Ein Anstieg der jüngsten Epidemien wie Zika und Ebola-Virus haben die Notwendigkeit einer koordinierteren und flinkeren Reaktion auf globaler Ebene deutlich gemacht. Um dies zu erreichen, haben wir eine innovative, skalierbare, intramodale Laboreinheit entwickelt, die bei solchen Ausbrüchen weltweit in ressourcenbeschränkten Gebieten eingesetzt werden kann. Hier stellen wir Ihnen unsere intramodalen, erweiterbaren, mobilen Versandcontainerlabore vor.
Und im folgenden Papier stellen wir unseren BSL-2- und BSL-3-Ansatz zur Diagnose von Atemwegs-Influenzavirus vor. Schnelle Influenza-Virus-Diagnose durch RCT-PCR. Beachten Sie vor der Vorbereitung auf den Einbau in die installierte Laboreinheit, dass alle BSL-2-Sicherheitsanforderungen berücksichtigt werden müssen.
Dazu gehören das Ankleiden mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung, das Händewaschen, das Tragen von Handschuhen und die Dekontaminierung aller Arbeitsbereiche, die Sie verwenden möchten. Beachten Sie, wenn Sie Bleichmittel verwenden, um Ihren Arbeitsbereich und Ihre Vorräte zu dekontaminieren, müssen Sie auch 70% Ethanol verwenden, um alle Bereiche zu reinigen, die Bleichmittel ausgesetzt sind, da Bleichen sich mit anderen Chemikalien im Arbeitsbereich mischen kann, um giftige Dämpfe zu erzeugen. Entsorgen Sie alle Bleichmittel in ihrer eigenen Abfalltonne.
Da Probentupfer von Patienten entnommen werden, werden sie vom Feld oder der Klinik in die Laboreinrichtung transportiert und über das Durchgangsfenster an den Labortechniker weitergeleitet. Dieses Fenster kann nicht von beiden Seiten geöffnet werden. Im BSL-2 Pass-Through-Fenster muss die Außenfläche von Probenproben vollständig mit Bleichmittel desinfiziert und zwei Minuten lang allein gelassen werden.
Öffnen Sie das Pass-Through-Fenster, und sammeln Sie die zu registrierenden Proben. Wischen Sie alle Proben ab, die Bleichmittelreste haben, und wischen Sie das Innere des Durchgangsfensters mit Bleichmittel ab, gefolgt von einer 70%ethanol-Lösung. Fügen Sie jedem Probenröhrchen Und Ihren vier leeren Rohren, die für Aliquots bestimmt sind, Barcodes hinzu.
Bewegen Sie Ihre Proben auf die Entlüftungshaube. Scannen Sie den Barcode auf jeder Röhre, und stellen Sie sicher, dass die richtigen Probenidentifikationsinformationen auf dem Tablet-basierten System- oder Laptopbildschirm angezeigt werden. Schließen Sie den Registrierungsprozess ab.
Beispiel aliquot. Sobald die Reagenzgläser gekennzeichnet sind, verwenden Sie einen zertifizierten und dekontaminierten Biosicherheitsschrank der Klasse II, um Aliquots von Proben zu entnehmen. Achten Sie bei der Einnahme von Aliquots darauf, für jede Probe frische sterile oder Einwegpipetten zu verwenden und sie in biogefährliche Abfallbehälter zu entsorgen, um kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Stellen Sie sicher, dass jedes Rohr dicht und geschlossen ist. Verwenden Sie ein Aliquot pro Probe für die sofortige Extraktion. Bewahren Sie alle anderen Aliquots für die zukünftige Verwendung im Gefrierschrank auf.
Reinigen Sie vor dem Umzug zum Arbeitsplatz alle Arbeitsbereichsoberflächen und -geräte mit Bleichmittel, gefolgt von einer 70%ethanol-Lösung. Sobald Ihre BARCODE-PCR-Proben aliquoted wurden, verschieben Sie sie auf eine Arbeitsstation, die für die Extraktion bestimmt ist. Bereiten Sie Ihren Puffer AVL Träger RNA Mischung für die Lyse Schritt.
Die Proben- und Lysepuffer-Mastermischung sollte bei Raumtemperatur gehalten werden. Etikettieren Sie ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr. Stellen Sie die Pipettenspitze auf 560 Mikroliter ein.
Tragen Sie eine saubere Pipettenspitze auf. Fügen Sie jedem Rohr einen Lysepuffer hinzu. Entsorgen Sie die Spitze im Abfallbehälter.
Nehmen Sie als Nächstes Ihre PCR-Aliquot-Probe. Legen Sie es in das vorbereitete Lyse-Pufferrohr, das für aliquot one bestimmt ist, und wiederholen Sie dies für alle zusätzlichen Proben. Entsorgen Sie die alte Pipettenspitze und tragen Sie eine saubere Pipettenspitze auf.
Tragen Sie eine saubere Pipettenspitze auf. Fügen Sie 140 Mikroliter eines Puffers in das Steuerrohr. Schließen Sie jedes Rohr sicher.
Pulswirbel für 15 Sekunden. Wiederholen Sie dies mit zusätzlichen Aliquots oder Proben. Mikrozentrifugieren Sie jede Probe für fünf Sekunden.
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 10 Minuten zentrieren Sie Ihre Rohre kurz, um tropfen aus der Innenseite des Deckels der einzelnen Rohre zu entfernen. Fügen Sie 560 Mikroliter Ethanol die Probe ein.
Ändern Sie Ihre Pipettenspitze. Wiederholen Sie dies mit allen verbleibenden oder zusätzlichen Proben. Schließen Sie jedes Probenrohr sicher.
Pulswirbel pro Probe für 15 Sekunden. Mikrozentrifugieren Sie die Proben für fünf Sekunden. Erhalten Sie ein sauberes Zwei-Milliliter-Sammelrohr.
Fügen Sie die Spinspalten hinzu. Beschriften Sie sie entsprechend Ihren Beispielen. Übertragen Sie 630 Mikroliter der Probe entsprechend der Spalte.
Sichern Sie Ihre Kappen. Wechseln Sie zur Zentrifuge. Verteilen Sie Ihre Proben gleichmäßig in der Zentrifuge.
Zentrifugieren Bei 6000 g für eine Minute, um den Lysepuffer zu entfernen. Kehren Sie zur Arbeitsstation zurück. Ersetzen Sie Ihre Sammelrohre.
Fügen Sie den verbleibenden Lysepuffer hinzu und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Entsorgen Sie Ihre originalen Aliquot-Probenröhrchen, danach entsorgen Sie das Eluat und waschen Sie die Spinsäule mit dem Puffer AW1. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit jeder Probe oder weiteren Proben.
Sichern Sie die Kappen an jeder Probe und Zentrifuge bei sechs g. Wiederholen Sie dies mit dem zweiten Waschpuffer AW2 bei 20 g. Legen Sie die Säule schließlich in ein sauberes 1,5-Milliliter-Rohr.
Öffnen Sie die Säule und fügen Sie 60 Mikroliter Puffer AVE hinzu. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Minute und Zentrifuge bei sechs g für eine Minute. Das Beispiel ist nun für die PCR-Analyse bereit.
Unter den BSL-3-Bedingungen wird das Versuchsprotokoll gleich bleiben, aber Die Sicherheitsmaßnahmen werden vor allem einen Präzedenzfall erwirken. Vor dem Betreten des BSL-3-Labors sollten Sie sich durch das transparente Fenster umsehen, dass in der Handschuhbox-Einheit ein Negativdruck festgestellt wurde. Es wird offensichtlich sein, dass Unterdruck festgestellt wurde, wenn der Ball in der Wand sichtbar ist.
Sobald unterdruck festgestellt wurde, öffnen Sie die Tür und betreten Sie das Gerät. Waschen Sie sich sofort die Hände und fahren Sie dann mit Ihrer PPE-Checkliste fort. Fahren Sie mit dem Anlegen der PSA in der folgenden Reihenfolge fort: unter Handschuhen, Kleid, Schuhbezügen, Maske, Gesichtsschild, zweitem Paar Handschuhe.
Schalten Sie die Maschine ein und lassen Sie den Druck in der Handschuhbox stabilisieren. Verwenden Sie eine Bleichsprühlösung, um alle Bereiche und Vorräte zu dekontaminieren, die Sie innerhalb und außerhalb der Handschuhbox verwenden möchten. Entsorgen Sie Bleichabfälle in einem Behälter, in dem Sie nur Bleichmittel verwenden.
Verwenden Sie 70% Ethanol-Lösung, um über alle Bereiche zu reinigen, in denen Bleichmittel verwendet wurde. Übertragen Sie Ihre Proben über das Pass-Through-Fenster. Die Proben sollten mit Bleichlösung besprüht und mindestens eine Minute im Durchgang allein gelassen werden, bevor sie innerhalb der BSL-3-Einheit empfangen wurden.
Als Nächstes erhalten Sie Ihre Proben innerhalb der BSL-3-Einheit und reinigen Sie sie gründlich, bevor Sie mit dem Registrierungs- und Etikettierungsschritt fortfahren. Sobald Proben registriert und Rohre beschriftet sind, legen Sie die Proben über das Airlock-Tray in den Handschuhkasten. Öffnen Sie nicht beide Türen auf einmal.
Öffnen und schließen Sie jede Tür in zwei verschiedenen Schritten für Sicherheitsvorkehrungen. Nachdem die Proben sicher in das Inneninnere der Handschuhbox verschoben wurden, führen Sie die gleichen Schritte wie zuvor beschrieben aus, um Proben-Aliquots in der Handschuhbox zu erstellen. Sobald Proben aliquoted werden, bewegen Sie die Proben in den luftdichten Behälter.
Sprühbleichlösung in der Handschuhbox, um Rohre und alle anderen Oberflächen zu dekontaminieren. Warten Sie fünf Minuten und wenden Sie dann 70% Ethanol-Lösung an, um die Bleichmittel zu waschen. Nach gründlicher Dekontamination bewegen Sie nur die Proben, die für die PCR-Analyse für die Lyse benötigt werden, wieder in die Handschuhbox.
Führen Sie im Handschuhkasten nur den Lyseschritt des Extraktionsverfahrens durch. Sobald die Zellen lysiert sind, versiegeln Sie die Kappen an jeder Probe fest und legen Sie sie in den Druckluftschleusendurchgang. Dekontaminieren Sie den Handschuhkasten wieder mit Bleichmittel, gefolgt von 70%Ethanol-Lösung.
Verschieben Sie die Proben aus der Handschuhbox und übertragen Sie sie für die verbleibenden Schritte des Extraktionsvorgangs auf die Arbeitsstation. Nach der Extraktion übertragen Sie Ihre Proben zur PCR-Analyse in das Pass-Through-Fenster. Nachdem Proben entfernt und übertragen wurden, dekontaminieren Sie Ihren Laborarbeitsplatz außerhalb der Handschuhbox.
Bevor Sie Ihre PSA entfernen, warten Sie, bis die Luftzirkulation im Gerät eine ordnungsgemäße Anzahl von Filterzyklen sicher erreicht hat, bevor Sie beginnen, Ihre PSA zu entfernen. Unmittelbar nach dem Entfernen und Entsorgen aller PSA in den PSA-Abfallbehälter, waschen Sie Ihre Hände im Laborwaschbecken mit Seife und Wasser, bevor Sie das Gerät verlassen. PCR-Verstärkung und -Erkennung.
Entfernen Sie die extrahierten RNA-Proben aus dem Durchgangsfenster. Bereiten Sie eine Master-Mischung in einem 1,5-Milliliter-Rohr mit den folgenden Komponenten für jeden Zieltest vor: Wasser, Primer und Sonden, Angriffsmischung und 2X-Puffer. Vortex und drehen Sie Ihre Master-Mix, nach dem, aliquot die Master-Mix in jedem der Streifenrohre.
Bringen Sie das PCR-Kit bei den empfohlenen Temperaturen wieder in den Speicher, sobald der Master-Mix vorbereitet wurde. Fügen Sie die Proben zu jedem der Streifenrohre mit einer separaten Spitze zwischen den einzelnen Streifenrohren hinzu. Drehen Sie die Proben bei 1.500 U/min für eine Minute, danach können die Proben auf die Echtzeit-PCR-Einheit geladen werden.
Sobald Samples auf das PCR-Instrument geladen sind, dauert es etwa 90 Minuten, um einen Durchlauf abzuschließen. Der Echtzeit-PCR-Assay ist eine empfindliche Methode zur robusten Erkennung des Virus. Dies kann in der Tabelle mit der Bezeichnung:PCR Analysierte Ergebnisse angezeigt werden.
Bevor Sie Ihre Ergebnisse sammeln und das Labor verlassen, entfernen Sie PSA und dekontaminieren Sie jeden Arbeitsplatz in Vorbereitung auf den nächsten Diagnosetest angemessen. Repräsentative Ergebnisse. Der Laborworkflow ist in dem Diagramm dargestellt, das den persönlichen Schutz betont.
Der schnelldiagnostische Influenzatest wird mittels RT-PCR-Analyse durchgeführt. Das Verfahren besteht aus vier Hauptschritten und einzelnen Arbeitsbereichen werden für jede Phase des Protokolls zugewiesen. Ziel dieses Projekts ist es, eine neuartige modulare, schnell einsetzbare Laboreinrichtung zu validieren, und wir haben dies erfolgreich durchgeführt und Schulungsprogramme für Laborpersonal entwickelt, das während Epidemien und Ausbrüchen in ressourcenarmen Umgebungen arbeitet.
