Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen. Mexiko ist ein Land mit erheblichem Viehpotenzial. Die Staaten mit der höchsten Viehproduktion enthalten sowohl feuchte tropische Regionen als auch trockene Regionen, die durch das Vorhandensein der Vampirfledermaus Desmodus rotundus, dem Hauptsender der Tollwut, für Tollwutausbrüche gefährdet sind.
Der Nachweis des Tollwutvirus Nukleoprotein N-Gen wird vor allem für die Tollwutdiagnose durch molekulare Tests verwendet. Mit PCR-basierten Ansätzen können minimale Mengen eines infektiösen Erregers in einer klinischen Probe durch die selektive und sich wiederholende Amplifikation einer DNA-Nukleotidsequenz nachgewiesen werden. qRT-PCR basiert auf der Detektion und Quantifizierung eines Moleküls, bei dem die Fluoreszenzsignalerhöhungen in direktem Verhältnis zur Menge des PCR-Produkts in einer einzigen Reaktion stehen.
Mit zunehmender Anzahl von Kopien des Nukleinsäureziels steigt auch die Fluoreszenz. Auf dieser Grundlage bestand das Ziel der Studie darin, die quantitative qRT-PCR zu verwenden, um die Anzahl der virusfreien Partikel in verschiedenen anatomischen Strukturen von Rinderhirnen nach dem Tod aufgrund einer Tollwutinfektion zu bestimmen. Total RNA wurde direkt aus Rinderhirnen mit einer organischen Extraktionsmethode nach dem folgenden Protokoll extrahiert.
Verwenden Sie 100 Milligramm Hirngewebe aus jeder anatomischen Struktur, um die gesamte RNA mit einem kommerziell erhältlichen Reagenz zu extrahieren, das Guanidiniumisothiocyanat enthält. Manuelle Homogenisierung von insgesamt 100 Milligramm Gewebe aus jeder Struktur in einem Milliliter des Guanidinium isothiocyanatreage reageimmittel durch Wirbeln mit einem Dounce Homogenisat mit einem kleinen Stößel im Mikrorohr für 15 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit. Die Proben fünf Minuten lang auf Eis bebrüten und dann 200 Mikroliter Chloroform hinzufügen.
Mischen Sie die Proben 15 Sekunden lang kräftig. Zwei bis drei Minuten auf Eis bebrüten und dann bei 12 000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die wässrige Phase auf ein sauberes Rohr übertragen und 500 Mikroliter Isopropylalkohol hinzufügen.
Inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten bei 21 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den wässrigen Überstand durch Pipettieren.
Die isolierte RNA wird als Pellet in der Röhre vorhanden sein. Als nächstes waschen Sie das RNA-Pellet mit einem Milliliter 75%Ethanol durch Pipettieren und Zentrifugieren bei 7, 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet bei Raumtemperatur um 21 Grad Celsius.
Anschließend das Pellet in 50 Mikroliter nukleasefreiem Wasser verdünnen. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -Qualität mit einem Spektralphotometer bei 260 Nanometern. In-vitro-Transkription erzeugt mRNA eines Zielgens.
Verwenden Sie ein Primer-Paar, das das gesamte RABV N-Gen verstärkt, und eines, das als positiv für den qRT-PCR-Assay verwendet wird. Diese Primer wurden entwickelt, um das gesamte RABV N-Gen zu verstärken und einen Promotor hinzuzufügen, der die T7-Polymerase erkennt. Um das gesamte N-Gen RABV zu verstärken, verwenden Sie die Primer trans und RAB vorwärts und rückwärts und ein HIGH-Fidelity-PCR-Kit.
Bereiten Sie für jede Reaktion einen PCR-Master-Mix vor, indem Sie einen sauberen PCR-Rohrreaktionspuffer mit 10 Mikromolaren pro Primer und 0,5 Einheiten Hochtreuepolymerase hinzufügen. Um das PCR-Produkt als Vorlage für die In-vitro-Synthese zu verwenden und Komponenten der enzymatischen Reaktion zu entfernen, reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem säulenbasierten Konzentrator-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Und dann mit einem Spektralphotometer quantifizieren.
Für die RNA-Synthese verwenden Sie ein In-vitro-Transkriptionskit mit folgendem Reaktionsgemisch: fünf Mikroliter T7-Transkription 5X Puffer, 1,9 Mikroliter jedes Triphosphat-Nukleotids, 10 Mikrogramm gereinigte RABV-N-DNA und 2,5 Mikroliter des Enzymgemisches. Als nächstes, inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für vier Stunden. Dann fügen Sie einen Mikroliter von einer Einheit pro Mikrogramm Rnase-Freie DNase in das Reaktionsgemisch und inkubieren für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, um DNA-Kontamination zu beseitigen.
Reinigen Sie die in vitro transkribierte RNA und konzentrieren Sie sie dann mit Phenol:Chlorform:Isoamylalkohol im Verhältnis 25:24:1. Setzen Sie das gereinigte RNA-Pellet in 70 Mikroliter TE-Puffer aus, und lagern Sie es dann bei 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Wiederholen Sie das PCR-Protokoll, bis etwa fünf Mikrogramm PCR-Produkt erhalten sind.
Nach der Reinigung und Konzentration wird das in vitro transkribierte N-Gen mRNA in einer Konzentration von 4,711 Mikrogramm pro Mikroliter vorhanden sein. Bestätigen Sie, dass die in vitro transkribierte mRNA dem N-Gen nach Schritt 5 dieses Protokolls entspricht, und verwenden Sie diese als positive Kontrolle für die Echtzeit-Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion, qRT-PCR. Für die Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion verwenden Sie ein In-vitro-mRNA-Transkript bei der Codierung des gesamten N-Gens als positive Kontrolle.
Zusammen mit einem kommerziellen einstufigen qRT-PCR-Kit, mit Hybridisierungssonden nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie die Sonde in Primern, die von Coronado und Kollegen 2010 beschrieben wurden, um eine konservierte Region des RABV unter Verwendung der folgenden thermischen Radfahrbedingungen zu erkennen. Führen Sie serielle Verdünnungen der in vitro transkribierten mRNA durch seriellepipetierung eines Mikrogramms pro Mikroliter mRNA in Die röhrchende Röhren durch, bis sechs entkoppelte Verdünnungen erhalten sind.
Bereiten Sie Rohre mit einem Volumen von 100 Mikrolitern in dreifacher Ausfertigung für die Erstellung der Standardkurve vor. Führen Sie qRT-PCR wie zuvor beschrieben aus. Führen Sie qRT-PCR in einem thermischen Cycler mit einem Rotor durch, indem Sie die verschiedenen Gehirnproben gleichzeitig mit den laufenden Reaktionen verarbeiten, um eine Standardkurve zu erstellen und positive Steuerungen, Negativkontrollen und überzählige Stoffe zu verwenden, die aus der Zellkultur isoliert sind.
Um die Nachweisgrenze, die Testwirksamkeit und die Empfindlichkeit des Tests zu bewerten, verwenden Sie eine Standardkurve in Dreifacharbeit unter den gleichen Bedingungen. Verwenden Sie für den Nachweis des RABV-Gens N die RNA aus Feldproben, Positivkontrollen, Negativkontrollen und Zellkulturübersprechern, um qRT-PCR mit dem zuvor beschriebenen PCR-Kit durchzuführen. Um die Anzahl der Kopien des RABV-Genoms in den Rinderhirnproben zu bestimmen, erhalten Sie CT-Daten aus der Standardkurve und biologischen Proben und aus jenen, die aus der Kalibrierkurvengleichung interpoliert sind. Diese Abbildung zeigt Rinderhirngewebe mit positiver Färbung gemäß der direkten Immunfluoreszenz.
Die Ergebnisse zeigen 100%100%83,3%66% und 50% Positivität für RABV in der Kortex, Thalamus, Medulla, Pons und Horn jeweils. Diese Ergebnisse bestätigen die vorherigen Ergebnisse, und mindestens drei der Strukturen, die von jedem Gehirn seziert wurden, waren positiv für RABV. Andererseits zeigt die Gleichung der Standardkurve den Zusammenhang zwischen der Menge des RABV-Gengehalts in der Probe und der Größe des PCR-verstärkten Fragments.
Die Menge des RABV-Gengehalts in Nanogrammen wurde durch Interpolation der CT-Werte in der Kalibrierkurve unter Verwendung der in dieser Abbildung dargestellten Gleichung abgeleitet. Mit dieser Gleichung wurde festgestellt, dass die Nachweisgrenze von einem mal 10 bis fünf Mikrogramm pro Mikroliter viraler RNA 36 Kopien des RABV-Genoms entspricht. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Test empfindlich ist und verwendet werden kann, um das Virus in Proben zu erkennen, die eine geringe Anzahl von Kopien des RABV N-Gens enthalten.
Der Wirkungsgrad des Assays wurde anhand der Steigung der Standardkurve berechnet, die 3,28 betrug. Die für qRT-PCR verwendeten Proben zeigten eine Amplifikation des RABV N-Gens. Um die Anzahl der vorhandenen viralen Kopien zu bestimmen, wurden die CT-Werte für jede Probe mit der Kalibrierungskurvengleichung interpoliert.
Die in Nanogrammen erzielten Ergebnisse wurden in die hier beschriebene Formel substituiert. Diese Tabelle zeigt die Vergleichsergebnisse zwischen qRT-PCR und DFA. Die Ergebnisse der qRT-PCR-Assays stimmten mit denen über ein DFA überein.
Nach den Ergebnissen des qRT-PCR-Tests in den Fällen C und D ist der Thalamus die Struktur, die die höchste Anzahl von Kopien des RABV N-Gens besitzt. Dies deutet darauf hin, dass eine frühe Infektion von hypothalamischen und thalamischen Neuronen wichtig für die Entwicklung der Krankheit ist, da diese Neuronen die vegetativen Funktionen eines Tieres kontrollieren. Die Kopiennummern des RABV N-Gens, die in jeder Struktur jeder Probe nachgewiesen wurden, sind: die Empfindlichkeit und Spezifität des qRT-PCR-Tests sind wir beide zu 100%, da alle Proben positiv waren.
Dieses Ergebnis stimmt mit den ersten Diagnosen der Proben überein. qRT-PCR ist eine hochempfindliche Technik. Einige der Schritte sind entscheidend, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
Eine davon ist die richtige Handhabung von Proben für die RNA-Extraktion. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da die RNA leicht abgebaut werden kann und die Ergebnisse daher beeinflusst werden könnten. Erwägen Sie, die Probe unter kalten Bedingungen zu halten, etwa vier Grad Celsius während des Prozesses.
Berücksichtigen Sie außerdem, dass mehrere Runden pcR-Anwendung durchgeführt werden, wie in der In-vitro-Transkription erwähnt. Der in dieser Studie durchgeführte qRT-PCR-Assay konnte nur 36,3 Kopien des RABV N-Gens pro Milligramm Gewebe erkennen. Zu den am besten geeigneten Hirnstrukturen für qRT-PCR gehörten der Kortex und der Thalamus.
Dies basiert auf den Beobachtungen, dass in diesen Strukturen höhere Konzentrationen des RABV-N-Gens nachgewiesen wurden und dass sie auch mit dem RABV-Referenztest positiv waren. Der Test konnte sehr niedrige Konzentrationen, 0,00023 mal 10 bis die neunten Kopien des Virus in verschiedenen Proben zu erkennen. Neben der Quantifizierung der Viruspartikel in der Probe scheint der Test ein gutes alternatives Diagnose- und Forschungswerkzeug für die Erkennung von RABV zu sein, das hier vorgestellt wird.
