Dieses Protokoll beschreibt Techniken, die von Kleintierphysiologen verwendet werden können, um die Rolle von Neuropeptiden und anderen hormonellen Faktoren aufzuklären, die das Verdauungs- und / oder Ausscheidungssystem regulieren. Diese Techniken ermöglichen Messungen von biologischen Proben in Mikrogröße, die sonst mit Techniken, die speziell für größere Tiermodelle entwickelt wurden, einschließlich beispielsweise Nagetieren und Teleus, nicht möglich wären. Diese Methode kann einen Einblick in die endokrine Regulation des Darms geben, einschließlich des Transports von Epithel- und glatter Muskulatur, die mit dem Magen-Darm-Trakt bei Insekten und bei ähnlich großen Nicht-Insektenarten assoziiert ist.
Farwa Sajadi, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird die Nieren-Tuben-Verfahren des Insekts demonstrieren. Darüber hinaus wird ein ehemaliger Doktorand aus meinem Labor Aryan Lajevardi die hindgutfokussierten Protokolle demonstrieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Ramsay- und Kontraktionsassays-Gerichte für die Experimente.
Verwenden Sie Pipetten und füllen Sie Vertiefungen mit bis zu 20 Mikrolitern Lösung. Für unstimulierte Kontrollen füllen Sie die Vertiefungen mit 20 Mikrolitern Aedes Kochsalzlösung Schneiders Medium. Sobald alle Bohrlöcher gefüllt sind, gießen Sie hydratisiertes Mineralöl in die Assay-Schale, bis die Bohrlöcher und Minutien-Pins untergetaucht sind.
Nachdem Sie den Tubulus in den Brunnen getaucht haben, nehmen Sie das proximale Ende des Tubulus mit einer Pinzette auf, entfernen Sie es aus dem Badetröpfchen und wickeln Sie das Ende um den Stift. Wickeln Sie den Tubulus zweimal um den Stift, wobei die Länge des im Badetröpfchen verbleibenden Tubulus mit den anderen Tubuli übereinstimmt. Um eine natriumselektive Mikroelektrode herzustellen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um die Elektrode mit 100 Millimolar-Natriumchlorid zu füllen.
Stellen Sie sicher, dass sich die Verfülllösung bis zur Spitze der Elektrode füllt. Wenn Luftblasen auftreten, streichen Sie vorsichtig mit der Mikroelektrode oder entfernen Sie die Lösung und füllen Sie sie wieder auf. Tauchen Sie eine 10 Mikroliter Pipettenspitze in die natriumselektive Ionophorlösung.
Richten Sie die Elektrode senkrecht zur Pipette aus, legen Sie dann einen behandschuhten Finger über die Unterseite der Spitze, um Druck zu erzeugen und einen kleinen Tropfen Ionophor auszustoßen. Berühren Sie den Ionophortropfen vorsichtig an der Mikroelektrodenspitze und achten Sie darauf, ihn nicht zu brechen. Füllen Sie ein kleines Becherglas auf halbem Weg mit 100 Millimolar Natriumchlorid und legen Sie etwas Modelliermasse auf die Innenseite an der Oberseite des Becherglases.
Nachdem der Ionophor aufgenommen wurde, legen Sie die Elektrodenspitze auf die Wand des Becherglases und lassen Sie die Spitzen im Natriumchlorid. Bewahren Sie ISME im Becherglas auf, bis es gebrauchsfertig ist. Um die ISME-Referenzelektrode herzustellen, füllen Sie eine Elektrode mit 500 Millimolkaliumchlorid auf und lagern Sie sie in einem Becherglas.
Beschichten Sie die Elektrodenspitzen mit einer Lösung von etwa 3,5% Polyvinylchlorid, gelöst in Tetrahydrofuran, um eine Verschiebung des Ionophors beim Eintauchen in Paraffinöl zu vermeiden. Um die Natriumelektrode zu kalibrieren, legen Sie 10 Mikroliter Tröpfchen Natriumchlorid-Standardkonzentrationen auf den Rand der Ramsey-Schale mit den inkubierten Malpigh-Tubuli. Legen Sie die Standardtröpfchen zwei Zentimeter voneinander entfernt mit der höheren Konzentration darauf.
Führen Sie sowohl die Referenzelektrode als auch die ionenselektive Elektrode über die Chloridsilberdrähte ein und befestigen Sie sie sicher mit Elektrodenhaltern, die an Mikromanipulatoren befestigt sind. Navigieren Sie beide Elektroden mit den Mikromanipulatoren zum 200 Millimol-Natriumchlorid-Tröpfchen und stellen Sie sicher, dass die Elektrospitzen den Boden der Schüssel nicht berühren. Schalten Sie das Elektrometer ein, um die Aufnahme zu starten und den Messwert stabilisieren zu lassen.
Notieren Sie den Messwert und fahren Sie mit dem nächsten Standard fort. Nachdem Sie messungen der Flüssigkeitssekretionsrate durchgeführt haben, bewegen Sie die Referenz- und ionenselektiven Elektroden vorsichtig mit den Mikromanipulatoren in das sezernierte Tröpfchen. Schalten Sie die Aufzeichnung ein und lassen Sie den Messwert stabilisieren, und nehmen Sie dann auf.
Schalten Sie den Ionen-/Polarographieverstärker IPA-2, das Lichtmikroskop und die Computer ein. Legen Sie die natriumselektive Mikroelektrode auf einen Halter, der aus einem Silberchloriddraht besteht, und befestigen Sie sie in der Buchse. Entfernen Sie eine Referenzelektrode mit dem Kaliumchlorid aus dem Becherglas, legen Sie einen Finger an ein Ende und neigen Sie die Glaskapillar zu diesem Finger, um zu verhindern, dass das Agar herausfällt.
Legen Sie vorsichtig ein Ende in den Halter, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen bilden. Wenn eine Blase vorhanden ist, entfernen Sie die Referenzelektrode, füllen Sie den Halter mit drei molaren Kaliumchloriden auf und wiederholen Sie den Vorgang. Setzen Sie den Elektrodenhalter in die Buchse ein.
Nach der Kalibrierung sezieren Sie das Organ. Legen Sie die Poly-L-Lysin-Schale mit der sezierten Probe auf das Mikroskoptisch und führen Sie die Spitze der Referenzelektrode in die Kochsalzlösung ein. Tauchen Sie die Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode in die Kochsalzlösung und achten Sie darauf, die Spitze nicht zu brechen.
Verwenden Sie die manuellen Einstellknöpfe, um die Mikroelektrodenposition einzustellen, während Sie unter das Lichtmikroskop schauen. Stellen Sie die vertikale Position der Mikroelektrode so ein, dass sich ihre Spitze auf der gleichen Ebene wie das Organ oder Gewebe befindet, und drehen Sie dann den Motorschalter, um dies zu aktivieren. Bewegen Sie die Mikroelektrode mit den Pfeiltasten des Computers horizontal in eine Position, die drei Millimeter vom Gewebe entfernt ist, um Hintergrundaufnahmen zu messen.
Wenn Sie fertig sind, beginnen Sie mit der Aufnahme, indem Sie F5 drücken, und erhalten Sie fünf Messungen der Hintergrundaktivität. Bewegen Sie die Mikroelektrodenspitze nahe an das Gewebe und achten Sie darauf, das Organ nicht zu durchbohren. Reduzieren Sie die Tastentreffempfindlichkeit, um die Mikroelektrodenspitze zwei Mikrometer direkt nach rechts zu platzieren, senkrecht zum Gewebe.
Erhalten Sie drei Aufzeichnungen vor Ort entlang des Rektalpolsters, um den Ort der größten Ionenaktivität zu identifizieren, und erhalten Sie dann Baseline-Kochsalzlösungsmessungen an der Stelle, die die größte Aktivität aufweist. Um Hinterdarmkontraktionen aufzuzeichnen, füllen Sie eine der Vertiefungen in der Schale mit einem bekannten Volumen von Aedes-Kochsalzlösung. Nach der Sezierung den sezierten Hinterdarm, der am Mittleren Darm befestigt ist, vorsichtig in einen Brunnen in einer anderen Schüssel geben und darauf achten, dass das Ileum nicht eingeklemmt wird.
Tauchen Sie den Darm in die Kochsalzlösung im Brunnen ein und legen Sie Minutien-Stifte in den Mittleren Darm und das Rektum. Das Ileum sollte nicht unter Spannung stehen und spontane Kontraktionen, die an der Pylorusklappe am vorderen Ileum entstehen, sollten beobachtet werden. Schließen Sie die Videokamera an das stereoskopische Mikroskop an.
Legen Sie dann die Schale mit dem sezierten Organ unter das Mikroskop und nehmen Sie zwei Minuten lang ein Video auf. Die Anwendung von DH31 gegen unstimulierte Malpighian-Tubuli führt zu einer signifikanten Erhöhung der Flüssigkeitssekretionsrate, was seine Rolle als harntreibendes Hormon bei Aedes-Moskitos bestätigt. Wenn Tubuli mit AedaeCAPA-1 behandelt werden, wird eine Verringerung der Sekretionsrate in DH31 stimulierten Malpighian Tubuli beobachtet.
Ionenselektive Elektroden wurden verwendet, um Natriumkonzentrationen in den sezernierten Tröpfchen zu messen. Die Behandlung von DH31 an den MTs hatte keinen Einfluss auf die Natriumkonzentration im sezernierten Tröpfchen. Mit der Anwendung von AedaeCAPA-1 wurde die Natriumkonzentration in der sezernierten Flüssigkeit jedoch signifikant erhöht.
Darüber hinaus führte DH31 im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollen zu einer signifikant höheren Natriumtransportrate, während AedaeCAPA-1 diesen Anstieg der DH31-stimulierten Tubuli aufhob. Die SIET wurde verwendet, um Veränderungen im Natriumtransport entlang des rektalen Padepithels von erwachsenen weiblichen Moskitos zu beurteilen. Ein Leucokinin-Analogon wurde verwendet, um Veränderungen in der Natriumabsorption zu untersuchen, was zu einer vierfachen Abnahme der Natriumabsorption im Vergleich zur Salzkontrolle führte.
Um die Rolle eines Neuropeptids Pyrokinin2 auf die Ileummotilität zu beurteilen, wurde ein Rhodnius prolixus-Analogon verwendet, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es den im Mückenileum angereicherten A.aegypti PK2-Rezeptor aktiviert. Im Vergleich zu den Ausgangswerten hemmt PK2 signifikant die Ileumkontraktionen. Bei der Durchführung eines Ramsay-Assays mit Malpigh-Tubuli und der Messung der Ionen- oder Flüssigkeitssekretionsraten ist es unerlässlich, dass die Tubuli während der Dissektion oder während des Transfers in die Assay-Schale nicht beschädigt werden.
Nach dem Ramsay-Assay können spezifische Membrantransporter entweder pharmakologisch oder molekular mit umgekehrten genetischen Techniken angesprochen werden, um ihren spezifischen Beitrag zum transepithelialen Transport von gelösten Stoffen im einfachen Epithel zu erkennen.
