללמוד באמצעות ביופסיות האף או היקפית בתאי גזע חוש הריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכרסמים אדם בתאי גזע האף הריח כבר מורכבים במודלים של בעלי חיים של אמנזיה, מחלת פרקינסון, נזק שבלול וטראומה חוט השדרה 12-16. זה מתקבל על הדעת להשתיל את התאים האלה לתוך מודלים של בעלי חיים של מחלת אלצהיימר, איסכמיה, טרשת נפוצה. </li></ul>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td colspan="3"> אוסף של רירית חוש הריח בחולדות </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Pentobarbital נתרן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 מחט מד </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> מצבטים </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> אוסף של רירית ההרחה בבני אדם </td></tr><tr><td> אנדוסקופ קשיח </td><td> קרל Storz או ריצ&#39;רד וולף לרפואה </td><td></td></tr><tr><td> לידוקאין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אפינפרין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut כברתי מלקחיים </td><td> קרל Storz או ריצ&#39;רד וולף לרפואה </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> בידוד בתאי גזע חוש הריח </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> רוש </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרו מרית </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> עגל עוברית בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> זכוכית coverslip </td><td> Knittel גלזר </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> היווצרות כדור והבחנה עצבית </td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> אינסולין transferrin סלניום (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Neurobasal בינוני </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 סרום ללא תוספת </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> גלוטמט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

רירית ההרחה, הממוקמת בחלל האף, הוא אחראי על זיהוי ריחות. זהו גם רקמת העצבים רק כי הוא חשוף לסביבה החיצונית ונגיש בקלות כל אדם חי. כתוצאה מכך, רקמה זו היא ייחודית לכל אדם במטרה לזהות אנומליות מולקולריים במוח פתולוגי או לבודד בתאי גזע בוגרים לטיפול בתא. ליקויים מולקולרית במחלות מוח נלמדים לעתים קרובות באמצעות דגימות רקמה שנאספו העצבים שלאחר המוות. עם זאת, חומר זה יש מגבלות רבות. לעומת זאת, רירית ההרחה הוא נגיש וניתן ביופסיה בבטחה ללא אובדן חוש הריח 1. לפיכך, רירית ההרחה מספקת &quot;חלון פתוח&quot; על האדם המבוגר דרכו ניתן ללמוד התפתחותית (כגון סכיזופרניה, אוטיזם) 2-4 או ניווניות (כגון פרקינסון, אלצהיימר) מחלות 4,5. רירית חוש הריח יכול לשמש גם מחקרים מולקולריים השוואתי 4,6 או בניסויים במבחנה על neurogenesis 3,7. אפיתל הריח הוא גם רקמת העצבים שמייצר נוירונים חדשים כל יום כדי להחליף את אלה שנפגעו זיהום, חיידקי של זיהומים נגיפיים. Neurogenesis זה קבע שנגרמו אבות, אלא גם בתאי גזע המתגוררים בתוך שני תאים של רירית, כלומר neuroepithelium ו lamina propria 8-10 הבסיסית. אנחנו לאחרונה פיתחה שיטה לטיהור בתאי גזע בוגרים ממוקם lamina propria ו, לאחר הוכיחו כי הם קשורים באופן הדוק מח עצם mesenchymal בתאי גזע (BM-MSC), קראנו להם חוש הריח חיצוני mesenchymal בתאי גזע (OE- MSC) 11. מעניין לציין, כי בהשוואה BM-MSCs, OE-MSCs להציג קצב התפשטות גבוה, clonogenicity מוגבה נטייה להתמיין תאים עצביים. ניצלנו את המאפיינים הללו לבצע מחקרים מוקדש לחשוף גנים מועמדים חדשים סכיזופרניה 4 מחלת פרקינסון. אנו ואחרים הראו גם כי OE-MSCs מבטיחים המועמדים טיפול בתא, לאחר טראומה חוט השדרה 12,13, 14 נזק שבלול או במודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון 15 או 16 אמנזיה. במחקר זה, אנו מציגים שיטות ביופסיה של רירית ההרחה אצל חולדות ובני אדם. לאחר איסוף, propria lamina מופרדת enzymatically מן האפיתל ותאי גזע הם מטוהרים באמצעות אנזימטית או שיטה שאינה האנזימטית. מטוהר בתאי גזע הריח אז יכול להיות גדל גם במספרים גדולים, ובנתה בחנקן נוזלי או המושרה ליצור כדורים או מובחן לתוך תאים עצביים. תאים אלה גזע יכול לשמש גם עבור omics (גנומי, transcriptomic, epigenomic, proteomic) מחקרים השוואתיים.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans at JoVE.com

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

אנו מתארים כאן שיטה לביופסיה של רירית חוש הריח של העכברים וחללים האף האנושי. ביופסיות אלו יכולים לשמש גם לזיהוי חריגות מולקולרי במחלות מוח או בידוד multipotent גזע בוגרים לתאי כי יכול להיות מנוצל עבור השתלת תאים בבעלי חיים טראומה מוחית / מחלה.

בידוד באף גזע תאים חוש הריח של מכרסמים או בני אדם

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

30.5K Views.  Aix Marseille University. אנו מתארים כאן שיטה לביופסיה של רירית חוש הריח של העכברים וחללים האף האנושי. ביופסיות אלו יכולים לשמש גם לזיהוי חריגות מולקולרי במחלות מוח או בידוד multipotent גזע בוגרים לתאי כי יכול להיות מנוצל עבור השתלת תאים בבעלי חיים טראומה מוחית / מחלה.

Video: Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

מדידות אלקטרו ממערכת עש חוש הריח

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...