Diese Arbeit wurde von der NSF gewähren MCB-0817827 unterstützt.

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine etablierte Technik, die all die thermodynamischen Parameter (Affinität, Enthalpie und Stöchiometrie) eine bindende Wechselwirkung in einem Experiment bestimmen kann. 1 ITC arbeitet durch Titration ein Reaktionspartner in eine zweite Reaktionspartner unter isothermen Bedingungen. Das gemessene Signal wird die freiwerdende Wärme oder auf Wechselwirkung (Bindung) der beiden Reaktionspartner aufgenommen. Eine Reihe von Injektionen durchgeführt werden und die Wärme Signal gegen Null gehen als der limitierende Reaktionspartner gesättigt. Fitting der Isotherme gibt die thermodynamischen Parameter. Mehrere Bewertungen zur Verfügung, die beschreiben, die Instrumentierung sowie die Mathematik der Datenerhebung und-analyse. 2,3 Während andere Kalorimeter zur Verfügung stehen (vor allem die ITC 200 mit kleinen Volumina), hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für den VP-ITC hergestellt von MicroCal (jetzt Teil von GE Healthcare). 1. Vorbereitung der Proben <ol><li> Um die Makromolekül-und Ligand in Puffer vorzubereiten, müssen einige potenzielle Probleme angegangen werden. Genaue passt erfordern richtige Konzentration des Makromoleküls, die Arten, die in der Regel geht in die Messküvette des ITC und Ligand, die Arten in der Injektionsspritze. Da einige Proteine ​​aggregieren an der hohen Konzentrationen der Spezies in der Injektionsspritze benötigt wird, ist meistens das Protein in der Probe Zelle geladen. Die optimale Makromolekül-Konzentration von &quot;c&quot;, das Produkt der vorhergesagten Affinität des Systems, die schätzungsweise mit orthogonalen Methoden vor der Verwendung ITC werden können, und die gesamte Makromolekül-Konzentration, bestimmt, wo c = K a * [M]. Optimale Werte für c-Bereich von 1 bis 10, 1 wenn es möglich ist, genaue Daten für schwach-bindenden Systemen unter bestimmten experimentellen Bedingungen mit c-Werte unterhalb der unteren Grenze erhalten. 4 So muss der Makromolekül-Konzentration mit dieser Serie von bestimmt werden c-Werte im Auge (dh für einen K a 10 6 M -1, Makromolekül-Konzentrationen von 1 bis 10 uM verwendet werden sollte). Vorkenntnisse in der Bindungsaffinität des Systems kann zur Minimierung der Protein für ITC durch eine bessere Gestaltung der ITC Experiment verwendet. Die Konzentration des Liganden sollte groß genug sein (7-25 fach konzentrierter als die K d für die Schwächsten Ligandenbindungsstelle), so dass eine Sättigung eintritt in den ersten Drittel bis die Hälfte der Titration. Genaue Anpassung an die Daten erfordert auch die Sättigung des Signals. Für Systeme mit höheren Bindungsaffinität, sollte eine niedrigere Ligandenkonzentration verwendet, um die Sättigung zu früh in die Titration zu vermeiden, was wird ungenau passt zu geben. Sobald die Hitze der Verdünnung Steuerung (dh die Titration von Ligand in den Puffer) wurde aus der Titration abgezogen, sollte die Enthalpie bei Sättigung gegen Null gehen. </li><li> Weil kleine Molekül Verunreinigungen können zu artifactual Signale in der ITC-Messungen zu geben, ist es am besten, wenn möglich, daß das Makromolekül und Ligand erschöpfend gegen Puffer dialysiert werden. Alternativ können Säulenchromatographie, Entsalzen Spin-Säulen, oder Puffer Austausch zentrifugalen Filter (z. B. Centricons) verwendet, um den Puffer des Makromoleküls zu ändern. Wenn der Ligand ist ein kleines Molekül, kann es unter Verwendung der Dialyse-Puffer nach dem Makromolekül wurde dialysiert wurde oder durch Dialyse gegen Dialysemembranen mit Abschaltungen für kleine Moleküle (dh 100-500 Da für eine Spectra / Por Float-A-Lyzer werden ). Unterschiede in der Zusammensetzung des Puffers zwischen Ligand und Makromolekül-Lösungen kann zu Artefakten aus der Hitze der Verdünnung von Verunreinigungen in den Proben Signal. Nach der Vorbereitung, überprüfen Sie, ob der pH-Wert des Puffers, Makromolekül-und Ligand match (± 0,05 pH-Einheiten) als Artefakte in der Enthalpie kann entstehen durch Protonierung Wirkungen Puffer. 5 Achten Sie darauf, genügend vorzubereiten jeder Spezies. Für Dreifachversuche und einer Verdünnung Kontrolle, wird die Menge des benötigten Materials von der ITC abhängen. Aber für die meisten ITC Instrumente, die ungefähr 2 ml Volumen Probe-Zellen haben, werden mindestens 6-7 ml Makromolekül-Lösung benötigt werden, und kann bequem in 15 ml Falcon-Röhrchen vorbereitet werden. Für 300 ul Injektionsspritzen, sollte 1-2 ml der Lösung ausreichend sein, und kann entweder in Falcon-Röhrchen oder Mikrozentrifugenröhrchen vorbereitet werden. </li><li> Staub und andere Partikel können Artefakte in der Grundlinie der ITC Thermogramm verursachen. Es ist zwingend notwendig, dass sie vor der Ausführung des Experiments entfernt werden. Nach der Vorbereitung der Probe Stammlösungen sollten die Proben in Reaktionsgefäße für 5 Minuten bei 8000 bis 14.000 RPM zu Pellets Partikel in der Lösung zentrifugiert werden. Entfernen Sie den Überstand, darauf achten, daß das Pellet stören, und legen Sie sie in ein neues Falcon / Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn Reduktionsmittel benötigt werden, um reduzierte Cysteine ​​zu halten, verwenden geringen Konzentrationen und frische Vorräte an β-mercaptoethanol, TCEP (Tris (2-Carboxy-) phosphin) oder Dithiothreitol zu minimieren Artefakte durch Reduktionsmittel Oxidation. Auch die Gegenwart von organischen Lösungsmitteln in der Puffer (gemeinsam für einige kleine Moleküle Liganden, Methanol oder DMSO brauchen kann, um löslich sein) verursachen Signal Artefakte. Werden organische Lösungsmittel für den Liganden benötigt werden, dann das Makromolekül Lösung muss auch die gleiche Konzentration auf jedes Signal aus der Hitze der Verdünnung des organischen Lösungsmittels zu vermeiden. Leichte Unterschiede in Zusammensetzung des Puffers zwischen Ligand und Makromolekül durch Cosolventien sind Salze oder pH-Wert während der Vorbereitung der Proben möglich. Am besten ist es, die Verdünnung des Liganden in der Probe Puffer oder der Probenpuffer in das Makromolekül überprüfen, um sicherzustellen, dass die Wärme-Signale auf Grund von Unterschieden in den Buffer-Inhalt verursachen keine Daten, die ausschließlich von Artefakten. </li><li> Überprüfen Sie die Konzentrationen der Makromolekül-und Ligand sorgfältig mit Hilfe von Techniken geeignet, um Ihr System (wie Absorptionsmessungen, HPLC, kolorimetrische Assays BCA-Assays für Proteine, etc.), um ihre genauen Konzentrationen erfassen. Unterschiede in der tatsächlichen und der Konzentration verwendet, um die Isotherme passt zu Fehlern in der Stöchiometrie, Enthalpie und Bindungsaffinität aus dem Experiment bestimmt. Es ist üblich, Degas die Proben, um zu signalisieren Artefakte durch Luftblasen oder Freisetzung von gelösten Gasen, die während der Titration, besonders bei höheren Temperaturen zu vermeiden. </li></ol> 2. Einrichtung des Tests <ol><li> Sicherstellen, dass die Messzelle und Injektionsspritze nach dem Protokoll des Herstellers sind vor der Beladung des Makromoleküls und Ligand gereinigt. Spülen Sie die Küvette zwei-oder dreimal mit 1,8 ml destilliertem Wasser mit dem Hamilton-Spritze (verwenden Sie Sorgfalt bei der Hamilton-Spritze als das Fass leicht defekt ist oder die Nadel verbogen). Next spülen Sie die Probe Zelle mehrmals mit 1,8 ml Puffer. Laden Sie die Probenzelle mit 1,8 ml des Makromolekül-Lösung, wobei darauf zu Blasenbildung zu vermeiden. </li><li> Füllen Sie die Referenzzelle mit destilliertem Wasser. Für die meisten Puffer, ist destilliertes Wasser in Ordnung, als der Referenz-Lösung verwenden. Doch für Puffer mit besonders hoher Ionenstärke oder der Osmolalität, ist es besser, den Puffer als Referenz verwenden. </li><li> Entfernen Sie Luftblasen aus der Referenz und Probe-Zellen mit dem Hamilton-Spritze. Bewegen Sie die Nadel der Spritze up-and-down die Seiten der Zelle Klopfen keine Blasen, die an der Unterseite der Zelle und an der auch an die Spitze der Zelle kann. Entfernen Sie überschüssiges Volumen der Probe und der Referenz-Zellen. </li><li> Bringen Sie einen Kunststoff-Spritze mit dem Einfüllstutzen der Injektionsspritze mit Schlauch. Spülen Sie die Injektionsspritze mit destilliertem Wasser. Folgen Sie durch einen Puffer zu spülen. Achten Sie darauf, die Injektionsspritze vollständig durch Luft durch das System evakuiert. Stecken Sie die Nadel der Injektionsspritze in die Ligand-Lösung und zeichnen Sie die Ligand-Lösung in die Injektionsspritze, bis die ganze Spritze voll ist. Weiter Zeichnung ein wenig mehr Volumen (ca. 50 ul oder mehr) in den Hafen und die angeschlossenen Schläuche. Unmittelbar in der Nähe der Einfüllöffnung der Spritze und entfernen Sie den Schlauch und Kunststoff-Spritze. Spül-und Nachfüllen der Injektionsspritze zwei weitere Male, um Luftblasen aus der Spritze zu entfernen. Entfernen Sie die Spritze aus der Ligand-Lösung und wischen Sie die Seite mit einem Kimwipe keine Tropfen zu entfernen, darauf achten, daß die Spitze der Spritze auf die Kimwipe berühren, da dies zu Volumen aus der Spritze zu entfernen. Auch darauf achten, nicht zu klopfen oder jar die Spritze, da dies auch den Verlust des Volumens aus der Spritze führen können. Legen Sie die Injektionsspritze in die Probenzelle. </li><li> Stellen Sie die Parameter für den Betrieb der ITC. Für verbindliche Systeme mit starker Hitze-Signale wird eine große Anzahl von geringem Volumen Injektionen verabreichen mehr Datenpunkte für die Montage (zB 75 Injektionen von 3 ul). Für Systeme, die schwache Wärme-Signale haben, sind eine kleine Anzahl von großvolumigen Injektionen vorzuziehen (z. B. 33 Injektionen von 8 ul). Am häufigsten sind weniger Injektionen mit höherer Injektionsvolumina verwendet. Es kann mehrere Titrationen, um die Bedingungen, die am besten für Ihr System zu optimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die Bindungsenthalpie kann entweder exotherm oder endotherm, abhängig von der System untersucht. Leider haben einige Systeme bei schwacher Hitze Signale, so dass die Hitze der Reaktion schwer zu bestimmen. Probleme mit solchen Systemen kann möglicherweise durch eine Erhöhung der Konzentration des Makromoleküls, Änderung der Temperatur des Experiments (abhängig von der Wärmekapazität des verbindlichen Systems), und / oder Veränderung der pH-Wert oder Ionenstärke des Puffers überwunden werden. </li><li> Sehen Sie sich auch der zeitliche Abstand zwischen jeder Injektion. Es ist zwingend erforderlich, dass nach jeder Injektion von Liganden, die Systemzeit zu äquilibrieren gegeben ist und die Wärme-Signal auf den Ausgangswert zurück, bevor die nächste Injektion auftritt. Für die meisten Systeme, drei vor fünf minuten ausreichend sein sollte. Die Zeit zwischen den Injektionen sollte für Systeme, bei denen die Gleichgewichtseinstellung nicht innerhalb von fünf Minuten auftritt erhöht werden. </li><li> Da es eine gewisse Mischung wird zwischen dem Makromolekül-und Ligand-Lösungen in die Injektionsspritze, sobald es in die Probe Zelle eingefügt wird, wird die erste Injektion geben falsche Ergebnisse. Es ist am besten für kleine Volumina (zB 2 ul) für die ersten ein oder zwei Injektionen (so können sie später entsorgt werden) zu verwenden und halten Sie die nachfolgenden Injektionen auf den gewünschten Werten. </li><li> Wählen Sie die Temperatur des Experiments (mit 25 ° C ist die häufigste, aber Temperaturen zwischen 2 und 80 ° C verwendet werden kann). Es ist am besten auf eine Temperatur, die anderen Experimenten (verbindliche, Kinetik, etc.) auf der Ligand-Makromolekül-System durchgeführt Spielen wählen. Die ITC kann so eingerichtet werden, bei einer Temperatur von der Temperatur des Experiments Gleichgewicht zu bringen. Wenn das Experiment werde bei einer Temperatur über 10 ° C entfernt von Raumtemperatur durchgeführt werden, dann ist es am besten, die Equilibrierung Temperatur für das Instrument innerhalb von 5 ° C der experimentellen Temperatur einstellen. Dies verringert die Zeit, das Instrument zu ergreifen, um die Temperatur des Experiments erreicht wird. Die Rührgeschwindigkeit der Spritze muss auch berücksichtigt werden. Das Rühren ist notwendig für eine ausreichende Durchmischung der Ligand und Makromolekül während der Titration, aber einige Proteine ​​werden durch schnelles Rühren destabilisiert. Für diese Fälle sollte die Rührgeschwindigkeit auf einem relativ niedrigen Rate eingestellt werden. Sobald alle experimentellen Parameter wurden eingerichtet, dann das Experiment gestartet werden kann. </li><li> Nachdem das Experiment beendet ist, kann die ITC nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt werden. Die Lösung in der Probe Zelle am Ende des Experiments gehalten werden kann, wenn zusätzliche Experimente auf der Makromolekül-Ligand-Komplexe Mischung erwünscht sind. </li><li> Wiederholen Sie die Titration mindestens ein oder zwei weitere Male, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Führen Sie einen steuern, wo Liganden in den Puffer in die Messküvette titriert, um die Hitze der Verdünnung für den Liganden zu bestimmen. Bei einigen Systemen, wo es kooperative Bindung, zusätzliche Informationen über die verbindliche Prozess kann durch die Injektion des Makromoleküls in den Liganden gewonnen werden. Die verschiedenen Injektion Orientierungen geben können zusätzliche Informationen, die hilfreich sein können für die globale Anpassung. 6 </li></ol> 3. Analyse der Daten <ol><li> Fitting der Daten kann einfach durchgeführt werden mit Hilfe von Makros in alle Daten passend Programm (in der Regel vom Hersteller zusammen mit dem Gerät mitgeliefert). Legen Sie die erste Datei. Überprüfen Sie die rohe Thermogramm auf Anzeichen von Luftblasen oder andere Artefakte im Signal. Wenn es irgendwelche Artefakte (wie Dornen in der Baseline oder Spitzen, wenn es keine Injektion zu diesem Zeitpunkt), dann beachten Sie diese Datenpunkte, wie sie sollten entfernt werden. Anschließend laden Sie die Liganden Verdünnung Steuerdaten, und subtrahieren Sie die Liganden Verdünnung Daten aus dem Bindungsisotherme. Zu dieser Zeit, entfernen Sie alle falsche Datenpunkte, darunter die ersten ein oder zwei Datenpunkte der Titration, wo Verdünnung Artefakte auftreten (siehe Schritt 7). </li><li> Wählen Sie die Daten passende Modell (eine Bindungsstelle, zwei / mehrere Bindungsstellen, kooperative Bindung, etc.) verwendet werden, um die Daten angepasst werden. Die Daten können mit anfänglichen Vermutungen der Anpassungsparameter, Stöchiometrie (n), Enthalpie (AH) und Bindungsaffinität zu passen (K a). Wenn vorherige Kenntnis der Bindungsaffinität, oder andere Parameter, von orthogonalen Experimenten bekannt ist, dann werden diese Werte eingegeben werden können. So wird vermieden, die fit Einklemmen in lokalen Minima während der Montage. Sobald die Daten für das erste Titration passen, wiederholen Sie die Schritte 15 und 16 für den Rest der Isothermen. Alternativ können die Daten passen weltweit mit Programmen wie SEDPHAT werden. 6 SEDPHAT kann besonders hilfreich bei der globalen Anpassung von binären komplexen Datensätzen (dh Moleküle, A + B) in Kombination mit ternären Komplexes Datensätze (Moleküle A + B + C). Zum Beispiel bei der Bindung des Moleküls C zu einem AB-Komplex, es ist nicht immer klar, ob es vielleicht irgendein Signal durch Bindung von C nach A oder von B nach A (wenn A nicht vollständig gesättigt) werden. </li><li> Um sicherzustellen, dass die ITC Daten nicht artifactual, sollte die Bindungsaffinität und Stöchiometrien von ITC erhalten mit einem orthogonalen Methode verglichen werden. 7,8 Zusätzlich die ITC Enthalpie Wert auf die Enthalpie von einem van&#39;t Hoff Plot verglichen werden kann. 9 Es kann auch hilfreich sein, um unterschiedliche Konzentrationen des Liganden oder Makromolekül als der absolute Wert der Wärme-Signal mit zunehmender Makromolekül-Konzentration erhöhen sollte. Artefakte sind am ehesten entstehen, wenn die Puffer in die Zelle und die Spritze nicht aufeinander abgestimmt sind. Eine weitere Möglichkeit für Artefakte ergibt sich aus verunreinigten Proben. </li><li> Wir empfehlen, dass der Benutzer mit einfachen binären Komplexes Titrationen starten, für die es letzten verfügbaren Informationen über K d und stöchiometry. Dann, wenn zusätzliche Liganden zu binden, kann der Benutzer versuchen komplizierter ternären Komplex Titrationen, die Variation der Liganden-Konzentrationen, und vielleicht Einschalten der Spritze und Zellbestandteile. Ein Vergleich der Enthalpien für beide Wege zu ternären Komplexbildung sollten additiv sein als Enthalpie eine Zustandsfunktion ist. 10 Wieder SEDPHAT 6 wahrscheinlich sehr nützlich sein, hier ist. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein repräsentatives Beispiel für ein gut erzogener Titration für die Bindung des Cofaktors NADPH zu E. coli chromosomal Dihydrofolatreduktase (ecDHFR). Panel (A) zeigt die rohe Thermogramm; (B), mit dem Bindungsisotherme aus dem integrierten Thermogramm passen die one-site-Modell in der Origin-Software und (C) den Sitz der Isotherme mit der eine Bindungsstelle Modell aus SEDPHAT entlang Mit Fit Residuen. Von der Origin-Software, mit der einen Seite verbindliche Modell, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 uM, AH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, und DG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Passt der Daten mit Hilfe Sedphat leisten einen n von 0,94 ± 0,01, ein K d von 0,195 ± 0,013 Dm, ein AH von -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS von -13,39 kcal / mol und ΔG von -9,15 kcal / mol.

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

ITC wurde ausgiebig studieren Ligand-Interaktionen Makromolekül, 11 mit Studien, die Protein-Ligand, 12 DNA-Liganden-13 und RNA-Makromolekül 14 Studien eingesetzt. ITC kann sogar mit festen Materialien, wie Nanopartikel, dass einheitliche Suspensionen Form ausgeführt werden. 15 Weitere, ternäre Systeme, bei denen ein Ligand bereits an das Makromolekül gebunden ist und ein zweiter Ligand titriert, verwendet werden, um die Thermodynamik bestimmt werden, Beispielsweise kann die Bindung des Substrats an ein Enzym-Cofaktor-System. 7 Studien auch für Moleküle mit sehr hohen Bindungsaffinitäten, die normalerweise mehr als die Nachweisgrenze des ITC, indem Wettbewerb Bindungsassays mit schwächeren bindenden Liganden durchgeführt würde. 16 Informationen zu schwach bindende Liganden können auch durch die Konkurrenz-Assays erzielt werden. 17 Die Rolle des Wassers bei der Bindung von ITC, 18 kann zusammen mit der Abhängigkeit der Enthalpie auf Lösungsmittel Reorganisation untersucht werden. 19 Kürzlich wurden die Thermodynamik der Konformationsänderung von DnaK Varianten bei der Bindung von gemessenen ADP und ATP. 20 Protein-Protein-Assoziation von ITC untersucht werden können, wodurch Informationen über hetero-Komplexe 21 sowie auf Homo-Verein. 22 Temperatur Auswirkungen auf die Bindungsenthalpie geben die Wärmekapazität der Bindung Veranstaltung. 2 Die Zahl der Protonen aufgenommen oder freigesetzt bei der Bindung kann auch aus Experimenten in Puffern mit unterschiedlichen Enthalpien der Ionisation durchgeführt bestimmt werden. 5 Wenn zusätzliche ITC-Studien bei verschiedenen pH-Werten sind fertig, dann ist die pKa der Gruppe beteiligt potenziell bestimmt. werden 23 Zusammenfassend sind genaue Messungen der Konzentration des Makromoleküls und Ligand unerlässlich für eine gute ITC Experiment. Probenkonzentrationen müssen auch innerhalb eines geeigneten Bereichs werden, um zuverlässige Daten zu erhalten. Es sollte mit dem Puffer genommen werden, da kleine Moleküle Verunreinigungen und pH Fehlanpassungen werden Artefakte im Thermogramm verursachen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> 1,7 ml Reaktionsgefäße </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 mL Falcon-Röhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 bis 959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 ml Hamilton-Spritze </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der gesamten thermodynamischen Bild einer Bindungsreaktion. In biologischen Wissenschaften, sind makromolekulare Interaktionen wesentlich für das Verständnis der Maschinerie der Zelle. Experimentelle Bedingungen, wie Puffer und Temperatur, kann auf den jeweiligen verbindliches System untersucht zugeschnitten werden. Allerdings ist eine sorgfältige Planung notwendig, da bestimmte Ligand und Makromolekül Konzentrationsbereichen notwendig, um nützliche Daten zu erhalten sind. Die Konzentrationen der Makromolekül-und Ligand müssen genau für zuverlässige Ergebnisse ermittelt werden. Pflege muss auch bei der Aufstellung der Proben als Verunreinigungen wesentlich beeinflussen können das Experiment werden. Wenn ITC Experimenten, zusammen mit Kontrollen ordnungsgemäß durchgeführt werden, nützlich Verbindliche Auskünfte, wie die Stöchiometrie, Affinität und Enthalpie, erhalten werden. Durch den Betrieb zusätzliche Experimente unter verschiedenen Puffer-oder Temperaturbedingungen, können detailliertere Informationen über das System gewonnen werden. Ein Protokoll für die grundlegende Einrichtung eines ITC Experiment gegeben ist.

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Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Ein allgemeines Protokoll für den Einsatz von isothermen Titrationskalorimetrie, um die Bindung der Thermodynamik für biologische Systeme mit moderaten Bindungsaffinitäten Monitor dargestellt wird.

Isotherme Titrationskalorimetrie für Mess-Makromolekül-Ligand-Affinität

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

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52.5K Aufrufe.  University of Tennessee. Ein allgemeines Protokoll für den Einsatz von isothermen Titrationskalorimetrie, um die Bindung der Thermodynamik für biologische Systeme mit moderaten Bindungsaffinitäten Monitor dargestellt wird.

Serie: Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Titration von Human Coronaviren Mit einem Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

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Biologie

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Sammeln Variable-Konzentration Isotherme Titrationskalorimetrie Datasets in Auftrag, um bindende Mechanismen bestimmen

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Biochemische Titration von Glykogen<em&gt; In-vitro-</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...