Wir bedanken uns bei Bert Dibbits für technische Unterstützung. Die Tierzucht und Genomics Group, Wageningen University, Niederlande, großzügig gehostet uns in ihrem Labor. Das Personal des Ottenby Bird Observatory, Schweden, ist zum Einfangen und Abtasten der Stockenten dankte, insbesondere Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson und Stina Andersson. Wir bedanken uns bei Sanne Svensson, Jonatan Qvist und Per-Axel Gjöres für die Dreharbeiten zu Ottenby und Mano Camon für Dreharbeiten in das Labor. Daniel Bengtson vorgesehen schöne Ente Fotos für das Video Teil dieser Publikation. Weitere freie Material aus dem CDC Public Health Image Library (PHIL; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) verwendet wurde: Die elektronenmikroskopische Aufnahme (Nr. 280; von Dr. Erskine Palmer) und Illustration (Nr. 11823; von Douglas Jordan) des Influenza-Virus. Finanzielle Unterstützung wurde durch die KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), dem niederländischen Ministerium für Landwirtschaft, die Faunafonds und der Stichting de Eik Trusts (sowohl in den Niederlanden) angegeben, die schwedische Research Council (Grant No. 2007-20774) und der EG fundierte Newflubird Projekt. RNA-Isolierung Chemikalien wurden eine großzügige Schenkung von Ambion, Inc., die RNA-Unternehmen. Dies ist Beitrag Nr. 245 vom Ottenby Bird Observatory.

1. Ente Trapping und Kloake Abstrich <ol><li> Trap-Schwimmenten der Gattung Anas (oder andere Vögel) in einem Käfig durch die Gewinnung von ihnen locken Enten oder Essen, und legte sie in die einzelnen Kartons. Transportation Zeit in der Box sollte auf ein Minimum reduziert werden, zum Beispiel durch den Einbau einer Feldstation in kurzer Entfernung zur Falle. Logistic Umständen in jeder Studie variieren. Die Beratung und Zustimmung der zuständigen Ethikkommission Tier muss für jedes neue Set-up gesucht werden. Alternativ kann auch Jäger abgeschossene Vögel abgetastet werden kann. </li><li> Nehmen Sie die Ente aus dem Kasten, indem die Flügel fest an seinen Körper. Probe eine frische fallen, die vorhanden sein wird in den meisten Fällen direkt aus dem Boden der Schachtel. Wählen sie mit einem sterilen Tupfer und wenden Sie die Flüssigkeit in einen Whatman FTA-Karte. Wenn nicht, führen Sie Kloake Abstrich. </li><li> Schalten Sie die Ente auf dem Rücken. Dies ermöglicht den Zugriff auf die Kloake und erleichtert Probenahme. Die Kloake ist eine vorstehende Struktur unter dem Bauch, in der Nähe der Basis des Schwanzes entfernt. Eine erfahrene Person halten konnte und probieren Sie die Vögel zur gleichen Zeit, oder auch eine zweite Person helfen kann. </li><li> Schieben Sie die sterile Kunststoff-Rayon Tupfer (Copan, Italien) ca. 1 cm und eine sanfte Wirbel aus der Kloake. Rollen Sie den Tupfer mit der Flüssigkeit aus der Kloake über die Oberfläche eines Whatman FTA-Karte. Nach der Probenahme wurde durchgeführt sofortige Freilassung des Tieres ist wünschenswert. </li><li> Trocknen Sie die FTA-Karten bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde, dann speichern Sie jede Probe einzeln in Papiertüten (z. B. Briefumschläge). Lagerung bei Raumtemperatur möglich, eventuell mit Silica-Kügelchen in feuchtem Klima. Das Senden und Empfangen von Institutionen Biosicherheitsbeauftragte erlauben kann, um FTA-Karten per Post zu schicken, da die Erreger inaktiv bei Kontakt mit der FTA-Karte Oberfläche geworden. </li></ol> 2. Viral RNA Isolation <ol><li> Entpacken Sie die FTA-Karte Material, einschließlich Fäkalien / Kloake Flüssigkeit. Punsch drei Scheiben mit einem Harris 2 mm Puncher und Ort all jene in eine Vertiefung einer RNase frei 96well Platte. Zwischen jeder neuen Probe, reinigen Sie die Puncher vorsichtig mit Alkohol und einem Kim Präzision wischen (Kimtech). Verwenden Sie immer positive und negative Kontrollen. Eine positive Kontrolle kann von einem Labor-Stamm frisch eine FTA-Karte aufgetragen, oder eine natürliche Probe, die wissen, um ein positives Ergebnis liefern wird bestehen. Als Negativ-Kontrolle, Punch-Out-Discs aus einem leeren FTA-Karte. Darüber hinaus lassen andere auch frei für eine PCR-Kontrolle später im Experiment (mit Wasser als Vorlage). </li><li> Add 70μl RNA schnelle Extraktionslösung (Ambion) und Wärme-Siegel der Platte (ABgene Thermo-Sealer). Inkubieren 5 Minuten auf einem Schüttler bei Raumtemperatur mit der ermittelten Geschwindigkeit, die nicht dazu führt, spill-over (dies hängt von der verwendeten Platten-Schüttler-Modell; Test im Voraus). </li><li> Carry virale RNA-Isolierung nach den Protokollen des Herstellers mit dem MagMax-96 virale RNA Isolation Kit (Ambion). In Kürze: Fügen Sie 130μl vorbereitet Lysis / Lösung (aus dem Kit) in jede Vertiefung. Transfer-50 ul extrahiert FTA-Karte Material in jede Vertiefung. Schütteln Platte für 1 Minute. </li><li> Add 20 &amp;mgr; l vorbereitet Bead-Mix (aus dem Kit) zu jeder Probe und mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren. Schütteln Sie auf bestimmte Geschwindigkeit für 5 Minuten. RNA-Moleküle werden an die magnetischen Kügelchen binden. </li><li> Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen 96-well stehen, um die Perlen zu erfassen. Je nach Modell der magnetischen Ständer verwendet, kann dies länger als 5 Minuten. Wenn die Lösung hat sich ganz klar, zu entfernen und den Überstand verwerfen. Dann entfernen Sie die Platte aus dem magnetischen stehen. </li><li> Waschen Sie die Kugeln zweimal mit Waschlösung 1 und zweimal mit Waschlösung 2 (aus dem Kit). Für jede der 4 Waschschritte 150 &amp;mgr; l vorbereitet Waschlösung hinzufügen zu jeder Probe, shake für 1 Minute auf bestimmte Geschwindigkeit bewegen sich die Platte an den magnetischen stehen, zu erfassen Perlen für ca. 5 Minuten (oder bis die Lösung völlig klar ist), zu entfernen und den Überstand verwerfen. Dann entfernen Sie die Platte aus dem magnetischen stehen, fügen Sie den nächsten Waschlösung und Durchführung der Waschschritte wie zuvor. Nach dem letzten Waschschritt entfernen Sie so viel Waschlösung wie möglich und an der Luft trocknen die Kügelchen bei Raumtemperatur in den Platten-Schüttler für 2 Minuten. </li><li> Add 50 ul Elutionspuffer (aus dem Kit), um RNA aus den Kügelchen lösen und schütteln für 4 Minuten auf dem Schüttler. Capture-Perlen wie zuvor beschrieben. Der Überstand enthält nun die isolierte RNA, die bereit sind für nachgelagerte Anwendungen ist. </li></ol> 3. RT-PCR des AIV Matrix Gene Führen Sie die reverse Transkription PCR (RT-PCR) mit dem One-Step RT-PCR Zugang Systems (Promega) in 25 ul Reaktionen (bereinigt von Kraus et al 18 und Fouchier et al 22..): <table border="1"><tbody><tr><td> Nuclease freies Wasser </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 Puffer </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Primer M52C 22 (10 nM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> Primer M253R 22 (10 nM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mM) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV-Reverse-Transkriptase (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Tfl-Polymerase (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNA-Probe </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> PCR-Bedingungen in einem Biometra T1 Thermocycler sind: initial reverse Transkription von 45 Minuten bei 45 ° C, um 2 Minuten initiale Denaturierung bei 94 ° C und 40 Zyklen: 94 ° C für 1 Minute, 56 ° C für 1 Minute und 68 ° C für 2 Minuten. Eine weitere 7 Minuten Dehnung bei 68 ° C schließt die Verstärkung. 4. Screening für AI-positive Proben und Reinigung von Targeted Fragmente aus Gel <ol><li> Laden 2μl des PCR-Produktes mit 2μl 5x Ladepuffer (BioRad) und 6μl Wasser auf einem 1% Agarosegel (Roche) mit 1% Ethidiumbromid (2.5μl pro 100 ml Gel) für ein Pre-Screening gefärbt gemischt. </li><li> Führen Sie das Gel für 1 Stunde bei 120 V, zusammen mit einem DNA-Längenstandard (BioRad EZ Last 100 bp-Leiter), mit einem Gel-Dokumentationssystem zu visualisieren. Sehen Sie ein Beispiel in Abbildung 1. </li><li> Ausgewählte Proben mit amplifizierten Fragmente in der erwarteten Größe (zwischen 200 bp und 300 bp (Soll-Fragment ist 244 bp). Laden Sie das gesamte PCR-Reaktionsvolumen (davon 23μl ~ sind links) von diesen Kandidaten mit 6μl 5x Ladepuffer auf einem 2 % Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel und führen Sie für 2 Stunden. </li><li> Legen Sie das Gel auf einem UV-Transilluminator (Bioblock Scientific) und per Augenschein. Sehen Sie ein Beispiel in Abbildung 2. Excise Banden der korrekten Größe von Gel mit einem Skalpell und in einzelne 1,5 ml Reaktionsgefäße gegeben. Purify Fragmente aus Gel, zum Beispiel mit dem Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research). </li></ol> 5. Sequenzierung und Identifizierung von PCR-Produkten <ol><li> Führen Sie Sanger-Sequenzierung des Ziels Fragmente, zum Beispiel auf einem ABI 3730 Kapillar-Sequenzer mit ABI Big Dye 3,1 Chemie (Applied Biosystems). Bereiten Sequenzierungen in 10 &amp;mgr; l Volumen mit 10-20 ng gelgereinigt Vorlage cDNA, 1.75μl 5x Verdünnungspuffer, 0.5μl Big Dye V3.1 Premix, 1 ul Vorwärtsprimer (M52C 20, 10 mM) und ddH2O. Radfahren Bedingungen sind: 1 min initiale Denaturierung von 25 Zyklen gefolgt: 10 s bei 96 ° C, 5 s bei 45 ° C und 4 min bei 60 ° C. Purify und Vorbereitung der Sequenzierreaktion nach Ihren internen Protokolle. </li><li> Identifizieren resultierenden cDNA-Sequenzen gegen Nukleotid-Datenbanken wie GenBank23, durch Web-basierte Tools wie BLAST am National Center for Biotechnology Information (NCBI, zB <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Stockenten (Anas platyrhynchos) wurden bei Ottenby Bird Observatory im Dezember 2007 entnommen. Von jedem Stockente einer Probe auf FTA-Karte aufgenommen wurde, wie in diesem Protokoll beschrieben. Nach der Auslieferung waren die FTA-Karten in einem Gefrierschrank bei -20 ° C für zwei Jahre aufzubewahren. Das gleiche FTA-Karte Probe im Labor zu isolieren, Kraus et al getestet. 18 als positive Kontrolle, sowie neun verzehnfacht serielle Verdünnungen der es aufgenommen wurde. Zwei negative Kontrollen wurden i) Extraktion aus einer leeren FTA-Karte, um zu testen, ob es carry-over von der Puncher, und ii) RT-PCR-Reaktion, in der Nuclease freies Wasser als Vorlage verwendet wurde, zu testen, ob Kontaminationen aufgetreten, oder in Vorbereitung der PCR-Reaktion. 84 Proben wurden analysiert. Ein Gel Bild der PCR-Produkte von diesen 84 Proben sind in Abbildung 1 zu finden. Von natürlichen Proben eine Vielzahl von unspezifischen Banden können durch das Vorhandensein verschiedener mikrobieller Kontaminationen in den Kot beobachtet werden. Allerdings ist das Ziel Fragment des Primerpaar 244 bp lang. Die gesamte PCR-Reaktionsvolumen von einer Teilmenge der Proben, die Fragmente in etwa die richtige Größe (zwischen 200 bp und 300 bp) produziert wurde am Gel (Abbildung 1) geladen. Eine Darstellung, welche der Bands aus dem Gel ausgeschnitten wurden, können in Ergänzende Abbildung 1 entnommen werden. Neben der positiven Kontrolle wurden zwei dieser Proben (69899 und 69912) positive durch das neue Protokoll. Eine BLAST-Suche gegen die NCBI Nukleotid-Datenbank ergab, ihre Identität als AI-Matrix-Gen (Abbildung 3), während alle anderen Bands ähnlich bakteriellen Sequenzen am ehesten, oder haben nicht zu einem lesbaren Sequenz überhaupt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> Abbildung 1. Gel Bild von einer ersten Sichtung der PCR-Produkte. 2 ul PCR-Produkt der positiven Kontrolle, serial Verdünnungen der Positiv-Kontrolle, zwei negative Kontrollen und 84 cloacal Proben wurden geladen. 48 Proben sind in den Top-Gel-Panel, und 48 Proben im unteren Bereich angezeigt. Rote Pfeile zeigen Gelspuren für 100 bp DNA-Längenstandard verwendet. Zur Veranschaulichung zeigen rote Kreise Bands in der erwarteten Größenordnung. Blaue Kreise kennzeichnen eine unspezifische Amplifikat (oben links) oder einem Primer-Dimer Artefakt unterhalb von 100 bp in der Größe (unten rechts). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Auswahl der Proben mit Fragmente in der richtigen Größenordnung. Proben mit Banden zwischen 200 bp und 300 bp (Zielfragment 244 bp) wurden ausgewählt. Der grüne Pfeil zeigt die positive Kontrolle, zeigen die beiden roten Pfeile Proben, die bestätigt, dass AIV positive durch Vergleich ihrer cDNA-Sequenzen der NCBI Nukleotid-Datenbank. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> Abbildung 3. Screen-Capture eines Vertreters BLAST-Suche bei NCBI. Einer der cDNA-Sequenzen aus dem herausgeschnittenen Fragmente erhalten wurde, gegen die Nukleotid-Datenbank der NCBI-Website abgefragt. Die Probe korrekt als AI-Matrix-Gen-Fragment identifiziert. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Um die volle Größe Version dieses Bildes finden Sie hier.</a> <img alt="Ergänzende Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> Ergänzende Abbildung S1. Bands von ausgewählten Proben aus Gel ausgeschnitten. Dieses Bild aus dem Gel in Abbildung 1 nach Kandidaten Banden zwischen 200 bp und 300 bp dargestellt genommen wurde herausgeschnitten worden waren.

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Trapping, Handhabung und die Entnahme von Vögeln wurden folgende nationale Gesetzgebung getan und wurden von der schwedischen Zentralamt für Landwirtschaft und der Forschung Tier Ethikkommission genehmigt.

Die hier beschriebene Protokoll stellt eine ergänzende Methode, um Fäkalien oder ähnlichen Proben auf das Vorhandensein von AIV Bildschirm. Es wurde speziell entwickelt, um die Probenentnahme schnell und einfach. Dies macht es möglich für weniger trainierte Personen, wie Jäger oder Wildtieren Manager, um AI-Überwachung beitragen. Keine Kühlketten angewendet werden müssen, obwohl das Einfrieren der Proben wird empfohlen, soweit möglich. Ein paar Tage bei Raumtemperatur, zum Beispiel während des Transports ins Labor, waren kein Problem für die RNA-Moleküle auf FTA-Karten, solange die Karten trocken blieb. Andere nicht gekühlt Storage-Systeme, die derzeit von der Forschungsgemeinschaft ausgewertet werden, wie Alkohol 15 oder Guanidin 16, erfordern besondere Vorkehrungen Versand wegen ihrer Gefährlichkeit. Im Gegensatz dazu wird die FTA-Karte-Verfahren nicht erforderlich, Versand von Gefahrgut. Allerdings ist ein weiteres interessantes Speichermedium in dieser Hinsicht RNAlater ™, ist nicht gefährlich, entweder 17. Beispiel Analyse kann in jedem Standard-molekularen Labor durchgeführt werden. Keine besondere Ausrüstung anders als für die üblichen PCR-Reaktionen und Kapillar-Sequenzierung wurde benötigt. Alle Schritte können ohne eine Sicherheitsstufe durchgeführt werden, da bereits bei der Probennahme die potenziellen Krankheitserregern durch die antibakterielle und antivirale Aktivität der FTA-Karte inaktiviert wurden. Cross-Kontamination und anschließende falsch-positiven Proben wurden nicht in unsere Studien mit Wildvögeln Proben beobachtet. Doch bei der Arbeit mit RNA und PCR ist es immer ratsam, besondere Aufmerksamkeit zu schenken Arbeitsplätze und separate Räume für Pre-und Post-PCR-Schritte zu reinigen. Arbeiten in einem Abzug verringert das Risiko des Aerosol-Kontamination im Labor. Pipettieren muss mit Filterspitzen durchgeführt werden. Von einer früheren Studie an Proben gleichzeitig über dieselbe Enten wissen wir, dass sechs der 84 Proben positiv waren von den traditionellen RealTime RT-PCR-Methode 24 und die CT-Werte von RealTime RT-PCR bekannt gemacht. Die beiden positiven Proben mit unserer Methode stammen von Enten, die Ct-Werte &lt;30 (was auf eine hohe Konzentration von viraler RNA) aufgedeckt hatte. Die anderen vier Proben, die positiv mit dem traditionellen Protokoll waren, hatten Ct-Werte&gt; 30 (weniger konzentriert) und nicht durch unser Protokoll erfasst werden. Nur Proben mit relativ hoher Virustiter wurden in unserem Test positiv und es ist wahrscheinlich, dass die Empfindlichkeit des Verfahrens wird die Fehlerquelle zu allen positiven Proben nachzuweisen war. Ferner wurde die Stichprobengröße in der aktuellen Studie sehr gering und das Verfahren kann vollständig entwickelt und bewertet werden, wenn mehr kontrolliert und strenge Experimente durchgeführt werden. Allerdings, wenn diese Proben würden von einem abgelegenen Gebiet gesammelt worden sind, würde der traditionellen Analyse nicht möglich gewesen, zu haben. Darüber hinaus stammen diese ersten Ergebnisse aus Modellversuchen, die weitere Optimierung benötigen. Ein Zeitraum von zwei Jahren Lagerung in einem regelmäßigen -20 ° C Gefrierschrank nach Blutentnahme wahrscheinlich auch die Qualität der viralen RNA beeinflusst. Diese mögliche RNA-Abbaus ist ein wichtiges Thema beim Umgang mit Lagerung bei Raumtemperatur von inaktivierten Viren. Die Proben in alternative Flüssigkeiten gelagert, wie oben erwähnt leiden unter signifikanten Abbau der Analyse der längere Strecken des viralen Genoms 16 Auswirkungen. Obwohl in unserer Studie nicht getestet haben FTA-Karten nachweislich gut geeignet sein, um intakte RNA-Moleküle in anderen RNA-Systeme, die sehr ähnlich zu Avian Influenza-Viren 25, 26 sind erhalten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes oder Instrument </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Plastic Rayon trockenen Tupfer </td><td> Copan, Italien </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> FTA-Karte </td><td> Whatman </td><td></td><td> mehrere Optionen </td></tr><tr><td> Harris Mikro punch 2mm mit Matte </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNase freie 96well Platte </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> oder vergleichbar </td></tr><tr><td> Kim Präzision Tücher </td><td> Kimtech </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA schnelle Extraktionslösung </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMax-96 Virus-Isolation Kit </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step RT-PCR Zugang Systems </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> oder vergleichbar </td></tr><tr><td> Agarose MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> Mehrzweck-Agarose </td></tr><tr><td> 5x Ladepuffer </td><td> BioRad </td><td></td><td> geliefert mit DNA-Leiter </td></tr><tr><td> EZ Last 100 bp Leiter </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> oder vergleichbar </td></tr><tr><td> Ethidiumbromid 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> oder vergleichbar </td></tr><tr><td> 1,5 ml Reaktionsgefäßen </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> oder vergleichbar </td></tr><tr><td> Zymoclean Gel DNA Recovery Kit </td><td> Zymo Forschung </td><td> D4001 </td><td> oder vergleichbar </td></tr><tr><td> ABI Big Dye 3,1 Chemie </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> oder vergleichbar </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

Vogelgrippeviren (AIVs) infizieren viele Säugetiere, einschließlich Menschen 1. Diese AIVs sind in ihren natürlichen Wirten diverse, Beherbergung fast alle möglichen viralen Subtypen 2. Menschliche Pandemien von Grippe ursprünglich stammen aus AIVs 3. Viele tödliche Fälle bei Menschen während der H5N1-Ausbrüche in den letzten Jahren gemeldet wurden. In letzter Zeit, ein neues AIV verbundenen Belastung durch die menschliche Bevölkerung gefegt, so dass die &quot;Schweinegrippe-Epidemie&quot; 4. Obwohl menschlichen Handels-und Transport-Aktivität verantwortlich zu sein scheint für die Ausbreitung der hoch pathogenen Stämmen 5, kann die Verbreitung zum Teil auch auf Wildvögel 6, 7 zurückgeführt werden. Allerdings ist die tatsächliche Reservoir aller AIV-Stämme Wildvögeln. In Reaktion auf diese und angesichts der schweren wirtschaftlichen Verlusten in der Geflügel-Industrie, haben große Überwachungs-Programme weltweit, um Informationen über die Ökologie der AIVs sammeln und Frühwarnsysteme zu installieren, um bestimmte hoch pathogenen Stämmen 8-12 erkennen umgesetzt. Traditionelle virologischen Methoden erfordern Viren intakt zu sein und kultiviert vor der Analyse. Dies erfordert strenge Kälte-Ketten mit Tiefkühltruhen und schwere Biosicherheit Verfahren, um im Platz während des Transportes werden. Langfristige Überwachung ist daher in der Regel ein paar Feldstationen in der Nähe gut ausgestattete Labors beschränkt. Abgelegene Gebiete können nicht abgetastet, es sei denn logistisch schwerfällige Verfahren umgesetzt werden. Diese Probleme wurden 13 anerkannt, 14 und die Nutzung alternativer Lagerung und Transport Strategien untersucht (Alkohole oder Guanidin) 15-17. Kürzlich führte Kraus et al. 18 a Verfahren zur Erhebung, Speicherung und Transport AIV Proben, basierend auf einem speziellen Filterpapier. FTA Karten 19 erhalten RNA auf eine trockene Lagerung Basis 20 und machen Krankheitserreger inaktiv bei Kontakt 21. Diese Studie zeigte, dass FTA-Karten verwendet werden, um AIV RNA in Reverse-Transkriptions-PCR und die daraus resultierende cDNA konnten sequenziert und Virus-Gene ermittelt und nachgewiesen werden. In der Studie von Kraus et al. 18 a Labor zu isolieren von AIV verwendet wurde, und die Proben wurden einzeln behandelt. In der Verlängerung hier präsentierten, wurden Kotproben von Wildvögeln aus der Ente Falle am Ottenby Bird Observatory (SE Schweden) direkt an den Nutzen der Methoden unter Feldbedingungen illustrieren getestet. Fangen von Enten und Probenentnahme durch Kloakenabstriche demonstriert. Das aktuelle Protokoll enthält up-scaling der Arbeitsabläufe aus einzelnen Röhre Umgang mit einer 96-well-Design. Obwohl weniger empfindlich als die traditionellen Methoden bietet die Methode der FTA-Karten eine hervorragende Ergänzung zu große Überwachungssysteme. Es ermöglicht Erfassung und Analyse von Proben aus der ganzen Welt, ohne die Notwendigkeit zur Aufrechterhaltung einer Kühlkette oder Sicherheitsvorschriften in Bezug auf Transport von gefährlichen Reagenzien, wie Alkohol oder Guanidin.

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Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Eine Methode, um zu bewahren, zu erkennen und Sequenz der RNA von Vogelgrippeviren wurde validiert und erweitert mit natürlichen Kotproben von Vögeln. Diese Technik beseitigt die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung einer Kühlkette und Handhabung von infektiösen Viren und kann in einer 96-well High-Throughput-Setup verwendet werden.

Avian Influenza Surveillance mit FTA-Karten: Field Methods, Biosafety-und Transportprobleme gelöst

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K Aufrufe.  Wageningen University. Eine Methode, um zu bewahren, zu erkennen und Sequenz der RNA von Vogelgrippeviren wurde validiert und erweitert mit natürlichen Kotproben von Vögeln. Diese Technik beseitigt die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung einer Kühlkette und Handhabung von infektiösen Viren und kann in einer 96-well High-Throughput-Setup verwendet werden.

Serie: Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.