이 작품은 재정적으로 ANR (회사 직원 nationale 드 라 물리), AFM (협회 프헝쎄스 contre 레 Myopathies), 파카와 가야해에서 페더 (인스티투트 데 물리 쉬르 라 Moelle épinière 동부 표준시 난 Encéphale)에 의해 지원되었다. 우리는 기꺼이 시간 경과 기록하는 동안 그녀의 효율적인 도움 마리 피에르 블랜차드 (진 로체 연구소)를 주셔서 감사합니다.

1. 쥐에 강한 점막 수집 <ol><li> 깨끗한 문화 모자 DMEM / 햄 F12 배지로 가득 세 35mm 페트리 요리를 준비하여 시작합니다. </li><li> 안락사의 방법은 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인 및 자격을 갖춘 직원에 의해 수행되어야합니다. 쥐의 이러한 마취제 / xylazine으로 마취의 나트륨 pentobarbital 또는 기타 주사용 형태와 깊은 마취를 입력한 후, 참살하고 피부를 제거합니다. 흡입 anesthetics은 피해야한다. 마취의 타당성이 잘린하기 전에 발끝 핀치에 의해 평가됩니다. 가위로 아래턱을 제거하고 rongeur의 도움으로, 양쪽에있는 얼굴 근육을 제거합니다. </li><li> incisors의 뒷면에서 시작 rongeur 비강, 한 번에 하나의 측면을 덮고있는 뼈 제거합니다. 오렌지 / 브라운 기관은 코 뒤쪽에 위치한으로 후각 turbinates가 보이기 시작하다. </li><li> 정교한 포셉로 turbinates 폐기하십시오. 수직 판, 소공 질의 판과 비강의 천장의 아크 : 26 게이지 바늘을 사용하여 세 줄을 따라 조직을 절단하여 심장에 누워 후각 점막을 분리. </li><li> 양쪽에 biopsies를 수집하고 DMEM / 햄 F12 - 가득한 페트리 접시에서 그들을 전송합니다. 이 절차는 발병 안락사에서 10 분 이상 안 걸릴 것입니다. </li><li> 자, 가래를 제거하기 위해, 중간 가득한 배양 접시에 biopsies 두 번 전송합니다. </li></ol> 2. 인간의 강한 점막 수집 <ol><li> 이 절차는 해당 지역 윤리위원회 (S)에 따라, 귀 코 스로트 (ENT) 외과 의사에 의해 실시되어야하고, 모든 외래는 정보 동의서에 서명해야합니다. </li><li> 0 ° 또는 30 ° 단단한 내시경 (4mm 직경)를 사용, 코와 충치를 모두 검사하고 폴립이나 염증성 병변의 putative 존재를 평가. 계정에 심장의 편차를 복용, 최고의 비강을 선택합니다. </li><li> 면화 작은 주걱을 사용하여 10 분, 에피네프린과 같은 lidocaine과 같은 국소 마취제를 적용할 수 있습니다. </li><li> throughcut 사골 집게와 가운데 turbinate의 중간 부분의 루트 또는 dorsomedial 지역에서 심장에 중 두 평방 밀리미터 생검를 수집합니다. </li><li> 후각 생검은 다음 DMEM / 햄 F12 1 ML 가득 살균이 ML 관에, 멸균 바늘을 사용하여 전송됩니다. 생검이 문화 매체에 잠겨 있는지 확인하기 위해 거꾸로 튜브를 팁. </li><li> 냉장 컨테이너에 튜브를 삽입하고 연구실에 수송. 이 단계에서는 생검은 특정 뇌 질환에 초점을 맞춘 또는 줄기 세포 생성에 대한 처리 비교 분자 연구 글 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 인간과 쥐 점막에서 강한 줄기 세포의 분리 <ol><li> DMEM / 햄 F12에 biopsies 씻으십시오. 37 1 시간, dispase II 솔루션 (2.4 IU / ML) 1 ML 가득한 페트리 접시에 biopsies을 품어 ° C. </li><li> 다음 diffracted 거꾸로 조명과 해부 현미경, 후각 상피는 마이크로 주걱을 사용하여 기본 라미나의 propria에서 제거됩니다. </li><li> 후각 상피는 스트 라이프입니다 라미나의 propria에 비해 얇은이며 검은 배경 위에 반투명 보이는 주황색 / 갈색. 흰색 배경에 걸쳐 상피는 회색과 라미나의 propria, 갈색 보인다. </li><li> 일단 정화, DMEM / 햄 F12 가득한 페트리 접시에 얇은 판의 propria를 전송할 수 있습니다. </li><li> 조직은 설치류에서있다면,이 25 게이지 바늘로 작은 조각으로 라미나의 propria 잘라. 그런 다음, collagenase IA 1 ML 가득 15 ML 튜브에 조각을 전송합니다. </li><li> 튜브에서 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 조직을 떼어 놓다. 그렇다면, 37에서 10 분 동안 튜브를 품어 ° C. </li><li> 분리를 종료하려면, 부드럽게 튜브를 바위와 구 CA - 무료 MG - 무료 PBS의 ML과 5 분 200g에 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 플라스틱 문화 요리 10 % 태아 송아지 혈청, 항생제 및 플레이트와 함께 보충 DMEM / 햄 F12 배지에서 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 이제 조직 인간있다면, 그때 200-500 μm의 이르는 두께 3-4 조각으로 라미나의 propria를 슬라이스. </li><li> 자체 2cm 직경 문화 요리에 각 스트립을 삽입하고 무균 1.3 cm 직경의 유리 커버 풀렸는데로 조직을 커버. </li><li> 그런 다음, 각 문화 요리에 배지 500 μl (DMEM / 햄 F12 10% 소태아 혈청과 항생제로 보충)을 추가합니다. </li><li> 어느 조직 유형에 대한 모든 2-3일 문화 매체를 갱신. </li><li> 5 ~ 7 일 후에, 줄기 세포는 문화 접시를 침공하기 시작하고 2 주 후에 그들이 합류한다. , 통로에 도달하고 문화 flasks에 전지를 전송할 때 confluency. </li></ol> 4. 영역의 형성과의 연결 Differe강한 줄기 세포의 ntiation <ol><li> 줄기 세포 분야를 생성하려면, 37 두 시간 동안 flasks을 품어 ° 폴리 - L - 라이신과 C. (텍스트 : 5 g/cm2). </li><li> 취급 flasks에 cm2 당 16,000 세포의 밀도에 플레이트는 세포. </li><li> 이틀, 보충 매체 cm2 당 0.2ml (DMEM / 햄 F12 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 (ITS - X, 1 %), EGF (50 NG / ML)과 FGF2 (와 보충으로 세포를 공급 50 NG / ML)). </li><li> 2 ~ 5 일 후, 부유 세포 분야 및 중 다시 플레이트를 수집하거나, 세포 치료의 동물 모델에 이식하기 전에 그들을 떼어 놓다. </li><li> 신경 세포와 같은 세포에 후각 줄기 세포를 차별화하는 데, B - 27, 페니실린, 스트렙토 마이신, 글루타민 및 글루 탐 산염을 포함 Neurobasal 매체를 21 일 동안 그들을 육성. </li><li> 그렇다면 매 3 일마다 중간 변경합니다. 신경 세포와 같은 세포 두 시간 3 주 후에 나타납니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 비강 인간 explant - 뚫고 나올 때까 줄기 세포 것은 (그림 2A) 급속도로 나누어하고 confluency가 1-2주 이내에 도달할 수 있습니다. stemness 중 하나는 주요 기능 nestin 발현은 (그림 2B) 평가했습니다. EGF (50 NG / ML)과 FGF2 (50 NG / ML)로 보충 혈청이없는 배지와 폴리 - L - 라이신에 성장하면 후각 줄기 세포 분야 (그림 2C)을 일으키다. 혈청 함유 배지에서 재배하면 새로 도금 분야는 GFAP - 표현 세포 (~ 50 %), tubulin - 표현 전지 (~ 10-15%)과 O4 - 표현 세포 (~ 2~5%) 9 (그림을 일으키다 2D - F). 그러나, 구체 파생 세포의 운명을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, B27 및 글루 탐 산염, β - III의 tubulin (그림 2G)와 MAP2 (그림 2 시간)를 표현하는 신경 세포와 같은 세포로 비강 후각 줄기 세포의 대부분과 함께 보충 Neurobasal 배지 재배시. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 실험의 전체 계획. 후각 점막의 biopsies는 쥐 또는 인간의 비강에서 excised 수 있습니다. Explants는 뇌 질환의 생체를 식별하는 목표 비교 분자 연구 글 사용할 수 있습니다. 후각 줄기 세포를 분리 들어, 라미나의 propria 및 신경 상피 사이의 상호 작용 45 분 후에 상피가 마이크로 주걱과 제거, dispase II 효소를 방해하고 있습니다. 쥐 후각 줄기 세포는 더욱 collagenase 아이오와 라미나의 propria를 dissociating으로 선택됩니다. 뚫고 나올 때까 줄기 세포가 아니라 전체를 침략하기 전까지 인간의 조직을 위해, 후각 라미나의 propria 조각은 유리 coverslip 아래 양식입니다. 증식 후, 적절한 배지를 사용하여 후각 줄기 세포 분야를 생성할 수 있습니다 또는 신경 세포와 같은 세포로 구분. 후각 줄기 세포는 내가하는 데 사용할 수있는) 수리 뇌 질환이나 외상 또는 II)는 중추 신경계 질환의 분자 마커를 식별합니다. 삽화는 Servier 의료 예술의 도움으로 만들어집니다. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 문화와 비강 인간의 후각 줄기 세포의 분화. 혈청 함유 배지 재배시 라미나 propria explant (A) 밖으로 성장하는 인간의 줄기 세포가 빠른 속도로 나누어 있습니다. 줄기 세포는 stemness 마커 nestin (B)를 표현한다. 폴리 - L - 라이신 - 코팅 플라스틱에 도금 및 EGF와 FGF2와 보충 혈청이없는 배지에서 재배 때, 후각 줄기 세포 분야 (C)를 생성합니다. 영역 - 파생 세포, 혈청 함유 배지에서 도금 때 상승을주고 GFAP - 표현 세포 (~ 50 %), tubulin - 표현 전지 (~ 10~15%)과 O4 - 표현 세포 (~ 2~5%) 9 (DF). B27 및 글루 탐 산염과 보충 Neurobasal 문화 매체 재배 때, 그들은 β - III의 tubulin (G)와 MAP2 (H)를 표현하는 신경 세포와 같은 세포로 구분.

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R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

기술 neurodevelopmental 및 neurodegenerative 질병뿐만 아니라 병적인이나 상처를 입었 머리를 수리하기위한 도구의 원인으로 설치류와 인간의 후각 점막 임상 연구에 유용한 모델을 만들고 제시. 프로토콜은 비교적 간단하고 쉽게 경험 세포 생물학에 의해 수행하실 수 있습니다. 생검과 문화 기술에 대한 성공률이 높습니다. 중요 단계 <ul><li> 쥐 후각 점막의 수집을 위해, 그것은 안락사와 후각 조직의 최종 절단 사이에 10 분 시간 제한을 초과하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 쥐 후각 라미나의 propria의 분리는 일반적으로 10 분 후에 이루어집니다. collagenase IA의 인큐베이션. 그렇지 않다면, 우리는 라미나의 propria 플로트의 undissociated 비트, 200g에 그것을 원심 분리기 및 기계식 잘 새에있는 세포를 replating 전에 파스퇴르 피펫을 사용하여 부동 라미나을 떼어 놓다있는 뜨는 다음날 수집하는 것이 좋습니다. 이미 첨부된 세포가 들어있는 첫 번째 잘은 신선한 문화 매체로 가득 차 있습니다. </li><li> 쥐 조직보다 작고있는 인간 라미나의 propria을 위해, 우리는 효소 분해를하지 않는 것이 좋습니다. 조직은 슬라이스하고 각 explant은 플라스틱 접시의 바닥과 유리 coverslip 사이에 삽입됩니다. 성공적인 문화 그의 두께 범위는 200에서 500 μm의에 explants를 포함합니다. </li></ul> 가능한 수정 <ul><li> 현재 프로토콜은 약간 체외에서 후각 신경을 생성하기 위해 수정할 수 있습니다. 그 목적은 신경 상피가 제거되지 않고 전체 후각 점막은 맥일웨인 헬기 (200 μm의 두께)와 슬라이스입니다. 각 explant는 접시에 도금 부분적으로 한 시간 만이라도 말린 후 FCS 함유 배지와 rehydrated 있습니다. 첫 번째 일 게시 도금 동안, 상피와 mesenchymal 세포는 explant 밖으로 성장. 그러면 신경 세포의 progenitors이 세포 레이어의 상단에있는 마이 그 레이션 및 신경으로 구분됩니다. </li><li> 후각 줄기 세포의 정화는 유동세포계측법를 사용하여 얻을 수 있습니다. 특정 표면 마커는 특성화 용지 11 출판 목록에서 검색할 수 있습니다. </li><li> 이식 실험을 위해, 그것은 후각 줄기 세포 GFP - 양성 쥐의 변형을 사용할 수 있습니다. 이 쥐의 스트레인 (스프 라그 돌리, eGFP PGK 프로 모터에 의해 구동)는 ITERT (낭트, 프랑스)에서 사용할 수 있습니다. 인간의 후각 줄기 세포에 GFP 유전자를 삽입을 위해, 우리는 lentivirus 감염을 기반으로 메서드를 사용합니다. </li><li> 본 논문은 후각 외의 뜻 mesenchymal 줄기 세포에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나,이자, 후각​​ ensheathing 세포의 다른 세포 유형은 동일한 조직에서 정화 수 있습니다. 우리는 그들의 수집 및 정화 1,17위한 방법을 설명하고 우리는 하반신 마비 환자 18 단계 I / IIa 임상 시험에 대한 인간의 비강 ensheathing 세포를 사용합니다. </li><li> mesenchymal 줄기 세포의 superfamily의 일원으로서, OE - MSCS는 adipocytes, osteocytes 및 myocytes 11로 차별화하는 데 적절한 문화 조건 하에서 수 있습니다. </li></ul> 미래 애플 리케이션 <ul><li> 우리는 이미 자폐증, 양극성 장애, 가족 dysautonomia, 파킨슨병, 알츠하이머 질환과 정신 분열증 환자의 2-7 세포와 분자 이상 현상을 연구하기 위해 인간의 후각 biopsies를 사용했습니다. 이론적으로, 모든 뇌 질환은 비강 biopsies 또는 주변 후각 줄기 세포를 사용하여 공부하실 수 있습니다. </li><li> 설치류와 인간의 비강 후각 줄기 세포는 이미 기억 상실증, 파킨슨병, 달팽이 손상 및 척수의 외상 12-16의 동물 모델에 이식할되었습니다. 그것은 알츠하이머 질환, 뇌 국소 빈혈, 다중 경화증의 동물 모델에 이들 세포를 이식하는 상상할 수있다. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td colspan="3"> 쥐에서 후각 점막 수집 </td></tr><tr><td> DMEM / 햄 F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Pentobarbital 나트륨 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 게이지 바늘 </td><td> Terumo </td><td> NN - 2613R </td></tr><tr><td> 집게 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 인간의 후각 점막 수집 </td></tr><tr><td> 딱딱한 내시경 </td><td> 칼 Storz 또는 리차드 울프 의료 </td><td></td></tr><tr><td> Lidocaine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에피네프린 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut 사골 포셉 </td><td> 칼 Storz 또는 리차드 울프 의료 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 후각 줄기 세포의 분리 </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> 로체 </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 주걱 </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IA </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> 유리 coverslip </td><td> Knittel 글레이저 </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> 영역의 형성과 분화의 연결 </td></tr><tr><td> 폴리 - L - 리신 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P - 1274 </td></tr><tr><td> 인슐린 트랜스페린 셀레늄 (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 236 - EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 233 - FB </td></tr><tr><td> Neurobasal 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B - 27 세럼 - 무료 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> 글루 탐 산염 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

비강에있는 후각 점막은 감지 냄새 담당하고있다. 또한 외부 환경에 노출된 모든 살아있는 개인에 쉽게 액세스할 수있는 유일한 신경 조직이다. 결과적으로,이 조직은 병리 두뇌의 분자 변이를 식별하거나 세포 치료 성인 줄기 세포를 분리 목표로 사람에 대해 고유합니다. 뇌 질환의 분자 이상은 종종 사후 수집 신경 조직 샘플을 사용하여 연구하고 있습니다. 그러나,이 물질은 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 반면, 후각 점막이 쉽게 액세스할 수 있으며 냄새 1 감각의 손실없이 안전하게 biopsied 수 있습니다. 따라서, 후각 점막 하나 개발 공부를 할수있는 성인 인간 (예 : 자폐증, 정신 분열증) 2-4 또는 neurodegenerative (예 : 파킨슨병, 알츠하이머) 4,5 질병에 &#39;열린 창문&#39;을 제공합니다. 후각 점막은 neurogenesis 3,7에 비교 분자 연구 4,6 또는 체외 실험에서 중 사용할 수 있습니다. 후각 상피는 또한 바이러스성 감염의 세균 오염에 의해 손상되는 이들을 대체하기 위해 매일 새로운 뉴런을 생산하는 신경 조직이다. 이것은 영구적인 neurogenesis는 progenitors에 의해 지속뿐만 아니라 즉 점막, neuroepithelium 및 기본 라미나 propria의 80-10의 두 구획 내에 거주하는 세포를 줄기입니다. 우리는 최근 라미나의 propria에있는 성인 줄기 세포를 정화하는 방법을 개발하고, 그들이 밀접하게 골수 mesenchymal 줄기 세포 (BM - MSC)와 관련된 것을 증명하는 데 후, 우리는 (그들 후각 외의 뜻 mesenchymal 줄기 세포라는 OE - MSC) 11. 흥미롭게도, BM - MSCS 비교할 때, OE - MSCS는 높은 확산 속도, 고가 clonogenicity 및 신경 세포로 차별화하는 경향을 표시합니다. 우리는 정신 분열증과 파킨슨병 4의 새로운 후보 유전자를 공개하기 위해 전담 연구를 수행하는 이러한 특성을 이용했다. 우리와 다른 사람도 OE - MSCS는 척수의 외상 12,13, 달팽이 피해가 14 후 또는 파킨슨병 15 기억 상실 16 동물 모델에 세포 치료에 대한 후보자를 보증하는 것으로 나타났습니다. 본 연구에서는, 우리는 쥐가과 인간의 후각 점막을 생검하는 방법을 제시한다. 수집 후, 얇은 판의 propria은 효소 효소 또는 효소 이외의 방법을 사용하여 정화하는 상피와 줄기 세포를 분리합니다. 후각 줄기 세포를 정화하는 것은 다음 중 다수 재배하고 액체 질소에 틀었 또는 분야를 형성 유도 또는 신경 세포로 구분하실 수 있습니다. 이러한 줄기 세포는 또한 비교 omics (proteomic, 게놈 transcriptomic, epigenomic) 연구에 사용될 수 있습니다.

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Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

우리는 여기서 쥐, 인간의 비강 충치의 후각 점막 조직 검사로 연구를 해왔하는 방법을 설명합니다. 이러한 biopsies은 뇌 질환의 분자 변이를 식별하거나 뇌 손상 / 질병의 동물 모델에 세포 이식을 위해 활용할 수 multipotent 성인의 줄기 세포를 분리하거나 사용할 수 있습니다.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

30.5K 조회수.  Aix Marseille University. 우리는 여기서 쥐, 인간의 비강 충치의 후각 점막 조직 검사로 연구를 해왔하는 방법을 설명합니다. 이러한 biopsies은 뇌 질환의 분자 변이를 식별하거나 뇌 손상 / 질병의 동물 모델에 세포 이식을 위해 활용할 수 multipotent 성인의 줄기 세포를 분리하거나 사용할 수 있습니다.

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Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

모쓰 강한 시스템에서 Electrophysiological 측정

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

연구

신경과학

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

모델링 성상 세포종 병인<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...