Wir möchten M. Scullion und R. Crisp of Idaho Technologies für den technischen Support und der USGS westlichen Ecological Research Center für die Finanzierung (S. Schwarzbach) und Hilfe (K. Spragens, T. Graham) zu danken. Institut für Verteidigung und Homeland Security (www.idhs.org), zur Unterstützung des Department of Defense und Air Force Research Laboratory - Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des Zentrums für Innovative Technology durchgeführt. Behandlung der Tiere folgten Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss des US Geological Survey westlichen Ecological Research Center und erlaubt der US Geological Survey Vogel Banding Laboratory genehmigt. Jegliche Nutzung des Handels-, Produkt-oder Firmennamen in dieser Publikation ist lediglich für beschreibende Zwecke und nicht die Billigung durch die US-Regierung.

1. Wild Bird Capture mit Fangnetze <ol><li> Für shorebird erfassen, richten Fangnetze auf eine aktive Nahrungssuche Website wie ein Sumpf, Ufer, oder Schlamm flach. </li><li> Slide Spiegelnetzen Leitungsschleifen von einem Ende des Nebels net um die Stange und legen Pol senkrecht in den Schlamm. </li><li> Streck net, legen zweite Pole durch Spiegelnetzen Schlaufen am anderen Ende der Nebel net und vertikal einfügen Pol in den Schlamm, um sicherzustellen, dass die Spiegel-Linien gelehrt werden. </li><li> Sobald ein Vogel gefangen, extrahieren Sie die Vögel aus dem Netz und Rückkehr zu den Streifen entfernt. </li></ol> 2. Kloakenabstriches Probenahme <ol><li> Sammeln Kloakenabstriche unmittelbar nach der Aufnahme </li><li> Suchen Sie die Kloake und die Nutzung Fingerspitzen zurück zu drängen umgebenden Federn </li><li> Packen Sie eine sterile Dacron-oder Polyester-bestückte Tupfer, Stielende erste und befeuchten Sie die Spitze mit einem sterilen welches Transportmittel für größere Leichtigkeit in swabbing. Nach der Befeuchtung wird der gesamte Kopf des Tupfers vorsichtig in die Kloake eingeführt. Swab dem Innenumfang der Kloake durch langsam drehend den Tupfer und entfernen Sie den Tupfer aus Kloake. </li><li> Einsetzen der Tupferspitze direkt in das virale Transport Media Probenfläschchen, drehen Sie den Tupferschaft zwischen Daumen und Zeigefinger, während der Tupfer wird in den Medien. Haben ein Assistent den Vorgang abzuschließen, indem Sie die Spitze des Tupfers wieder aus dem Boden des Fläschchens ~ 1 cm und schneiden die Welle der Tupfer mit einer Schere so die Tupferspitze bleibt in der Flasche und die Welle nicht stören Verschlusskappe. Cap Röhrchen fest. Desinfizieren Sie die Schere mit Alkohol zwischen Schneiden Tupfer Wellen. </li><li> Legen Sie die Flaschen in einer Tiefkühltruhe, die entweder Trockeneis oder Kühlakkus. </li></ol> 3. Oropharyngeale Tupfer Probenahme <ol start="1"><li> Öffnen Sie vorsichtig die Vogelschnabel, so dass die Choanen Schlitz sichtbar ist </li><li> Packen Sie ein sauberes Wattestäbchen aus dem Paket, Stielende erste und befeuchten Sie die Spitze mit viralen Transportmedium für größere Leichtigkeit in swabbing </li><li> Ohne Berührung der Spitze auf andere Oberflächen, stecken Sie ihn in den Mund und Tupfer der Choanen Eröffnung auf dem Dach des Mundes und weiter zurück in Richtung des Mund-Rachen-oder Halsbereich </li><li> Legen Sie die Tupferspitze direkt in das virale Transport Media Durchstechflasche. Drehen Sie den Tupfer Welle zwischen Daumen und Zeigefinger, während der Tupfer wird in den Medien. Wie oben erwähnt, ein Assistent ziehen die Spitze des Tupfers wieder aus dem Boden des Fläschchens ~ 1 cm und schneiden die Welle der Tupfer mit einer Schere so die Tupferspitze bleibt in der Flasche und die Welle nicht mit Kappe stören Schließung. Cap Röhrchen fest. Desinfizieren Sie die Schere mit Alkohol zwischen Schneiden Tupfer Wellen. </li><li> Legen Sie die Flaschen in einem Gefrierschrank Box mit Trockeneis oder Kühlakkus. </li></ol> 4. Vogel Handhabung und Release <ol start="1"><li> Zurück Vogel auf der Website von Erfassung und Freigabe rechtzeitig (&lt;20 Minuten). Hundeführer müssen sich bewusst sein, die Grundsätze des Tierschutzes und der Hut sein auf Anzeichen von Vogel leidet während der Probenahme (dh Abschürfungen, erfassen Myopathie und Hypo-oder Hyperthermie). Ein Erste-Hilfe-Kit sollte in der Liste der Geräte aufgenommen werden. </li></ol> 5. Prüfeinrichtungen <ol start="1"><li> Die Proben können in jeder umschlossene Raum, wie ein Forschungs-Wohnwagen oder Zelt getestet werden, mit einer Stromversorgung (Spannung-regulierten Strom-Generator), die PCR-Einheit und die angeschlossenen Computer ausgeführt werden. </li></ol> 6. RNA-Extraktion <ol start="1"><li> RNA-Extraktion wurde mit dem RNeasy Mini Kit mit geringfügigen Änderungen zu den Anweisungen des Herstellers folgende Spackman et al. 1 </li><li> Vortex den Tupfer Medium für 3-5 s und übertragen 350 ul einer 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Bewahren Rest Probe auf Eis bei PCR-positiven Proben nachgesiebt oder H5 Test muss ausgeführt werden müssen. </li><li> Add 350 ul RLT-Puffer (mit β-me) und Vortex für 5 s. </li><li> Add 350 ul RNA grade 70% Ethanol. </li><li> Zentrifuge bei 5.000 xg für 5 min. </li><li> Add 600 ul des Überstandes auf eine Spin-Säule in ein 2 ml Sammel-Tube gestellt. Bewahren Sie die verbleibende Probe in Reagenzglas-Rack. </li><li> Zentrifuge für 20 s bei 10.000 xg und entsorgen Durchströmung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 17-18, bis alle die Probe durch Spin-Säule verabschiedet worden. </li><li> Ort Spin-Säule in ein sauberes 2 ml Sammel-Tube. </li><li> Add 700 ul RW1 Puffer in die Spin-Säule und zentrifugieren 25 s bei 10.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Add 500 ul RPE Puffer, um die Spin-Säule und zentrifugieren Sie für 25 s bei 10.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 22 für insgesamt zwei Waschgänge mit RPE-Puffer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spin-Säule für eine weitere 2 Minuten bei 14.000 x g. Discard Sammelrohr. </li><li> Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 50 ul Nuklease-freies Wasser. Inkubieren bei Raumtemperatur für 60 s. </li><li> Eluieren RNA durch Spinnen für 60 s bei 10.000 xgfoder 60 s. Legen gereinigte Probe auf Eis. </li></ol> 7. Vorbereitung negativen Kontrollen <ol start="1"><li> Lyophilisierte Reagenzien wurden für den Einsatz in der PCR-Assay gemäß den Anweisungen des Idaho Technologies lyophilisierte Reagenz Detection Kit für TaqMan Sonden Influenza A Target 1 (Asay-ASY-0109) vorbereitet. </li><li> Centrifuge negativen Kontrollreagenz Fläschchen (rot) für 3 s, um sicherzustellen, Pellets sind an der Unterseite. </li><li> Kappe abnehmen, optisch stellen Sie sicher, Pellets sind an der Unterseite. </li><li> Fügen Sie 20 ul 2 X Rekonstitutionspuffer und 20 ul Reinstwasser. </li><li> Recap und Vortex für 5 s bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Zentrifuge für 3 s, um Flüssigkeit zu Boden des Fläschchens. </li><li> Sichtprüfung der Pellet wurde rehydriert, wenn nicht wiederholen Sie die Schritte 31-32. </li><li> Pipette 19 ul der hydratisierten Mischung in einem LightCycler Kapillare, wiederholen Pipette Schritt in eine zweite Kapillare, um ein Duplikat zu erhalten. </li></ol> 8. Vorbereitung Proben <ol start="1"><li> Centrifuge die unbekannten Reagenz Fläschchen (blau) für 3 Sekunden, um sicherzustellen, Pellets sind an der Unterseite. </li><li> Kappe abnehmen, optisch stellen Sie sicher, Pellets sind an der Unterseite. </li><li> Add 40 ul gereinigte RNA. </li><li> Recap und Vortex für 5 s bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Zentrifuge für 3 s, um Flüssigkeit zu Boden des Fläschchens. </li><li> Sichtprüfung der Pellet wurde rehydriert, wenn nicht wiederholen Sie die Schritte 38-39. </li><li> Pipette 19 ul der hydratisierten Mischung in einem LightCycler Kapillare, wiederholen Pipette Schritt in eine zweite Kapillare, um ein Duplikat zu erhalten. </li></ol> 9. Vorbereitung positive Kontrollen <ol start="1"><li> Centrifuge die positive Kontrolle Reagenz Fläschchen (grün) für 3 s, um sicherzustellen, Pellets sind an der Unterseite. </li><li> Kappe abnehmen, optisch stellen Sie sicher, Pellets sind an der Unterseite. </li><li> Fügen Sie 20 ul 2 X Rekonstitutionspuffer und 20 ul Reinstwasser. </li><li> Recap und Vortex für 5 s bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Zentrifuge für 3 s, um Flüssigkeit zu Boden des Fläschchens. </li><li> Sichtprüfung der Pellet wurde rehydriert, wenn nicht wiederholen Sie die Schritte 45-46. </li><li> Pipette 19 ul der hydratisierten Mischung in einem LightCycler Kapillare, wiederholen Pipette Schritt in eine zweite Kapillare, um ein Duplikat zu erhalten. </li></ol> 10. Zentrifugieren der Kapillaren <ol start="1"><li> Sobald alle Kapillaren für die Batch hergestellt worden laden sie in die Mini-Zentrifuge mit Kapillar-Adaptern ausgestattet. </li><li> Zentrifuge bei der niedrigsten Einstellung, indem Sie den Puls Taste für 1 s. Diese Transfers Flüssigkeit auf den Boden in der Vorbereitung für die Prüfung. </li></ol> 11. Die Bedienung des RAPID <ol start="1"><li> Erstellen einer neuen Datei. Label positive Kontrolle, Negativ-Kontrolle und Proben (durch ihre ID-Nummer). </li><li> Programm 1: RNA-Probenvorbereitung Halten <ol><li> Cycles = 1 </li><li> Analyse-Modus = None </li><li> Target Temperature = 40 </li><li> Incubation Time = 30 min </li><li> Temperature Transition Rate = 20 ° C / s (Standard) </li><li> Sekundäre Temperatur Target = 0 (Standard) </li><li> Step Size = 0 (Standard) </li><li> Step Delay = 0 (Standard) </li><li> Acquisition Mode = None (Standard) </li></ol></li><li> Programm 2: RNA Denaturierung <ol><li> Cycles = 1 </li><li> Analyse-Modus = None </li><li> Target Temperature = 94 </li><li> Inkubationszeit = 120s </li><li> Temperature Transition Rate = 20 ° C / s (Standard) </li><li> Sekundäre Temperatur Target = 0 (Standard) </li><li> Step Size = 0 (Standard) </li><li> Step Delay = 0 (Standard) </li><li> Acquisition Mode = None (Standard) </li></ol></li><li> Programm 3: RNA-Amplifikation <ol><li> Cycles = 45 </li><li> Analysis Mode = Auto Analysis </li><li> Soll-Temperatur, Segment 1 = 94; Segment 2 = 60 </li><li> Inkubationszeit, Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s </li><li> Temperature Transition Rate, Seg 1 &amp; 2 = 20 ° C / s (Standard) </li><li> Sekundäre Temperatur Target, Seg 1 &amp; 2 = 0 (Standard) </li><li> Step Size, Seg 1 &amp; 2 = 0 (Standard) </li><li> Step Delay, Seg 1 &amp; 2 = 0 (Standard) </li><li> Acquisition Mode, Segment 1 = keine; Segment 2 = single </li></ol></li><li> Fluoreszenz-Parameter <ol><li> Anzeige Modus: Fluoreszenz-Kanal 2 (Kanal 2 / 1) Gewinne: <ol><li> Ch 1 (F1) = 1 </li><li> Ch 2 (F2) = 8 </li><li> CH 3 (F3) = 1 </li></ol></li><li> Zur Anzeige der Echtzeit-Fluoreszenz-Daten für jede Probe, wählen Sie die Probe und klicken Sie auf den &quot;Show Graph&quot;-Button am unteren Rand des Bildschirms </li></ol></li><li> Für jede Kapillare, die Ergebnisse wie folgt: <ul><li> # - Identifiziert das Karussell Position des Karussells </li><li> Sample name - gibt den Namen der Probe </li><li> Control - indentifies der Art der Probe für jede Probe </li><li> Score - errechnet das Verhältnis zwischen der Probe Fluoreszenz und das Niveau der Hintergrundfluoreszenz in der Probe </li><li> Ergebnis - zeigt das Gesamtergebnis für die Probe </li></ul></li></ol> 12. Repräsentative Ergebnisse: Present: A red &#39;anwesend&#39; Forderung nach einem Test / unbekannten Probe zeigt, dass das Ziel in dieser Probe wurde identifiziert und die Kontrollen waren erfolgreich. Nicht erkannt: Ein grünes &quot;nicht erkannt&quot; Forderung nach einem Test / unbekannten Probe zeigt, dass das Ziel nicht in die Probe identifiziert und der Test steuert erfolgreich waren. Bitte wiederholen: A &#39;bitte wiederholen &quot;bedeutet, dass die positive oder negative Kontrolle versagt. Ein Beispiel für eine erfolgreiche Analyse durch die RAPID 7200 ist in Abbildung 4 dargestellt. Die positive Kontrolle wird verstärkt und erzeugt nachweisbare Fluoreszenz (y-Achse) bei etwa 25 Zyklen (x-Achse). Ein Zyklus Schwelle (CT)&gt; 35 ist die vereinbarte cut-off für die meisten AIV Referenzlaboratorien. Deshalb produziert die positive Kontrollen für diese Methode ein Fluoreszenz-Signal innerhalb der zulässigen Anzahl von Zyklen (0-35) für AIV-Erkennung. Im Gegensatz dazu wird die Negativ-Kontrolle nicht zu einer Fluoreszenz-Signal auch nach 45 Zyklen. Ebenso haben die zwölf Proben aus dem westlichen Strandläufer gesammelten nicht erzeugen ein Fluoreszenzsignal darauf hinweist, dass die Vögel negativ waren für AIV. Follow-up Tests aller positiven Proben in einem traditionellen Labor wird aufgefordert, sicherzustellen, dass keine False Positives irrtümlich produziert werden. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Shorebird Capture mit Fangnetze. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Sammlung von Kloake und oropharyngealen Proben von mindestens Strandläufer. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Programmierung der RAPID 7200 für RNA-Amplifikation. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Fluorogram erzeugt durch die RAPID 7200 portable rRT-PCR zeigen, wie positive und negative Kontrollen sollten in einem erfolgreichen Test erscheinen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2829/2829fig4large.jpg">Klicken Sie hier, um die volle Größe Bild in</a>

<ol>
	<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Takekawa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+detection+of+avian+influenza+virus+in+wild+birds:+evaluation+of+a+portable+rRT-PCR+system+and+freeze-dried+reagents.">Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents.</a> J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).</li><li>Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+internal+positive+control+for+rapid+diagnosis+of+avian+influenza+virus+infections+by+real-time+reverse+transcription-PCR+with+lyophilized+reagents.">Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents.</a> J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).</li><li>Spackman, E., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+virus+RNA+extraction+from+tissue+and+swab+material.">Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material.</a> Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).</li><li>Chen, R., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+inter-species+transmission+and+geographic+subdivision+in+avian+influenza+viruses+from+wild+birds.+Virology.">Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology.</a> , 383-3156 (2009).</li><li>Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+turnover+by+reassortment+of+replication+complex+genes+from+avian+influenza+A+virus.">Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus.</a> J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).</li><li>Dugan, V. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode der schnellen Diagnose hier vorgestellten erleichtert zeiteffizient und genaue Prüfung von Wildvögeln Proben für die Überwachung von AIV. Die viel weniger strenge Probe Storage-Anforderungen von tragbaren rRT-PCR eignen sich für Situationen, in denen Remote-Wartung einer Kühlkette unpraktisch sein kann, wenn flüssigem Stickstoff Verlader oder Trockeneis ist nicht verfügbar. Darüber hinaus fanden wir, dass die Probenanalyse mit gefriergetrockneten Reagenzien war einfach genug, um von Feldbiologen mit...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> RNeasy Mini spin column </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> Sammelröhrchen (1,5 und 2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> Buffer RLT </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> Buffer RW1 </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> Buffer RPE </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> RNase-freies Wasser </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Eingeschlossen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> 14,3 Mio. β-Mercaptoethanol-Lösung </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP176100 </td><td></td></tr><tr><td> 100% Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9602322 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie 2, 120 V </td><td> Scientific Industries </td><td> SI-0236 </td><td></td></tr><tr><td> Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolyse Probe) </td><td> Idaho Technologies </td><td> Asay-ASY-0109 </td><td></td></tr><tr><td> Lightcycler 20ml Kapillarrohre </td><td> Roche Applied Science </td><td> 04929292001 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-Zentrifuge mit Rotor für 2 ml-Tuben </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Eingeschlossen in RAPID-Kit </td></tr><tr><td> Ruggedized Erweiterte Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Eingeschlossen in RAPID-Kit </td></tr><tr><td> Pentium-basierten Laptop mit Windows XP Professional </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Eingeschlossen in RAPID-Kit </td></tr><tr><td> Lightcycler Data Analysis Software </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Eingeschlossen in RAPID-Kit </td></tr></tbody></table>

rapid diagnosis of avian influenza virus in wild birds: use of a portable rrt-pcr and freeze-dried reagents in the field

Wildvögel haben in der Ausbreitung der hoch pathogenen aviären Influenza (HPAI) des Subtyps H5N1 in Verbindung gebracht, woraufhin die Überwachung an den Flugrouten. Probenahme von Wildvögeln auf Geflügelpest-Virus (AIV) wird oft in abgelegenen Regionen durchgeführt, aber die Ergebnisse sind oft wegen der Notwendigkeit, Proben an ein Labor für molekulare Tests ausgestattet Transport verzögert. Real-time-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RRT-PCR) ist eine molekulare Verfahren, das eine der genauesten und empfindlichsten Methoden für die Diagnose von AIV bietet. Die bisher strengen Labor-Protokolle für rRT-PCR benötigt werden derzeit für den Bereich angepasst. Entwicklung von gefriergetrockneten (lyophilisierten) Reagenzien, die keine Kühlkette, mit Sensibilität auf der Ebene der nassen Reagenzien gebracht hat Vor-Ort-Remote-Tests, um ein praktisches Ziel. Hier präsentieren wir eine Methode zur schnellen Diagnose von AIV bei Wildvögeln mit einem rRT-PCR-Einheit (Ruggedized Erweiterte Pathogen Identification Device oder RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), dass lyophilisierte Reagenzien beschäftigt (Influenza A Target 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Idaho Technologies). Die Reagenzien enthalten alle erforderlichen Komponenten für die Prüfung bei entsprechenden Konzentrationen in einem einzigen Rohr: Primer, Sonden, Enzyme, Puffer und interne positive Kontrolle, Beseitigung von Fehlern mit unsachgemäße Handhabung oder Lagerung von nassen Reagenzien verbunden. Das tragbare Gerät führt einen Bildschirm für die Influenza A, indem sie auf der Matrix-Gen und liefert Ergebnisse innerhalb von 2-3 Stunden. Genetische Subtypisierung ist auch mit H5-und H7-Primer möglichen Mengen, die auf das Hämagglutinin-Gen. Geeignet ist das System für den Einsatz auf Kloake und oropharyngealen Proben von Wildvögeln, wie hier auf dem wandernden shorebird Arten nachgewiesen, die westliche Flussuferläufer (Calidrus mauri) in Nordkalifornien aufgenommen. Behandlung der Tiere folgten Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss des US Geological Survey westlichen Ecological Research Center und erlaubt der US Geological Survey Vogel Banding Laboratory genehmigt. Der primäre Vorteil dieser Technik ist die Diagnose von Wildvögeln zu beschleunigen, die Erhöhung der Chancen der mit einem Ausbruch in einem Remote-Standort. On-site-Diagnose wäre auch nützlich für die Bestimmung und Analyse von infizierten Personen in Wildpopulationen. Die Möglichkeit, Informationen über die Host-Biologie (immunologische und physiologische Reaktion auf eine Infektion) und räumlicher Ökologie (wandernde Leistung von infizierten Vögeln) sammeln Einblicke in welchem ​​Maße Wildvögel können als Vektoren für AIV über lange Distanzen zu fungieren.

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Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Diese Studie beschreibt Diagnose der Aviären Influenza bei Wildvögeln mit einem tragbaren rRT-PCR-System. Die Methode nutzt die Vorteile der gefriergetrockneten Reagenzien auf Wildvögel in einem Nicht-Labor-Einstellung, die typisch für einen Ausbruch Szenario Bildschirm. Verwenden von molekularen Werkzeugen bietet genaue und empfindliche Alternativen für eine schnelle Diagnose.

Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

rapid-diagnosis-avian-influenza-virus-wild-birds-use-portable-rrt-pcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Aufrufe.  USGS Western Ecological Research Center. Diese Studie beschreibt Diagnose der Aviären Influenza bei Wildvögeln mit einem tragbaren rRT-PCR-System. Die Methode nutzt die Vorteile der gefriergetrockneten Reagenzien auf Wildvögel in einem Nicht-Labor-Einstellung, die typisch für einen Ausbruch Szenario Bildschirm. Verwenden von molekularen Werkzeugen bietet genaue und empfindliche Alternativen für eine schnelle Diagnose.

Serie: Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Avian Influenza Surveillance mit FTA-Karten: Field Methods, Biosafety-und Transportprobleme gelöst

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Mikrowelle Assisted Schnelle Diagnose von Plant Virus Erkrankungen durch Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.