Die Verwendung von Enzymen als Katalysatoren in Reaktionen kann die für die Reaktion benötigte Energiemenge reduzieren und toxische Nebenprodukte reduzieren. Der Einsatz von Enzymen in der Industrie ist jedoch begrenzt, da Enzyme nicht stabil sind und teuer sein können. Dieses Protokoll könnte die Zeit reduzieren, die es braucht, um festzustellen, ob die Bedingungen für die Enzymaktivität schädlich sind, oder ob Veränderungen am Enzym seine Stabilität erhöht haben.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie weniger Mannstunden als herkömmliche Enzymstabilitätstests benötigt. Darüber hinaus kann dieses Protokoll mit einer Vielzahl von Enzymen verwendet werden, da es mit jeder Reaktion verwendet werden kann, die Wärme freisetzt oder absorbiert. Zu Beginn 0,1 Mol-Natriumacetat-Puffer vorbereiten.
Messen Sie 800 Milliliter destilliertes Wasser in einem 1.000 Milliliter abgestuften Becher. Dann wiegen 8,2 Gramm wasserfreies Natriumacetat, und fügen Sie es in das Becherglas. Legen Sie den Becher auf eine Rührplatte.
Legen Sie eine Rührstange in das Becherglas und schalten Sie die Rührplatte ein, um sie zu rühren, bis sie vollständig aufgelöst ist. Wenn das wasserfreie Natriumacetat vollständig gelöst ist, verwenden Sie ein kalibriertes pH-Messgerät, um den pH-Wert der Lösung zu messen. Verwenden Sie eine Pipette, um 1 Molsalzsäure oder Natriumhydroxid entsprechend hinzuzufügen, um den gewünschten pH-Wert bei 4,6 zu erhalten.
Destilliertes Wasser in das Becherglas geben, bis das Gesamtvolumen 1.000 Milliliter erreicht. Um die Enzymlösung in einem 15 Milliliter-Zylinder herzustellen, messen Sie 8 Milliliter des 0,1 Mol-Natriumacetatpuffers. Dann fügen Sie die Pufferlösung in eine 15 Milliliter konische Röhre mit Enzym, und schütteln Sie kräftig, bis das Enzym sich aufgelöst hat.
Fügen Sie weitere Pufferlösung hinzu, bis das Gesamtvolumen 10 Milliliter erreicht. Bewahren Sie die Enzymlösung bei 4 Grad Celsius bis zur Anwendung auf. Um die Substratlösung vorzubereiten, wiegen Sie das Substrat ab und legen Sie es in ein 100-Milliliter-Glasbecher.
Verwenden Sie einen abgestuften Zylinder, um 20 Milliliter der Pufferlösung zu messen, und fügen Sie ihn dann in das Glasbecher hinzu. Legen Sie den Becher auf eine Rührplatte und legen Sie einen magnetischen Rührstab in den Becher. Schalten Sie die Hitze ein und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit entsprechend ein.
Das Rühren kann fortgesetzt werden, bis sich das Substrat aufgelöst hat. Gießen Sie die Substratlösung in ein 15 Milliliter konisches Rohr, und fügen Sie den zuvor vorbereiteten Natriumacetatpuffer hinzu, bis das Gesamtvolumen 45 Milliliter beträgt. Schütteln Sie das Rohr zu mischen.
Bewahren Sie die Substratlösung bei Raumtemperatur bis zur Verwendung auf. Öffnen Sie auf dem Computer ITC Run, und klicken Sie auf Setup. Klicken Sie auf Rührrate und stellen Sie auf 350 Rpm.
Überprüfen Sie, ob die Spritzengröße bei 50 Mikrolitern liegt. Stellen Sie die Temperatur auf 55 Grad Celsius ein, und drücken Sie die Aktualisierung. Warten Sie mindestens eine Stunde, bevor Sie fortfahren, damit das ITC-Instrument bei Bedarf erhitzt oder abkühlt.
Stellen Sie vor dem Laden des Enzyms sicher, dass die Referenzzelle mit 350 Mikroliter destilliertem Wasser beladen ist. Um die Probenzelle zu reinigen, füllen Sie die Ladespritze mit 500 Mikrolitern 2 Prozent Reinigungslösung. Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die Probenzelle ein, füllen Sie die Zelle und entfernen Sie die Flüssigkeit langsam mit derselben Spritze.
Entsorgen Sie die Flüssigkeit in ein Becherglas. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit 2 Prozent Reinigungslösung, dreimal mit 70 Prozent Ethanol, und waschen Sie dann zehnmal mit destilliertem Wasser. Nachdem die Probenzelle gereinigt wurde, füllen Sie die Ladespritze mit 450 Mikroliter Enzymlösung.
Setzen Sie die Nadel vorsichtig bis zum Boden der Probenzelle ein und drücken Sie den Kolben langsam auf die 100-Mikroliter-Linie, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern. Dann waschen Sie die 50-Mikroliter-Titrationsspritze dreimal mit destilliertem Wasser, indem Sie die Nadelspitze ins Wasser legen, um das Wasser langsam in die Spritze aufzunehmen, und dann das Wasser in einen Abfallbehälter geben. Spülen Sie mit der Substratlösung dreimal, um Restwasser zu entfernen.
Danach füllen Sie die Titrationsspritze mit Substratlösung, indem Sie die Lösung bis zur vollen Spritze ohne Luftblasen ziehen. Wenn sich die Spritze noch in der Substratlösung befindet, entfernen Sie den Kolben, und lassen Sie etwa 2 Mikroliter Luft in die Oberseite der Spritze eindringen und setzen Sie den Kolben wieder ein. Entfernen Sie den Burette-Griff des ITC, legen Sie die Spritze in den Burette-Griff und schrauben Sie, bis sie fest ist.
Wischen Sie die Spitze der Titrationsspritze mit einem fusselfreien Gewebe ab, und legen Sie den Burettegriff vorsichtig in das ITC-Instrument und verriegeln Sie ihn an Ort und Stelle. Wählen Sie für die Versuchseinrichtung die inkrementelle Titration aus. Klicken Sie auf Einfügen, um die Injektionen einzurichten.
Stellen Sie das Injektionsintervall auf 5, 400 Sekunden, das Injektionsvolumen auf 4 Mikroliter und die Anzahl der Injektionen auf vier ein. Drücken Sie OK, um die Einstellungen zu bestätigen. Wählen Sie im Ausgleichsfeld Auto-Gleichgewicht und große erwartete Wärme aus.
Legen Sie die anfängliche Baseline auf 300 Sekunden fest. Um den Lauf zu starten, klicken Sie auf das Startsymbol neben der Rührrate, und klicken Sie dann auf Start, das sich neben dem Schraubenschlüsselsymbol befindet. Speichern Sie die Datei, und lassen Sie das Gerät ausführen.
Um Daten zu analysieren, öffnen Sie die Datei in Nano Analyze. Klicken Sie auf Daten, und wählen Sie Datenspalten aus. Wählen Sie alle Daten aus, kopieren Sie sie, und fügen Sie die Daten dann in Microsoft Excel ein.
Passen Sie 0 Basislinie an, indem Sie den Wert hinzufügen, der bei 300 Sekunden erforderlich ist, um ihn 0 zu machen. Wenden Sie diese Korrektur auf die gesamte Spalte der Wärmeratenwerte an. Zeichnen Sie dann Diagramme der Minimal- oder Maximalwerte mit dem Zeitpunkt, zu dem der Wert während der Titration aufgetreten ist.
In diesem Protokoll werden ITC-Datenspuren der Laktaseaktivität mit vier sequenziellen Injektionen von Laktose in eine Lactase-Lösung im pH 4,6-Puffer bei 55 Grad Celsius, 45 Grad Celsius, 35 Grad Celsius und 25 Grad Celsius gezeigt. Bei einer Kontrolle von 55 Grad Celsius wurde eine Keine Enzymkontrolle für die Wärme des Mischens durchgeführt. Für jede Enzyminjektion gibt es eine anfängliche exotherme Mischwärme, und anschließend tritt die lactase katalysierte endotherme Hydrolyse von Laktose auf, bis die Reaktion abgeschlossen ist und die Wärmerate zur Basis zurückzurückkehrt.
Das endotherme Spitzenminimum nach jeder Injektion ist aufgrund der Abnahme der enzymatischen Aktivität etwas geringer als die vorhergehende Injektion. Wie erwartet nimmt die Enzymstabilität für jede Injektion mit zunehmender Temperatur ab. Das Kontrollexperiment zeigt, dass die Laktaseaktivität bei 25 Grad Celsius aufgrund einer Verdünnung nach vier Injektionen eine 8-prozentige Abnahme der Enzymaktivität hatte.
Wenn man bedenkt, dass die vierte Injektion einen Rückgang des Assays um 73 Prozent zeigt, betrug der tatsächliche Verlust der Enzymaktivität somit 65 Prozent. So hatte die Verdünnung der Lactase, die aus jeder Injektion resultierte, eine relativ geringe Wirkung von 11 Prozent auf die Enzymaktivität. Es ist wichtig, dass der Puffer, der zur Herstellung der Enzym- und Substratlösungen verwendet wird, so eng wie möglich aufeinander abgestimmt ist.
Eine Diskrepanz zwischen pH-Wert oder Konzentration kann zu einer größeren Mischwärme führen, die die Reaktionswärme maskieren kann. Sie können dieses Protokoll anwenden, um Enzyme zu untersuchen und ihre Stabilität zu bestimmen, indem Sie die Wärmerate messen, die während einer Reaktion freigesetzt oder absorbiert wird.
