This work has been funded in part with federal funds from the Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS), National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contract No. HHSN272201400006C.

Alle Schweine in der Sammlung der folgenden Daten verwendet werden, wurden unter der Ohio State University Institutional Animal Care und Verwenden Committee geschützt (Tiernutzung Protokollnummer 2009A0134-R1). 1. Herstellung der Virustransportmedium und Probensammlung Vials <ol><li> In 37 g Brain Heart Infusion zu 900 ml gereinigtem Wasser und mischen mit einem Rührstab und einem Magnetrührer unter Erwärmen auf 70 ° C, um das Pulver vollständig aufzulösen. </li><li> Autoklavieren der Brühe bei 121 ° C für 15 min. Kühle auf der Tischplatte, bis die Brühe Raumtemperatur erreicht. Im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht, wenn nötig. </li><li> Aufzulösen, durch Mischen mit einem magnetischen Rührstab, 6,02 g Penicillin G-Natriumsalz und 10 g Streptomycinsulfat in 50 ml gereinigtem Wasser bei Raumtemperatur. Fügen zusätzliches gereinigtes Wasser, um das Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen. Die Lösung wird durch ein 0,22 um-Polyethersulfonmembran in eine sterile Flasche. </li><li> Aseptisch das gefilterte Penicillin und Streptomycin-Lösung hinzufügen, in das gekühlte Brain Heart Infusion Broth und sorgfältig zu vermischen (Rührstab oder Wirbelkolben mit der Hand), um die Virustransportmedium zu machen. </li><li> Aseptisch testen Sie den pH-Wert der Virustransportmedium; Bei Bedarf kann der pH-Wert auf 7,4 ± 0,2 mit HCl oder NaOH. </li><li> Führen Sie Qualitätssicherungstests auf der Virustransportmedium durch die Prüfung für Influenza-A-Virus-Matrixprotein von rRT-PCR, wie von Zhang und Harmon beschrieben. 22 </li><li> Verzichtet werden 5 ml der viralen Transportmediums in sterile hochdichten Polyethylenflaschen mit 8 ml Kapazität. Beschriften Sie die Durchstechflaschen für den Einsatz im Feld. </li><li> Bewahren Sie die ready-to-use Fläschchen in Standard-Kryo-Boxen bei -20 ° C bis zum Probensammlung. </li></ol> 2. Sammlung von Nasal Wipes von Swine <ol><li> Tauen die entsprechende Anzahl von Fläschchen unmittelbar vor der Entnahme zu probieren; ein Fläschchen wird pro Schwein Stichprobe benötigt. Das Auftauen bei RaumTemperatur dauert ca. 30-45 min. Halten Sie die aufgetauten Fläschchen kühl auf Eis Packs bis zur Verwendung. </li><li> Don geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, wie diktiert durch die Lage (zB Overalls, Überziehstiefel, Atemschutz, Gehörschutz, etc.). </li><li> Geben Sie den Tierbereich. Bei Bedarf beschränken das Schwein auf einen kleinen Bereich aber nicht zurückhalten. Sie wecken nicht stillstehen Tiere. </li><li> Setzen Sie auf ein Paar Einweguntersuchungshandschuhe. Darauf achten, dass die Handschuhe durch Berühren von Schweinen, Menschen oder leblose Gegenstände kontaminieren. </li><li> Verwenden Sie einen Handschuh in ein steriles 5,08 cm × 5,08 cm zu entfernen (2 in. × 2 in.) Baumwolle Tupfer aus der Verpackung. Steriler Gaze-Pads verwendet werden, wann immer möglich. Einzeln verpackt Gaze-Pads sind bequemer, als die mit zwei Gazekompressen pro Paket verpackt zu verwenden. </li><li> Halten Sie die Baumwolle Gaze mit den Fingerspitzen einer Hand so viel von der Unterlage wie möglich auszusetzen für die Probenahme. </li><li> Wischen Sie die Gaze über den Schweineschnauze, wobeizusätzliche Pflege, um die äußeren Nasenlöcher, wenn möglich in Kraft. Sammeln sichtbaren Nasensekret (etwa 1 ml) mit dem selben Mullbausch. </li><li> Mit der gleichen Seite, falten Sie die Gaze auf sich selbst, um die Platzierung in der Ampulle, die Virustransportmedium zu erleichtern. </li><li> Mit der anderen Hand, entfernen Sie die Kappe von der Durchstechflasche und legen Sie das gefaltete Gaze in das Fläschchen. Verschließen Sie die Röhrchen und schütteln Sie das Fläschchen, um die Durchmischung der Gaze und Virustransportmedium zu gewährleisten. </li><li> Die Handschuhe und in einen geeigneten Behälter zu entfernen. Handschuhe zwischen jedem Schwein ändern. </li><li> Stellen Sie sicher, das Fläschchen Kennung. Nehmen Sie Schwein-Identifikationsnummer, Alter, Geschlecht, klinische Symptome und andere Notizen, die von Prüfer für erforderlich gehalten. </li><li> Kühlen Sie die Proben sofort nach der Entnahme. Überlegen Sie sich Teilmengen der Probe vor dem Einfrieren zu mehreren Auftauen und Einfrieren vermeiden. So bald wie möglich nach der Entnahme, legen Sie die Proben auf Trockeneis für den Transport zum Labor. Lagern Sie die Fläschchen bei -80° C bis zum Test initiiert wird. </li></ol> 3. Der Nachweis von Influenza A Virus-Nukleinsäure <ol><li> Tauen Sie die Proben in einem 37 ° C Trockenperle Bad für 5 Minuten und dann beenden Auftauen der Proben auf dem Labortisch bei Raumtemperatur für 20-30 min. Die gleichzeitige Zugabe von mehreren Ampullen auf die Kügelchen führt dazu, daß das Bad zu erhitzen; Vorsicht ist geboten, um die Durchstechflaschen nicht überhitzen. </li><li> Entfernen 100 ul Virustransportmedium für die RNA-Extraktion. <ol><li> Verwenden ein Hochdurchsatz (96-Well-Platte-Format), Magnetkügelchen Plattform zum Extrahieren von RNA, die aus einer großen Anzahl von Proben. 31 </li></ol></li><li> Verwenden Sie Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR-Tests zum schnellen Nachweis Influenza A-Virus. 31 </li></ol> 4. Isolierung von Influenza A Virus vom Nasen Wipes <ol><li> Tauen Sie die Proben wie oben in Abschnitt 3.1 beschrieben </li><li> Gönnen aufgetauten Proben mit Gentamicin-Sulfat (1.000ug / ml), Amphotericin B (22,5 &amp; mgr; g / ml) und Kanamycinsulfat (325 ug / ml). </li><li> Inokulieren in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Epithelzellen wie zuvor beschrieben. 32 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Sammeln von Proben von Schweinen unter Verwendung von Polyester-bestückte Nasenabstrichen hat bei der Durchführung von IAV Überwachung bewährt; jedoch die Verwendung des Nasenabstrich Verfahren behindert Überwachungsbemühungen aufgrund der erforderlichen Verwendung einer Schlinge zur Zurückhaltung. Nasal Tücher stellen eine Weiterentwicklung der aktuellen Schweinestichprobentechniken, um Stress auf die Menschen und Schweinen während der Probenahme zu minimieren. Während das Verfahren seit entwickelt und in Aus...

<html> Influenza-A-Viren (IAV) verursachen Atemwegserkrankungen in vielen Arten, darunter Hausgeflügel, Schweinen und Menschen. Durch Neuordnung der segmentierten IAV Genom schnelle virale Evolution kann auftreten, und neue IAV Stämme häufig auftauchen. Schweine sind eine Spezies, die als Mischgefäß für die Neuordnung der iAVS von mehreren Wirtsarten dienen können 1. Derzeit gibt es drei Haupttypen von IAV häufigsten verwendete unter den nordamerikanischen Schweinen (H1N1, H1N2, H3N2) im Umlauf, aber mehrere IAV Einführungen von Menschen haben innerhalb dieser Subtypen führte zu umfangreichen IAV Vielfalt. 2 schnelle Entwicklung der iAVS infizieren Schweine ist seit 1998, als eine dreifache Reassortante IAV enthält Gensegmente aus menschlichen, Vogelgrippe und Schweineviren 3 verbreitete sich unter den Schweinen in den Vereinigten Staaten deutlich. 4 Die interne Gen Segmente von diesem Dreifach Reassortante IAV vor sehr weit verbreitet unter iAVS derzeit infizieren Schweine. 5 &quot;&gt; Weltweit ist die IAV eine wesentliche Ursache für Atemwegserkrankungen bei Schweinen, in der typischen klinischen Symptome sind Fieber, Appetitlosigkeit, Lethargie, Husten, Atemnot, Niesen, Nasenausfluss und schlechte Gewichtszunahme. IAV kann besonders teuer werden, um Betriebe zu säen, wo Fortpflanzungs Versagen aufgrund von IAV induzierte Fieber und schwache geborenen Ferkel wurden dokumentiert 6,7 Innerhalb der Vereinigten Staaten. wird IAV üblicherweise in kommerziellen Schweinebeständen und der umfangreichen Antigens und Genoms Vielfalt und kontinuierlichen Weiterentwicklung unter IAV infizieren Schweine erfasst hat die Kontrolle über diese behindert Virus. 8-11 Der öffentlichen Gesundheit über die Entstehung einer Pandemie IAV-Stamm von Reassortierung was Schweine wurden im Jahr 2009 realisiert werden, wenn ein Schwein-Linie IAV enthält Gensegmente aus dem Triple-Reassortante nordamerikanischen Schweine Abstammung und der eurasischen avian artigen Schweine Linie verursachte eine weltweite Pandemie beim Menschen. 12 Die Pandemie-Virus (A (H1N1) pdm09) verfügt seitmit endemischen Schweine neu angeordneten IAV Stämme 13,14 und einige dieser neu neu angeordneten Stämme zurück auf den Menschen übertragen worden. 15 Die Häufigkeit der Reassortierung Veranstaltungen und Entstehung neuer IAV Stämmen mit Pandemie-Potenzial macht die aktive Überwachung der zirkulierenden IAV-Viren bei Schweinen zwingend notwendig, vor allem an der Schweine-Mensch-Schnittstelle. Die Schweine-Mensch-Schnittstelle ist für die bidirektionale Interspezies-Übertragung von IAV. Mensch-zu-Schweine-Übertragung in kommerziellen Schweineproduktion auftritt, ist für eine große Menge von IAV Vielfalt derzeit in der Schweinepopulation vorhanden verantwortlich. Landwirtschaftsmessen sind die größten Einstellungen für die comingling von Menschen und Schweinen in den Vereinigten Staaten und sind dafür bekannt Stellen für den zoonotischen Übertragung von IAV. 15-21 Im Jahr 2012, während des Ausbruchs einer Variante H3N2 IAV, 93% der Fälle berichtet, die Teilnahme an eine Landwirtschaftsmesse in den Tagen vor der Krankheitsbeginn. 15 Genomanalysevon Virusisolaten von Ausstellungs Schweinen gegenüber menschlichen Isolate bestätigte zoonotischen Übertragung. 21 Ausstellung Schweine mit IAV infiziert oft nicht klinischen Anzeichen von Krankheit, 21-23, die die Notwendigkeit einer direkten diagnostischen Tests zu zeigen. Probenahme von sichtlich kranken Schweine allein nicht erfolgreich IAV Prävalenz identifizieren bei Schweinen und kann nicht herangezogen werden, um neue Stämme von IAV Schwellen unter den Schweinen zu identifizieren. Aktive Überwachung ist für die Erkennung von Schwellen Stämme von IAV in Schweinen und ihre Bedrohung sowohl für Schweine und die öffentliche Gesundheit zu beurteilen unbedingt notwendig. Die meisten IAV Überwachungstätigkeiten sind freiwillig und daher minimal störend Verfahren benötigt werden. Die drei großen Schlachttierprobensammelverfahren für IAV infizieren Schweine sind: Nasenabstrichen, Mundflüssigkeiten und Nasentücher. Aktuelle Empfehlungen zur Probenahme einzelnen Schweine zu IAV-Liste das Einfügen von Kunstfaser erkennen Abstrichtupfer in die Nasenlöcher als die bevorzugte Methodeum Nasensekret und Epithelzellen zu sammeln. 24,25 Da Schweine können versuchen, dieses Verfahren, ein Team von Fachpersonal muss Schweinen entweder manuell oder mit einer Schlinge, je nach Größe des Tieres zurückhalten zu vermeiden. 26. Die Zurückhaltung Prozess ist mühsam für die Personal und stressig für die Schweine. Zusätzlich Ausstellung Schweine sind oft in mehreren Wettbewerben auf einer Messe beteiligt, so dass die Wahrnehmung der zusätzlichen Stress auf einem Wettbewerb Tier Besitzer gegenüber den Überwachungs Anstrengungen unternehmen. Mit Wahrscheinlichkeiten der IAV Erkennung im Bereich von 80-100% in IAV infizierten Beständen, haben Mundflüssigkeiten zu einer beliebten Alternative zu Tupfer für den molekularen Nachweis von IAV in Populationen von Schweinenasen. 27,28 Zusätzlich kann Mundflüssigkeiten ein breiteres Fenster der bereitzustellen IAV Erkennung als Nasenabstrichen nach Erstinfektion. Allerdings IAV isoliert von Mundflüssigkeiten problematisch gewesen mit nur 50% der Virusisolierung Versuche was IA29 V Erholung. Verwenden Nasentücher anstelle von Nasenabstrichen bei IAV Überwachung in Schweinen überwindet die oben beschriebenen Einschränkungen. Nasal Tücher nicht die Verwendung eines Rückhalte Snare erfordern und ohne Belastung der Tiere oder Zeugen des Verfahrens durchgeführt werden. Minimale technische Ausbildung ist notwendig, um Nasenwischtücher, die nicht-Tierärzten, einschließlich Schweinebesitzer ermöglicht zu sammeln, um die Überwachungs Proben zu sammeln. Nasen Tücher wurden im Vergleich zu vorher Nasentupfer zum Nachweis und zur Isolierung von Influenza-A-Virus 30 und das detaillierte Protokoll für diese nicht-invasive Methode der Probenahme wird nachstehend beschrieben.

<table><tbody><tr><td>BBL Brain Heart Infusion</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G Sodium Salt</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>021194537</td><td>1500 u/mg</td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>AMRESCO LLC</td><td>0382</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Solution</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Amphotericin B Solution</td><td>Fisher</td><td>S 24 25</td><td>250 ug/ml</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Teknova</td><td>K2105</td><td>5000 ug/ml</td></tr><tr><td>TPP Rapid Filtermax System</td><td>TPP Techno Plastic Products AG&amp;nbsp;</td><td>99150</td><td></td></tr><tr><td>Nalgen Diagnostic Bottles</td><td>Thermo Scientific</td><td>342002-9025</td><td>HDPE with white PP closure</td></tr><tr><td>Dermacea Gauze Sponge, 8 ply</td><td>Covidien</td><td>441211</td><td>5.08 cm &amp;times; 5.08 cm (2 in. &amp;times; 2 in)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nitrile Exam Gloves</td><td>Saftey Choice</td><td>19-170-010 (A-D)</td><td></td></tr></tbody></table>

nasal wipes for influenza a virus detection and isolation from swine

Überwachung der Influenza-A-Viren bei Schweinen ist entscheidend für die menschliche und tierische Gesundheit, weil Influenza A-Virus schnell entwickelt sich in Schweinepopulationen und neue Stämme werden laufend entstehen. Schweine sind in der Lage, die von verschiedenen Abstammungslinien von Influenza A-Virus so dass sie wichtige Wirte für die Entstehung und Aufrechterhaltung von neuartigen Influenza A-Virus-Stämmen infiziert werden. Sampling Schweine in diverse Einstellungen wie kommerziellen Schweinefarmen, landwirtschaftliche Messen und Märkten für lebende Tiere ist wichtig, einen umfassenden Überblick über die derzeit zirkulierenden IAV-Stämme bereitzustellen. Der aktuelle Goldstandard Schlachttier- Sampling-Technik (dh Sammlung von Nasenabstrichen) ist arbeitsintensiv, weil sie körperliche Zurückhaltung der Schweine erfordert. Nasen Tücher beinhalten Reiben eines Stückes Stoff durch die Schnauze des Schweins mit minimalen oder keiner Beeinträchtigung des Tieres. Die Nasen wischen Verfahren ist einfach durchzuführen und nicht Personal mit professionellen Veterinär- oder Tier Handling Ausbildung. While etwas weniger empfindlich als Nasenabstriche sind Virenerkennung und Isolation gewählten Standort gewährleisten, stellen Nasen wischt eine tragfähige Alternative zum Abtasten einzelner Schweine bei niedriger Belastung Probenahmeverfahren erforderlich sind. Das Verfahren Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um eine lebensfähige Nasen sammeln wischen von einem einzelnen Schwein.

Erfolgreiche Anwendung dieser Methode ergibt rRT-PCR ergibt sich, dass, begleitet mit der Verwendung eines internen Kontroll während der RNA-Extraktion und rRT-PCR, hat Show Proben enthalten PCR-Inhibitoren in jedem Umwelt Trümmern hob während der Probenahme. Nach der Probenimpfung sollte Virusisolierung Brunnen frei von sichtbaren Umwelt Schutt aus der Probe. Es gibt vernünftige Vereinbarung zwischen rRT-PCR-Ergebnisse und die Virusisolierung Ergebnisse mit dem Verständnis, dass PCR ergibt oft eine höhere IAV pos...

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Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

nasal-wipes-for-influenza-a-virus-detection-and-isolation-from-swine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Aufrufe.  The Ohio State University. The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses. 

Serie: Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

Erkennung von Viren von Bioaerosolen Anion Austausch Harz

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Umwelt

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &ndash; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed due to challenges with different diagnostic modalities. Ciliary videomicroscopy, using Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), one of the diagnostic tools for PCD, is considered the optimal method to perform ciliary functional analysis (CFA), comprising of ciliary beat frequency (CBF) and beat pattern (CBP) analysis. However, DHSV lacks standardized, published operating procedure for processing and analyzing samples. It also uses living respiratory epithelium, a significant infection control issue during the COVID-19 pandemic. To continue providing a diagnostic service during this health crisis, the ciliary videomicroscopy protocol has been adapted to include adequate infection control measures.
Here, we describe a revised protocol for sampling and laboratory processing of ciliated respiratory samples, highlighting adaptations made to comply with COVID-19 infection control measures. Representative results of CFA from nasal brushing samples obtained from 16 healthy subjects, processed and analyzed according to this protocol, are described. We also illustrate the importance of obtaining and processing optimal quality epithelial ciliated strips, as samples not meeting quality selection criteria do now allow for CFA, potentially decreasing the diagnostic reliability and the efficiency of this technique.

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &#8211; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

To guarantee a successful and high-quality ciliary functional analysis for PCD diagnosis, a precise and careful method for respiratory epithelium sampling and processing is essential. To continue providing PCD diagnostic service during the COVID-19 pandemic, the ciliary videomicroscopy protocol has been updated to include appropriate infection control measures.

Probenahme und Verarbeitung von Nasenbürsten mittels digitaler Hochgeschwindigkeits-Ziliar-Videomikroskopie – Anpassung an die COVID-19-Pandemie

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed ...

COVID-19 / Coronavirus Outbreak: Performing a Nasal Swab Test on Patients inside a Rapidly Deployable Facility Optimized for Epidemics

While different types of diagnostic tests may be used to detect coronavirus disease, a nasopharyngeal swab test is the most common. The test must be performed by a trained healthcare provider. If cell culture is collected in a wrong manner, the diagnosis obtained may be incorrect.
The World Health Organization (WHO) recommends that providers use a sterile dacron or rayon swab with a flexible, plastic shaft for deep nasal sampling. Cotton, calcium alginate swabs, or swabs with wooden sticks may contain such compounds that can inactivate some viruses and inhibit the diagnostic polymerase chain reaction (PCR). The following protocol describes the proper procedure for collecting a nasopharyngeal swab sample.

COVID-19 / Coronavirus Outbreak: Performing a Nasal Swab Test on Patients Inside a Rapidly Deployable Facility Optimized for Epidemics

COVID-19 / Coronavirus-Ausbruch: Durchführung eines Nasenabstrichtests an Patienten in einer schnell einsatzfähigen Anlage, die für Epidemien optimiert ist

While different types of diagnostic tests may be used to detect coronavirus disease, a nasopharyngeal swab test is the most common. The test must be ...