Autoren möchten John Frey und Ben Peterson für Moskito Aufzucht danken. Wir danken auch Christine Davis und Gary Radice für die Hilfe bei hemocyte Aufnahmen. Diese Arbeit wurde von der University of Richmond Arts &amp; Science Sommer Stipendium für AA Qayum und Dozenten zu gewähren A. Telang finanziert.

1. Vorbereitung im Vorfeld der hemocyte Sammlung <ol><li> Bereiten Sie eine Hämolymphe Verdünnungsmittel Lösung, die von 60% Schneider-Medium, 10% fötalem Rinderserum (FBS), und 30% Citratpuffer besteht (Antikoagulans, 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM Zitronensäure, pH 4,5) 11. Machen Sie 1,0 ml Aliquots, die bei -20 ° C gelagert werden können Verwenden Sie jedes Aliquot nur einmal (siehe Materialien). </li><li> Bereiten Objektträger aus Glas (75 x 25 x 1 mm) durch Scoring ein 1 cm Durchmesser-Kreis an einem Ende mit einem Glas-Ätz-Tool. Alternativ können Objektträger mit zwei vorgeätzt Kreisen erworben (z. B. Fisher Scientific oder EMS Quellen) werden. Ein Glas Folie pro Moskito benötigt werden. </li><li> Einen Satz von Glas-Nadeln (siehe Materialien) zog nach dem folgenden vorgeschlagenen Einstellungen (Sutter Instruments, Modell P-87): <table border="1"><tbody><tr><td> Hitze Ramp 5 </td></tr><tr><td> Pull: 45 </td></tr><tr><td> Vel: 75 </td></tr><tr><td> Zeit: 175 </td></tr><tr><td> Pressure 580 </td></tr></tbody></table> Unter den empfohlenen Einstellungen auf dieser Abzieher, konstruieren wir Nadeln, die sich um 500 mm sind in der gesamten Länge mit Schaft Längen von ca. 3 mm. Pre-gezogen Nadeln können auch gekauft (zB Tritech Research) werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Mikroinjektor im Vorfeld der hemocyte Sammlung <ol><li> Legen Sie eine gezogen Nadel in die Mikroinjektor Nadelhalter nach den Anweisungen des Herstellers. Backfill die Mikroinjektor (siehe Materialien) Schlauch, Spritze und zog Glasnadel mit Mineralöl nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 3. Vorbereitung der weiblichen Mücken im Vorfeld der hemocyte Sammlung <ol><li> Saugen Sie 15 erwachsene Weibchen in kleine Massivkäfig Containern, die in Kontakt mit dem Eis werden können. Tauchen Käfig mit Stechmücken in Eis tief genug, so dass gesamte Höhe des Käfigs und alle Seiten sind in Kontakt mit dem Eis. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Mücken auf die Kälte ausgesetzt werden. Kalte betäuben Mücken für ca. 8 Minuten oder bis sie nicht mehr mobil. </li><li> Legen Sie eine Mücke auf eine Depression gleiten. Diese Folie wird als Standort für Injektionen dienen. </li></ol> 4. Hemocyte Sammlung <ol><li> Stellen Sie die Mikroinjektor aufnehmen 12 ul Hämolymphe Verdünnungsmittel in gezapftes Nadel und Injektion Lösung in der Mücke zwischen der siebten und achten Abdominalsegmente. Etwa 3 Mücken können mit 3-3,5 ul der insgesamt 12 ul Volumen aufgenommen injiziert werden. Die Mücke sollte vorsichtig vorhanden sein, mit einer Pinzette gehalten, während Injektion durchgeführt wird. Ein kleines Volumen des Lösungsmittels sollte an der Spitze der Nadel bleiben, so dass Mineralöl aus der Injektion zu verhindern. Nach der Injektion der Bauch aussehen sollte &quot;gefüllt&quot; oder aufgedunsen. </li><li> Legen Sie injizierten Moskitos in einem separaten sauberen Behälter auf Eis für 5 min zu erholen. Die Inkubationszeit des Antikoagulans Verdünnungslösung innerhalb der Mücke wird dazu beitragen, zu vertreiben Haemocyten Einhaltung interner Gewebe. Im Durchschnitt 3 bis 5 frische Mücken können während jeweils 5 min Erholungszeit injiziert werden. </li><li> Nach 5 Minuten der Erholung, snip off Beine, Flügel und die Spitze des Bauches (an der achten Segment) jeder Mücke ein zu einer Zeit mit Mikro Schere. Dies sollte in der Erholung Tasse auf Eis gelegt, durchgeführt werden. Das Abschneiden der Beine und Flügel reduziert die Wahrscheinlichkeit von Skalen wird die Sammlung Dias übertragen. Achtung: nicht die Beine abgeschnitten und Flügeln zu nah an Brust-Bindungsstellen in der Nähe, oder Sie das Risiko einer weiteren Öffnungen für Hämolymphe zu entkommen. Hämolymphe sollte nur durch die Öffnung an der Spitze des Bauches geschaffen gesammelt werden. </li><li> Wash ein Glas geätzt Objektträger mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit einem Kimwipe. Positionieren Sie eine injiziert und Mücke wieder auf der Folie auf dem äußeren Rand der geätzten Kreis. Set Mikroinjektor abholen 12 ul frisches Hämolymphe Verdünnungsmittel und injizieren dieses Volumen in der Mücke in der lateralen Seite der Mesothorax. Deliver meisten, aber nicht das gesamte Volumen des Lösungsmittels (ca. 8 bis 10 ul), so dass Mineralöl aus der Injektion zu verhindern. Ein kleines Volumen des Lösungsmittels sollte an der Spitze der Nadel bleiben. </li><li> Position der Mücke, so dass der Schnitt abdominale Öffnung am Rand der 1-cm-Kreis ist. Nach der Injektion der verdünnten Hämolymphe sollte innerhalb der markierten Fläche gesammelt werden. Sobald die Nadel aus der mesothoracic Injektionsstelle entfernt wird, wieder hält der Mücke zwischen den beiden Armen der Zange und drücken Sie leicht den Bauch mit den Zangen der Hämolymphe auf die geätzte Kreisfläche zu lenken. </li><li> Lassen verdünnt Hämolymphe auf Folie für ca. 10 Minuten oder bis sie sichtbar trocken trocken. </li></ol> 5. Hemocyte Fixierung und Färbung <ol><li> Stain jede Folie einzeln mit HEMA3 7 (siehe Materialien): Dip slide in Fixativ 5 Mal für jeweils 1 Sekunde Zeit, Dipslide in Lösung, die ich 3 mal für jeweils 1 Sekunde, und schließlich, dip slide in Lösung II 3-mal für jeweils 1 Sekunde. Spülen Sie die Rückseite der Folie mit DI-Wasser. Die Vorderseite der Folie sollte nicht gespült werden. Blot-dry der Vorderseite der Folie außerhalb geätzt Kreis mit gefärbten Gewebeschnitten. </li><li> Bewerben Eindeckmedium (z. B. Shur / Mount oder Polymount) rund um die geätzten Zentrum und Ort ein Deckglas darauf. Drücken Sie leicht auf das Deckglas (25 x 25 mm), so dass die Montage Medium breitet sich der gesamte Bereich durch das Deckglas (einschließlich geätzt Kreis mit gefärbten Gewebeschnitten) abgedeckt. Lassen Sie die Objektträger für mindestens 3 Stunden oder über Nacht trocknen lassen. Blutzellen sollten innerhalb von 2 Wochen nach der Entnahme für eine optimale Visualisierung und Bildgebung betrachtet werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele für feste und HEMA3 gefärbten Blutzellen aus einer Aedes aegypti erwachsenen weiblichen gesammelt sind in Abbildung 1A-C gezeigt. Abbildung 1A zeigt eine hemocyte, dass wir als prohemocyte auf seine geringe Größe, kugelig-runde Form und hohe nukleare um Zytoplasma-Verhältnis (550x Vergrößerung) 11 Basis identifiziert. Abbildung 1B zeigt eine hemocyte als oenocytoid auf seiner Kugelform und hohe Zytoplasma der nuklearen Verhältnis (550x Vergrößerung) klassifiziert. Schließlich zeigt Abbildung 1C ein Granulozyten-type hemocyte (550x Vergrößerung). Granulozyten sind detailliertere in der Natur und sind eher amöboiden in Gestalt und Verhalten als sie sich an Glasflächen. Mit bisher veröffentlichten Kriterien für hemocyte Eingabe-und Recovery-11, ergab unsere Sammlung Methode eine ähnliche Zahl von insgesamt Blutzellen und wir ebenfalls festgestellt, dass Granulozyten bilden den größten Anteil der insgesamt Haemocyten 11 (Abb. 2). <img src="/files/ftp_upload/2772/2772fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Lichtmikroskopische Aufnahmen einer repräsentativen HEMA3 fixiert, gefärbt prohemocyte (A), oenocytoid (B) und Granulozyten (C) aus einer Ae. aegypti erwachsenen Weibchen. C = Cytoplasma, N = Kern G = Granulat. <img src="/files/ftp_upload/2772/2772fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Insgesamt zählt ± SE aller Blutzellen und Granulozyten pro Weibchen Mücke durch unsere Hämolymphe Verdünnung und Erhebungsmethode erhalten.

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	<li>Enayati, A., Hemingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+management:+past,+present,+and+future.">Malaria management: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).</li><li>Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+transgenic+mosquitoes+on+dengue+virulence+to+humans+and+mosquitoes.">The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes.</a> The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).</li><li>Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+studies+on+the+innate+immunity+of+disease+vectors.">Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors.</a> Insect Sci. 15, 15-15 (2008).</li><li>Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+basal+lamina+thickness+and+dengue-1+virus+dissemination+rates+in+laboratory+strains+of+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae).">Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).</li><li>Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+infection+responses+in+the+haemocytes+of+the+mosquito,+Aedes+aegypti.">Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).</li><li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+cellular+immune+response.">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15, 1-1 (2008).</li><li>Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+mortality+in+immune+challenged+mosquitoes+(Aedes+aegypti)+correlates+with+a+decrease+in+haemocyte+numbers.">Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers.</a> Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).</li><li>Chen, C. C., Laurence, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+on+humoral+encapsulation+of+microfilariae:+establishment+of+technique+and+description+of+reaction.">In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction.</a> International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).</li><li>Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dirofilaria+immitis:+effects+on+hemolymph+polypeptide+synthesis+in+Aedes+aegypti+during+melanotic+encapsulation+reactions+against+Microfilariae.">Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae.</a> Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).</li><li>Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+innate+immune+response+by+the+mosquito+Aedes+aegypti+is+mediated+by+hemocytes+and+independent+of+Gram+type+and+pathogenicity.">The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity.</a> Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).</li><li>Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+from+the+mosquitoes+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).</li></ol>

Die hemocyte Sammlung hier beschriebene Methode ist aus bisher publizierten Methoden modifiziert und erlaubt es, saubere Vorbereitung der Blutzellen von Aedes Moskitos mit weniger Schritten zu isolieren. Während unser besonderes Interesse liegt in der Charakterisierung hemocyte Populationen in Aedes Mücken, glauben wir, diese Technik auf andere Mücke Gruppen angewendet werden kann, nachdem erste Versuche durchgeführt werden, um eine ordnungsgemäße Injektionsvolumina zu bestimmen. Unser Protokoll ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Schneider-Medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0146 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Hema3 Fleck-Kit </td><td> Fischer </td><td> 123-869 </td><td></td></tr><tr><td> Glasnadeln (Borosilikatglas mit Filament) </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78 bis 10 </td><td> 1,0 OD und 0.78mm ID </td></tr><tr><td> Needle Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-87 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroinjektor </td><td> Tritech Forschung </td><td> Minj-PD </td><td></td></tr><tr><td> Nadelhalter </td><td> Tritech Forschung </td><td> Minj-4 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito aedes aegypti

Moskitos sind Vektoren für eine Reihe von Krankheitserregern wie das Gelbfieber-Virus, Malaria Parasiten und Filarien. Laboratories untersuchen anti-Erreger Bestandteile des angeborenen Immunsystems in Krankheitsüberträgern Arten in der Hoffnung, von transgenen Mücken, die refraktär gegenüber solchen Pathogenen 1, 2 sind. Das angeborene Immunsystem der Moskitos besteht aus mehreren Zeilen Defense 3. Erreger, die die Barriere durch das Epithel ausgekleideten Moskito Mitteldarm 4 verhängten entkommen geben Sie die Hämolymphe und Begegnung zirkulierenden Blutzellen, wichtige zelluläre Komponenten kapseln und zu verschlingen Krankheitserreger 5, 6. Forscher haben keine Beweise für hämatopoetische Gewebe in Mücken gefunden und aktuelle Hinweise darauf, dass die Anzahl der Blutzellen bei Erwachsenen Entstehung ist fest und Zahlen können tatsächlich als die Mücke im Alter von 7 zurück. Die Fähigkeit, richtig zu sammeln und zu identifizieren Blutzellen von medizinisch wichtigen Insekten ist ein wesentlicher Schritt für das Studium der zellulären Immunität. Allerdings stellen die geringe Größe der Mücken und der begrenzten Volumen von Hämolymphe eine Herausforderung für das Sammeln Immunzellen. Zwei etablierte Methoden für die Erfassung Mücke Blutzellen gehören Vertreibung der Hämolymphe von einem Schnitt Rüssel 8, und das Volumen Verschiebung (Perfusion), in der Salzlösung in die membranöse necklike Region zwischen dem Kopf und Thorax (dh, Gebärmutterhals) und der perfundierten Hämolymphe gesammelt injiziert aus einem zerrissenen Öffnung in einem distalen Bereich des Bauches 9, 10. Diese Techniken sind jedoch durch eine geringe Erholung der Blutzellen und mögliche Verunreinigungen durch Fett Körperzellen bzw. 11 begrenzt. In jüngerer Zeit eine Methode bezeichnet als hohe Einspritzdruck / Recovery verbesserte Rückgewinnung von Immunzellen durch die Verwendung von gerinnungshemmenden Puffer bei gleichzeitiger Reduzierung Ebenen kontaminierender Skalen und inneren Geweben 11. Während diese Methode ermöglicht ein verbessertes Verfahren zur Sammlung und Aufbewahrung Blutzellen für Primär-Kultur, bringt es eine Reihe von Einspritzung und Sammeln Schritte, die nicht notwendig sind, wenn der nachgeschaltete Ziel ist es, zu sammeln, zu fixieren und färben Blutzellen für die Diagnostik. Hier zeigen wir unsere Methode der Erhebung Moskito Hämolymphe, dass die Einfachheit der Durchblutung kombiniert mit gerinnungshemmenden Pufferlösungen anstelle von Kochsalzlösung, mit der Genauigkeit der hohe Einspritzdruck Techniken zur sauberen Vorbereitung der Blutzellen in Aedes Moskitos zu isolieren.

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A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Eine vereinfachte, aber genaue Methode zu sammeln und zu färben Mücke Blutzellen beschrieben. Unsere Methode kombiniert die Einfachheit der Perfusion mit der Genauigkeit der hohe Einspritzdruck Techniken zur sauberen Vorbereitung der Blutzellen in Aedes Moskitos zu isolieren. Diese Methode erleichtert Studien erfordern Kenntnisse über die Arten von Blutzellen und deren Hülle und Fülle.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

15.3K Aufrufe.  University of Richmond. Eine vereinfachte, aber genaue Methode zu sammeln und zu färben Mücke Blutzellen beschrieben. Unsere Methode kombiniert die Einfachheit der Perfusion mit der Genauigkeit der hohe Einspritzdruck Techniken zur sauberen Vorbereitung der Blutzellen in Aedes Moskitos zu isolieren. Diese Methode erleichtert Studien erfordern Kenntnisse über die Arten von Blutzellen und deren Hülle und Fülle.

Serie: A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Forschung

Biologie

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Entwicklungsbiologie

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Immunologie und Infektion

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the foundation to develop novel strategies for pest control. Here, a series of methods are described that are routinely utilized to determine the functional roles of neuropeptides and other neuronal factors (i.e., biogenic amines) on the excretory system of the mosquito, Aedes aegypti. The Malpighian tubules (MTs), responsible for primary urine formation, can continue functioning for hours when removed from the mosquito, allowing for fluid secretion measurements following hormone treatments. As such, the Ramsay assay is a useful technique to measure secretion rates from isolated MTs. Ion-selective microelectrodes (ISME) can sequentially be used to measure ion concentrations (i.e., Na+ and K+) in the secreted fluid. This assay allows for the measurement of several MTs at a given time, determining the effects of various hormones and drugs. The Scanning Ion-selective Electrode Technique uses ISME to measure voltage representative of ionic activity in the unstirred layer adjacent to the surface of ion transporting organs to determine transepithelial transport of ions in near real time. This method can be used to understand the role of hormones and other regulators on ion absorption or secretion across epithelia. Hindgut contraction assays are also a useful tool to characterize myoactive neuropeptides, that may enhance or reduce the ability of this organ to remove excess fluid and waste. Collectively, these methods provide insight into how the excretory system is regulated in adult mosquitoes. This is important because functional coordination of the excretory organs is crucial in overcoming challenges such as desiccation stress after eclosion and before finding a suitable vertebrate host to obtain a bloodmeal.

This protocol outlines methodologies behind the Ramsay assay, ion-selective microelectrodes, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) and in vitro contraction assays, applied to study the adult mosquito excretory system, comprised of the Malpighian tubules and hindgut, to collectively measure ion and fluid secretion rates, contractile activity, and transepithelial ion transport.

Untersuchung der Aktivität von Neuropeptiden und anderen Regulatoren des Ausscheidungssystems bei der erwachsenen Mücke

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Sammeln von Hämolymphe von kleinen Gliederfüßern

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

Autor im Rampenlicht: Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Gewinnung von Hämolymphe von kleinen Gliederfüßern  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti

Zusammenfassung

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