Name: extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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Wir sind dankbar, Dr. Robert Heinzen für die Bereitstellung von Aktien von mCherry exprimierenden Coxiella Burnetii. Wir danken Dr. Luis Teixeira für Bereitstellung von Wirbellosen irisierende Virus 6 und Bloomington Stock Center für die Bereitstellung fliegen Bestände. Dieses Projekt wurde teilweise von NIH Grant R00 AI106963 (A.G.G) und der Washington State University finanziert.

1. ex Vivo -Infektion
<ol><li>Medium und Ausrüstung<ol>
<li>Unter sterilen Bedingungen bereiten frische Drosophila Hemocyte isolieren Medium (DHIM) mit 75 % Schneider Drosophila mit 25 % mittlere fetalen Bovine Serum (FBS) und Filter Sterilisieren sie.</li>
		<li>Layer-2-3 Stücke von 10 x 10 cm Paraffin Film unter einem Stereomikroskop.</li>
		<li>Bereiten Sie die Glas-Kapillare. Legen Sie die Kapillare Puller-Heizung auf 55 % des Maximums. Ziehen Sie das Kapillarrohr zu einer scharfen Spitze von ca. 10 µm.</li>
		<li>Abgleich der Kapillare mit Mineralöl.</li>
		<li>Montieren Sie gefüllte Kapillarröhrchen auf der Nanoinjector (Abb. 1A), und öffnen Sie verschmolzen Kapillarrohr Tipp durch Abbruch der Tipp mit der Pinzette (Abbildung 1B). Der Außendurchmesser der Spitze sollte 100 µm für die einfache Aufnahme von den Hemocytes.</li>
		<li>Werfen Sie so viel Öl wie möglich von der Spitze des Kapillarrohr aus, dann füllen Sie mit DHIM. Für einfache Visualisierung von der Grenze bis genommen Hämolymphe und das Öl, enthalten eine Luftblase zwischen Öl und DHIM (Abbildung 1B").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hämolymphe Extraktion<ol>
<li>Wählen Sie 3rd instar Drosophila Larven von innen Wand von Lebensmitteln Fläschchen vorsichtig mit Pinzette und legen Sie sie in einem 100 µm-Sieb (Abbildung 1C). 3rd Instar Larven befinden sich ca. 3-6 Tage nach fruchtbaren Eiablage durch eine erwachsene Frau. Hinweis: Diese Experimente verwendet den Genotyp, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ}, 2P {w+ mC= FH-2xEGFP} AH2, da Hemocytes von diesen Tieren erhöhte grünes fluoreszierendes Protein (EGFP) zur Identifizierung der Zellen durch Mikroskopie Unterstützung zum Ausdruck bringen.</li>
		<li>Larven 5 mL sterilem Wasser übergießen und schütteln Sie das Sieb 5 S. Ort das Sieb auf Aufgabe wischen, um das überschüssige Wasser entfernen (Abbildung 1C").</li>
		<li>Übertragen Sie die Larven in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Betäuben sie mit CO2 -Gas für 5 s (Abbildung 1D).</li>
		<li>Legen Sie die Larven auf Paraffin-Film unter dem Stereomikroskop mit Dorsalseite nach oben (Abb. 2A).</li>
		<li>Stelle das Glas leicht auf die Larven hinteren Körpers Kapillare zu befestigen und zu stören die hintere Nagelhaut öffnen mit feinen Spitzen Pinzette (Abbildung 2B).</li>
		<li>Lassen Sie die Hämolymphe auf Paraffin-Folie (Abbildung 2C) fließen.</li>
		<li>Machen Sie einen Pool von Hämolymphe einschließlich Hemocytes von 20-50 Larven zu einem Zeitpunkt auf dem Paraffin-Film.</li>
		<li>Nehmen Sie gepoolten Hämolymphe mit dem Glas Kapillare auf den Nanoinjector (Abb. 2D). Hinweis: Sollte ca. 10-20 µL der Hämolymphe.</li>
		<li>Werfen Sie die Hämolymphe zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL DHIM (Abb. 2E).</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4) - 1.2.9) für jede Charge der Larven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Anzahl der Hemocytes.<ol>
<li>Pipette 5 µL 0,4 % Trypan blau-Lösung in einem 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch, die toten Zellen zu beflecken. Vorsichtig mischen Sie, DHIM und Hemocytes in der 1,5 mL Tube mit einer Pipette und übertragen Sie 5 µL DHIM einschließlich Hemocytes 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch und mischen Sie vorsichtig.</li>
		<li>Pipette 10 µL Zellen aus der 1:1 Trypan blau: Hemocyte Mischung in der Hemocytometer.</li>
		<li>Die Anzahl der Leben Hemocytes, die sind nicht befleckt mit Trypan blau in jeder der 4 Ecken Felder von der Hemocytomter und die Konzentration von Hemocytes pro Milliliter Formel zu berechnen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> wo X ist die Konzentration von live Hemocytes pro Milliliter; a, b, C und d sind die Anzahl der lebenden Zellen (wie von Trypan blau Ausgrenzung bestimmt) in je 4 der Felder in der Hemocytometer gezählt. Division durch 2 von der Gesamtzahl der Zellen gezählt ist aufgrund der Verdünnung von 1:1 der Zellen mit Trypan blau. Mit Trypan blau gefärbten Zellen gelten als tot.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex-vivo Infektionen<ol>
<li>Bestimmen Sie die Anzahl der Vertiefungen mit Zellen basierend auf Zeitpunkte und biologische gesät werden repliziert benötigt für jedes Experiment. 5.0 × 104 Hemocytes sind wünschenswert, dass RNA und Protein Reinigung nach Infektion.</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen der Erreger Lager mit DHIM verdünnt werden, für eine Infektion mit der folgenden Formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> wo Multiplizität der Infektion (MOI) ist die Anzahl der Viren oder Bakterien auf Wunsch pro Zelle. Hinweis: MOI verwendet richtet sich nach den einzelnen Experiment und Tests durchgeführt. Hier, 10 Genom-äquivalente (GE) / Zelle von C. Burnetii, 10 KBE/Zelle von Listerienoder 1 TCID50/cell von IIV6 diente.</li>
		<li>Bereiten Sie 500 µL des Erregers Medium für jede Vertiefung einer 24-Well-Platte durch virale oder bakterielle Volumen in einem Rohr das richtige Volumen der DHIM hinzufügen.</li>
		<li>Platz 12 mm Runde Deckglas (Nr. 1-Dicke) in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte.</li>
		<li>Die DHIM einschließlich der Hemocytes in Vertiefungen von einer 24-Well-Platte aufgeteilt.</li>
		<li>Hemocytes in einem gut 500 µL des Erregers Medium hinzufügen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 x g für 5 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 28 ° c Alle 15 min leicht kippen die Platte von hinten, vorne, dann links nach rechts für 5 s von Hand.</li>
		<li>Nach 1 h Einmarsch/Anlage Schritt 1.4.8) sanft pipette aus dem Erreger Medium waschen die Hemocytes mit frischen DHIM und füllen Sie ihn mit 500 µL des frischen DHIM.</li>
		<li>Die gewünschte Zeit inkubieren Sie der infizierten Hemocytes. In diesen Experimenten, C. Burnetii- oder IIV6-infizierten Hemocytes sind für 24 h und Listeriainkubiert-infizierten Hemocytes sind für 1, 2 oder 4 h inkubiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. in-Vivo -Infektion
<ol><li>Infektion<ol>
<li>Warm Drosophila Obst Saft nährbodenplatte bei Raumtemperatur für 15 min. Platten erfolgt wie oben beschrieben20.<ol>
<li>700 mL Wasser und Autoklaven 30 g Agar-Agar hinzufügen es 40 Minuten.</li>
			<li>0,5 g Methylparaben in 10 mL von absoluten Ethanol auflösen.</li>
			<li>300 mL Fruchtsaftkonzentrat Methyl-Paraben-Lösung hinzufügen.</li>
			<li>Schnell die Saft-Konzentrat in die autoklaviert Agar Lösung mischen und 5 mL in 10 × 35 mm Petrischalen zu verzichten.</li>
			<li>Nachdem die Platten für 15 min abgekühlt haben, speichern sie bei 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie 3rd Instar Larven folgende Schritte 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>Legen Sie die Hefe-Paste auf einer nährbodenplatte. Machen Sie einen feinen Schnitt in der Agarplatte, wo die Larven migrieren können, um zu vermeiden, Trocknen(Abbildung 3). Montieren Sie eine 0,001 mm Spitzen Wolfram Nadel mit Zange mit Paraffin-Film (Abbildung 3B, C) zu halten.</li>
		<li>Hohe Titer mCherry 50 µL Pipette auszudrücken -C. Burnetii (5,95 × 109 GE/mL) auf das Paraffin unter dem Stereo-Mikroskop und Auflegen der Larven in den Pool von Bakterien.</li>
		<li>Legen Sie die Larven in den Pool von Bakterien. Stechen Sie die Larven mit einer Wolfram-Nadel (Abbildung 3D). Übertragen Sie die Larven auf einer nährbodenplatte (Abbildung 3E).</li>
		<li>Die verbleibenden Erreger Medium auf die Agarplatte zu übertragen und die Dichtplatte mit Paraffin Film.</li>
		<li>Halten Sie die Larven auf der Platte in feuchter Luft bis die gewünschte Zeit nach der Infektion (Abbildung 3F). In diesem Experiment, C. Burnetii-infizierten Larven sind auf dem Teller für 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hämolymphe Extraktion und Beschichtung von hemocytes<ol>
<li>Bereiten Sie das Medium und die Ausrüstung nach Schritt 1.1).</li>
		<li>Platz 12 mm Runde Deckglas (Nr. 1-Dicke) in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte. Pipette 500 µL DHIM in den Brunnen.</li>
		<li>Auszug der Hämolymphe aus infizierten Larven, die folgenden Schritte 1.2.4) - 1.2.8).</li>
		<li>Werfen Sie die Hämolymphe in den nun folgenden Schritt 2.2.2).</li>
		<li>2.2.3) wiederholen und 2.2.4) für mehrere Batches von Larven.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 x g für 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Visualisierung
<ol><li>Fixierung und Färbung<ol>
<li>Entfernen Sie nach Abzug der Hemocytes an die Runde Abdeckung Glas in den Brunnen zu begleichen vorsichtig das Medium aus jedem Brunnen.</li>
		<li>Fügen Sie sanft 200 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung der sesshaften Hemocytes. Inkubieren Sie die Hemocytes für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die 4 % PFA und sanft fügen Sie 200 µL PBS mit 0,1 % Triton X-100 und 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die PBS und fügen Sie sanft 200 µL 1 × 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die DAPI-Lösung, und fügen Sie sanft PBS in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Fallen Sie 10 µL des Mediums antifade Montage auf einen Glas-Objektträger.</li>
		<li>Nach dem Entfernen der PBS aus jedem Brunnen, entfernen Sie das Deckglas aus den 24-Well-Platte mit feinen Spitzen Pinzette. Sanft lege das Deckglas auf den antifade Eindeckmittel auf den Objektträger mit dem Hemocytes nach unten.</li>
		<li>Lassen Sie die Folie trocken indem man sie in die dunkle Nacht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocal Imaging<ol>
<li>Konfigurieren Sie die confocal Mikroskop für drei Farbe Imaging DAPI, EGFP und mCherry. Verwenden Sie die folgende Einstellung: DAPI Erregung (ex) 405 nm, Emission (Em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, Em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, Em 597-700 nm.</li>
		<li>Legen Sie die Probe auf das Mikroskop und den Fokus auf die Probe mit einem 63 X / 1.4 numerische Apertur (NA) Ziel. Suchen Sie nach gewünschten Hemocytes in das Sichtfeld für die Bildgebung.</li>
		<li>Stellen Sie Laser Power und Detektor Gewinne um angemessene Belichtung der Probe zu erreichen. Überprüfen Sie mehrere Z-Flugzeuge, um sicherzustellen, dass die Belichtung für die gesamte Probendicke geeignet ist.</li>
		<li>Die oberen und unteren Position auf der z-Achse eine ganze Hemocyte zu finden. Legen Sie diese Positionen als die Anfangs- und Endpositionen für Z-Schnitt.</li>
		<li>Verwenden Sie nur Scan Zoom Bild des Bereichs, in den Hemocyte. Zoom-Faktoren von 3 X werden häufig verwendet.</li>
		<li>Sammeln Sie die Bildserien mit geeigneten Auflösung z. B. 1024 x 1024 Pixel in der XY-Ebene und 0,3 µm-Abstand in der Z-Dimension.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D Modell-Rekonstruktion Hinweis: Open-Source-Software ist vorhanden, die viele der unten beschriebenen Funktionen für 3D Modell Rekonstruktion ausführt.<ol>
<li>Importieren Sie die Z-geschnittene Serie Bilddatei in die Software zugeordnete confocal Mikroskop für 3D-Modell Wiederaufbau.</li>
		<li>Wählen Sie eine Zelle zeigt Co Lokalisierung der Kerne gebeizt mit DAPI und mCherry mit dem Ausdruck C. Burnetii in einem EGFP Hemocyte zum Ausdruck zu bringen. Schneiden Sie die Bildserie, um nur die einzelne Zelle enthalten.</li>
		<li>Die Option 3D Viewer die mit abgepackten Softwarealgorithmus 3D-Modell rekonstruiert. Wählen Sie die gewünschte Art der 3D Darstellung unter Blend, Oberfläche und gemischte Optionen. Bei dieser Methode werden Hemocytes, Kerne und C. Burnetii Oberflächenmodelle mit angezeigt.</li>
		<li>Beobachten Sie die 3D rekonstruierte Zelle aus verschiedenen Positionen anzeigen durch die Maustaste gedrückt halten und ziehen den Cursor über den Bildschirm. Passen Sie die Zelle Ausrichtung und Position der modellierten Lichtquelle um das Bild zu optimieren. Andere Optionen für Deckkraft, Minimum und maximale Schwelle, Specular, Ambient, Shineness und Gamma bestehen, um das Bild zu optimieren.</li>
		<li>Nehmen Sie Querschnitte durch das Modell mit Clipping und speziellen Befehlen, um den inneren Inhalt der Hemocyte zu visualisieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Antrag auf gen und/oder Protein-Analyse
<ol><li>Nach der Infektion mit IIV6 und Listeria, lösen Sie Zellen für nachfolgende qRT-PCR oder Western-Blot Analyse wie zuvor beschrieben,21 und folgende Angaben des Herstellers. Hinweis: Siehe die Tabelle der Materialien für die Primer für qRT-PCR und die Antikörper für Western-Blot.</li>
	<li>Analysieren Sie PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese, wie zuvor beschrieben22, um die richtige Länge des verstärkten Produktes zu gewährleisten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+of+Drosophila.">The immune response of Drosophila.</a> Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).</li><li>Regan, J. 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J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+first+complete+DNA+sequence+of+an+invertebrate+iridovirus:+coding+strategy+of+the+genome+of+Chilo+iridescent+virus.">Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.</a> Virology. 286 (1), 182-196 (2001).</li><li>Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single-cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells.">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).</li><li>Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Binding+of+the+Conserved+Transcription+Factor+Grainy+Head+to+its+Target+Genes+Throughout+Drosophila+melanogaster+Development.">Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development.</a> Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).</li><li>Yang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomes+of+lineage-specific+Drosophila+neuroblasts+profiled+by+genetic+targeting+and+robotic+sorting.">Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting.</a> Development. 143 (3), 411-421 (2016).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Immune+Circuits+by+Linking+CRISPR-Pooled+Screens+with+Single-Cell+RNA-Seq.">Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.</a> Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).</li><li>Karaiskos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+embryo+at+single-cell+transcriptome+resolution.">The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.</a> Science. 358 (6360), 194-199 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Um besser zu verstehen, wie Wirtszellen infiziert werden, ist es wichtig, die Lokalisation des Erregers in den Zellen zu klären, vor allem, wenn zuvor noch nicht getesteten Erreger und Zelle Typ Kombinationen4experimentieren. Während Studium der zellulären Antwort Kaskade nach Infektion produktive Erreger Invasion anzeigen kann, gilt die Kombination von bildgebenden und zellulären Antwortdaten Erreger Invasion und Infektion nachweisen. Während Berichte zeigen 2D-Bilder Erreger Invasion in die...

Drosophila Melanogaster ist eine gut etablierte Modellorganismus zur Erforschung der angeborenen Immunität1. Im Rahmen der angeborenen Immunantwort spielen Hemocytes eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf Krankheitserreger Herausforderung. Hemocytes sind entscheidend für die Kapselung von Parasiten, sowie eine wichtige Funktion bei der Bekämpfung des Erregers durch phagocytic Aktion während Pilz-, Virus- und bakterielle Infektion2,3.
Um den Host angeborene Immunantwort auf pathogene mikrobielle Infektion am besten zu verstehen, ist es wichtig, wie der Erreger dringt in Wirtszellen während der Infektion zu visualisieren. Diese Visualisierung trägt zum Verständnis des Mechanismus der Invasion. Zusammen mit Details der Erreger intrazelluläre Lokalisation und die zelluläre Antwort können diese Daten Aufschluss über der Wirtsantwort zur Infektion und die zellularen Organellen die Mikrobe interagiert. 3D-Modell Wiederaufbau nach Bildgebung durch Mikroskopie kann hilfreich, um die genaue Lage von Krankheitserregern in Wirtszellen zu bestimmen. In dieser Studie visualisieren wir die Invasion von Coxiella Burnetii (C. Burnetii), dem Erreger der q-Fieber, eine Zoonose, die eine ernsthafte für die menschliche und tierische Gesundheit in primären Drosophila Hemocytes Bedrohung. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Drosophila sind anfällig für die Sicherheitsstufe 2 Nine Mile Phase II (NMII) Klon 4 Stamm von C. Burnetii und, dass diese Sorte in Drosophila4replizieren kann darauf hinweist, dass Drosophila einsetzbar als Modellorganismus C. Burnetii Pathogenese zu studieren.
Frühere Studien haben Hemocytes verwendet, um angeborene Immunantwort des Wirtes zu untersuchen. Hemocytes wurden verwendet für morphologische Beobachtungen5,6,7, morphometrische Analyse2,8, Phagozytose Analyse2,3, qRT-PCR-2 , 9, Immunopräzipitation10,11, immunofluorescent Analyse10,12, Immunostaining13, Immunoblotting3,10, 11 und Immunohistochemistry9,14. Obwohl Drosophila S2 Zellen auch für verschiedene in-vitro- Experimente zur Verfügung stehen, ändern Immortalisierung und potenzielle bereits bestehende Virusinfektion ihr Verhalten15,16. Die Verwendung von Primärzellen im Gegensatz zu einer immortalisierte Zelllinie wie S2-Zellen, kann für das Studium der angeborene immune Funktion in einem System repräsentativer für den gesamten Organismus. Darüber hinaus kann die Infektion von Hemocytes in Vivo, vor der Extraktion, die Zellen, die Interaktion mit anderen Host Proteine und Gewebe, einen Vorteil gegenüber der Gewinnung von Hemocytes vor der ex-Vivo -Infektion. Eine Reihe von verschiedenen Methoden wurden genutzt, um eine ausreichende Anzahl von Hemocytes in kurzer Zeit zu den Hemocytes lebendig8,17,18,19zu erhalten.
In dieser Studie stellen wir Ihnen eine Methode zur Hemocytes von Drosophila 3rd Instar Larven für pathogene mikrobielle Infektion mit C. Burnetii, Listeria Monocytogenes (Listerien) oder Wirbellosen schillernden extrahieren Virus 6 (IIV6). Wir beschreiben die Methoden zur in Vivo und ex Vivo Hemocyte Infektionen. In Vivound ex Vivo-infizierten Hemocytes waren mit der konfokalen Mikroskopie visualisiert und verwendet zum Erstellen von 3D Modellen von C. Burnetii Invasion. Darüber hinaus verwenden die Extraktion Protokoll, ex-Vivo-infizierten Hemocytes dienten für gen- und Protein-Expression Assays. Insbesondere war um zu prüfen, inwieweit der Infektion mit IIV6 und Listeria, total RNA oder Protein isoliert aus den Zellen zur qRT-PCR oder Western-Blot Analyse. Zusammen genommen, das Protokoll bietet Methoden, um schnell hohe Zahl von Hemocytes von 3rd Instar Larven und Beweise, dass primäre Hemocytes infiziert, in Vivo und Ex Vivosammeln, sind eine geeignete Plattform für mikrobielle Erreger Infektion Studien und anwendbaren nachgeschalteten Analysen wie Mikroskopie, Transkriptom und Proteomik.

<table><tbody><tr><td>Schneider&#039;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&amp;nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filter (0.22 &amp;micro;L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Strainer (100 &amp;micro;m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Capillary puller</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;delivery apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Coxiella burnetii&lt;/em&gt; - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; fruit juice plates</td><td>Cold Spring Harbor Protocols</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Methyl paraben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch&#039;s 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Petri dishes, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)</td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Holding forceps</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Antifade mounting medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3D imaging reconstruction software</td><td>Leica</td><td>LASX with 3D visualization module</td><td>3.3)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>strain: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 &amp;micro;g/ml streptomycin at 30 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA degradation</td></tr><tr><td>cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA synthesis</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3&#039;</td></tr><tr><td>IIV6_193R_R</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3&#039;</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_fwd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_rev</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green qRT-PCR reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes antibody</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Actin antibody produced in rabbit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis

Während die pathogenen Infektion von Drosophila Melanogaster, Rolle Hemocytes eine wichtige bei der Immunantwort in die Infektion. Ziel dieses Protokolls ist es daher, Entwicklung eine Methode um die Invasion der Erreger in einem bestimmten immun Fach fliegen, nämlich Hemocytes zu visualisieren. Mit der Methode, die hier vorgestellten, bis zu 3 × 106 live Hemocytes von 200 Drosophila 3rd Instar Larven in 30 min für Ex-Vivo -Infektion erhalten. Alternativ kann die Hemocytes infizierte in Vivo durch Injektion von 3rd Instar Larven gefolgt von Hemocyte Extraktion bis zu 24 h nach der Infektion. Diese infizierten Primärzellen gefixt, gebeizt und abgebildet mit der konfokalen Mikroskopie. Dann wurden aus den Bildern endgültig Erreger Invasion zeigen 3D-Darstellungen generiert. Darüber hinaus hochwertige RNA für die qRT-PCR für den Nachweis des Erregers mRNA folgenden erhalten werden Infektionen und ausreichend Protein aus diesen Zellen für Western-Blot Analyse extrahiert werden können. Zusammengenommen, präsentieren wir Ihnen eine Methode zur definitiven Versöhnung der Erreger Invasion und Bestätigung der Infektion mit bakterieller und viraler Erreger-Typen und eine effiziente Methode für die Extraktion von Hemocyte genug live Hemocytes von Drosophila zu erhalten Larven für ex-Vivo - und in-Vivo -Infektions-Experimente.

Zu sammeln Hemocytes für Ex-Vivo -Infektion, Leben bis zu 3 × 10 wurden 200 Drosophila 3rd Instar Larven6 Hemocytes entzogen. Um unsere Methode zu entwickeln, wurden eine Reihe von verschiedenen Techniken versucht. Einzelne Larven Dissektion bis zu 1,5 Stunden dauern würde wurden, und durchschnittlich ~ 8000 Zellen mit dieser Methode18, von denen meisten nicht bis zum Jahresende Sammlung noch am Leben waren. Als nächstes ...

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Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Diese Methode zeigt, wie Erreger Invasion in Insektenzellen mit dreidimensionalen (3D) Modellen zu visualisieren. Hemocytes von Drosophila Larven infiziert wurden mit viralen oder bakteriellen Erregern, Ex Vivo oder in Vivo. Infizierte Hemocytes wurden dann fixiert und für die Bildgebung mit einem confocal Mikroskop und anschließende zelluläre 3D-Rekonstruktion befleckt.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

11.6K Aufrufe.  Washington State University. Diese Methode zeigt, wie Erreger Invasion in Insektenzellen mit dreidimensionalen (3D) Modellen zu visualisieren. Hemocytes von Drosophila Larven infiziert wurden mit viralen oder bakteriellen Erregern, Ex Vivo oder in Vivo. Infizierte Hemocytes wurden dann fixiert und für die Bildgebung mit einem confocal Mikroskop und anschließende zelluläre 3D-Rekonstruktion befleckt.

Serie: Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Immunologie und Infektion

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Biologie

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

Drosophila melanogaster Larven-Injektionsprotokoll

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

Störung der Nagelhaut: Eine Methode zum Sammeln von Hämolymphe aus Drosophila-Larven

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (Fruchtfliege)

Larve

Larval Lymph Gland Dissection: Isolating the Drosophila Hemocyte-Producing Organ

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the Drosophila lymph gland&#8212;the primary site of hematopoiesis in the fly larva&#8212;and shows an example protocol to dissect and mount the organ for immunohistochemistry and fluorescent imaging.

Dissektion der Lymphdrüsenlarve: Isolierung des Drosophila-Hämozyten-produzierenden Organs

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes ...

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in