Die markierte mikroskalige Thermophorese erhält effizient Dissoziationskonstanten oder KDs verschiedener biochemischer Wechselwirkungen. Dieses Protokoll und das begleitende Video geben die ungefähre Affinität von Vam7, dem einzigen löslichen SNARE-Protein in Hefe, zu Phosphatidsäure an. Auf diese Weise assoziiert sich Vam7 mit zwei Membranen, bevor es mit anderen Proteinen interagiert.
Diese Methode erhält schnell KDs für verschiedene biochemische Wechselwirkungen zu niedrigen Kosten, mit hoher Reproduzierbarkeit und mit minimalen Proteinkosten. Diese Technik eignet sich für die pharmazeutische Entwicklung der ersten Stufe, so dass leicht erhältliche KDs potenzielle Leitverbindungen bestimmen können. Bevor Sie mit einer Analyse beginnen, schalten Sie den Netzschalter auf der Rückseite des MST-Geräts ein und öffnen Sie die Steuerungssoftware.
Vergewissern Sie sich, dass der Computer an das Gerät angeschlossen ist und sich im verbundenen Status befindet, und stellen Sie den MST Before auf 3 Sekunden, den MST auf 30 Sekunden und die Fluoreszenzwiederherstellung auf nach 1 Sekunde ein. Geben Sie für jedes Kapillarröhrchen den Namen des Zielliganden, den Namen des Ligandenanalyten, die Konzentration des Ziels und die höchste Titrationskonzentration unter Verwendung des Autofill-Titrationsverhältnisses ein. Wählen Sie einen Bereich von MST-Leistungen aus und geben Sie Werte für jede Leistung ein, um die robusteste Bindungsanpassung zu testen.
Um markierte MST-Proben herzustellen, verdünnen Sie eine Vam7-Octahistidin-Lösung auf eine 200-Nanomol-Konzentration und einen NTA-Atto 647-Farbstoff auf eine 100-Nanomolar-Konzentration, beide in PBS. Mischen Sie das Vam7-Octashetidine und den NTA-Atto 647-Farbstoff in einem volumetrischen Verhältnis von 1:1 und lassen Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt sitzen. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie das Farbstoff- und Proteingemisch und lagern Sie die Lösung vor dem Gebrauch bis zu einigen Stunden bei 4 Grad Celsius.
Bereiten Sie dann die Probe vor, nehmen Sie einen gefärbten Liganden und belichten Sie den Analyten. Für die mikroskalige Thermophorese der Probe öffnen Sie das Gerät und schieben Sie das Kapillargestell heraus. Laden Sie die Probenkapillaren mit der höchsten Konzentration an Position eins in das Rack und wählen Sie den roten Kanal in der Steuerungssoftware aus.
Laden Sie dann das Rack in das Instrument. Wählen Sie dann einen Bereich der MST-Leistung aus und starten Sie die Cap Scan MST-Messung und bewerten Sie die Schichtreaktion. Thermophoretische Spuren aus einem Versuch einer 1:1-Titration von DiC8 PA ab 500 Mikromol gegen 50 nanomolare NTA-Atto 647-markierte Vam7-Domäne sind hier gezeigt.
Die anfängliche Fluoreszenz, der Zeitsprung und die Thermophorese können beobachtet werden, so dass KD aus einer oder einer Kombination dieser Messungen berechnet werden kann. Aus diesen Ergebnissen kann eine Sättigungskurve dargestellt werden, beispielsweise für die Thermophorese mit der Zeitsprungausgabe, wie in der Grafik dargestellt. Im Allgemeinen werden die MST-Ergebnisse unter Verwendung der Log-Skala unter Berücksichtigung der Proteinkonzentration bestimmt, um die Bindungsaffinität durch Auswahl des KD-Modells und Eingabe der Proteinkonzentration zu bestimmen.
Stellen Sie bei der Durchführung dieses Protokolls sicher, dass sich die Lösung in der Mitte der Kapillare befindet und dass keine Luftblasen vorhanden sind und dass die Kapillare keinen Staub oder keine Lösung an der Außenseite der Kapillare aufweist. Isotherme Titrationkalorimetrie oder Oberflächenplasmonenresonanz könnten verwendet werden, um die erhaltene experimentelle KD zu validieren. Wenn es eine potenzielle kooperative Bindung gibt, wäre ITC die nächste logische Methode, die unter Berücksichtigung der Ressourcen durchgeführt wird.
Diese Technik hat es traditionellen Biologieforschern ermöglicht, biophysikalische Screening-Techniken in ihre Forschung zur Bestimmung von Signalwegbeziehungen zu integrieren. Ein Beispiel für diese Technik ist die Zelllysase mit dem Zielprotein, das endogen exprimiert wird, wobei der GFP-Tag eine neuartige Möglichkeit ist, einen traditionellen Pulldown-Assay durchzuführen.
