Wir danken Anschubfinanzierung von der Wayne State University (MJA), einen Zuschuss von der American Foundation for Aging Research (SMV) und ein Pathway to Independence Career Transition Award (R00EB007129) aus dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering der National Institutes of Health (MJA).

1. Metallierung mit LnCl 3 Salze <ol><li> Lösen des Liganden in Wasser zu einer Lösung von 30-265 mm. Die Liganden 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-Diethylentriaminpentaessigsäure (p-SCN-Bn-DTPA) wurde in diesem Video bei einer Konzentration von 73 mM verwendet. </li><li> Den pH-Wert der Lösung von Ligand zwischen 5,5 und 7,0 durch Zugabe von 1 M NH 4 OH. In diesem Video wurden 0,2 ml der 1 M NH 4 OH-Lösung verwendet. </li><li> Lösen Sie 1-2 Äquivalente der LnCl 3 in Wasser zu einer Lösung mit einer Konzentration von 5-1000 mm herzustellen. In diesem Video wurden EuCl 3 und GdCl 3 in Konzentrationen von 111 mM verwendet. Ein Überschuss an Metall wird häufig verwendet, um die Metallierung zum Abschluss zu bringen und damit zu vereinfachen Reinigung. </li><li> Fügen Sie die Lösung von LnCl 3 zur Lösung des Liganden unter Rühren. </li><li> Nach der Zugabe von LnCl 3, den pH-Wert der resultierenden Reaktionsmischung auf zwischen 5,5 und 7,0 durch Zugabe von 0,2 M NH 4 OH. Insgesamt 0,5 ml der 0,2 M NH 4 OH-Lösung wurde in diesem Video verwendet. Wenn Ihr Liganden enthält säureempfindlichen funktionellen Gruppen, den pH-Wert mehrmals während dieses Schrittes. ACHTUNG - Wird die Lösung zu einfach, jede Basis sensitive funktionelle Gruppen, wie Isothiocyanat wird unbrauchbar für die Konjugation werden. </li><li> Überwachen Sie die Reaktion über pH-Messungen. Die Reaktion ist beendet, wenn der pH-Wert konstant bleibt. </li></ol> 2. Raising pH Aufarbeitung (nicht in diesem Video enthalten, aber gut für Liganden ohne Sockel-sensitive funktionelle Gruppen) <ol><li> Fügen Sie konzentrierte NH 4 OH auf die Reaktionsmischung auf pH-Wert von ≥ 11 einzustellen. Dieser Schritt wird jeder Niederschlag unkomplexierten Metall als unlösliches Hydroxid. </li><li> Den Überstand durch einen 0,2 um Filter. Wenn die Reaktionsmischung verstopft den Filter, Zentrifugieren und Dekantieren vor dem Filtern wird empfohlen. </li><li> Wenn eine Dialyse nicht durchgeführt werden, entfernen Sie unter vermindertem Druck (Rotationsverdampfer oder Gefriertrocknung wird empfohlen) Lösungsmittel. </li><li> Steps 2,1-2,3 kann wiederholt werden, wenn freie Lanthanoid bleibt. </li></ol> 3. Dialyse Aufarbeitung <ol><li> Schneiden Sie den Dialyseschlauch auf eine geeignete Länge (folgen Sie den Richtlinien des Herstellers), um das Probenvolumen zu halten, während verlassen Überlänge (ca. 10% des Probenvolumens). In diesem Video wurde eine 100-500 Dalton Molekulargewicht cut-off (MWCO) Membran verwendet, aber auch größere MWCO Schlauch kann nach Bedarf verwendet werden, wenn Konjugation ist vor Metallierung durchgeführt. Außerdem können Dialyse-Kassetten als Alternative zum Dialyseschlauch wenn gewünscht verwendet werden. </li><li> Gegebenenfalls basierend auf den Richtlinien des Herstellers, genießen den Schnitt Dialyseschlauch in Wasser 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Füllen Sie ein Dialyse-Reservoir (a 1 L Becherglas wurde in diesem Video verwendet wird) mit Wasser (Dialysat). Das Dialysat Volumen sollte ca. 100x, dass der Probe sein. </li><li> Falten Sie das eine Ende des Schlauchs zweimal und sichern Sie den gefalteten Teil des Schlauches mit einer Dialyse Verschluss spannen. Wickeln Sie das Ende des Verschlusses mit einem Gummiband um sicherzustellen, dass es während der Dialyse bleibt geschlossen. </li><li> Filter das Reaktionsgemisch durch einen 0,2 um Filter, und laden Sie das Filtrat in das offene Ende des Schlauches darauf achten, daß die Schläuche zerreißen. Achten Sie darauf, genügend Kopfraum zu verlassen, um den Schlauch zu schließen. </li><li> Falten Sie die verbleibenden offenen Ende des Rohres zweimal mit einem Verschluss zu sichern, und wickeln Sie den Verschluss mit einem Gummiband wie in Schritt 3.4. </li><li> Bringen Sie ein Glasfläschchen mit Luft, um die Klemme an einem Ende der Dialyseschlauch mit einem Gummiband. Bringen Sie ein Fläschchen mit Sand auf die andere Klemme. Diese Fläschchen sicher, dass der Schlauch in das Dialysat bleibt eingetaucht. </li><li> Stellen Sie den vollen Rohren in der Dialyse-Reservoir, das Dialysat enthält. </li><li> Stir das Dialysat mit einer magnetischen Rührplatte mit langsamer Geschwindigkeit (kein Vortex) bei Raumtemperatur. </li><li> Ändern Sie den Dialysat 3x im Laufe eines Tages (in diesem Video, das Dialysat wurde mit 2,5, 6,5 und 11,5 h geändert), und dann lassen Dialyse weiterhin über Nacht (für insgesamt von 20-28 h Dialyse). </li><li> Entfernen Sie den Dialyseschlauch aus dem Dialysat und vorsichtig öffnen Sie eine Schließung auf die Probe zu entfernen. Waschen Sie den Dialyseschlauch 3x mit Wasser und kombinieren das Waschwasser mit der Probe. </li><li> Entfernen Sie das Wasser unter vermindertem Druck. Bei der Gefriertrocknung wird in diesem Video verwendet. </li></ol> 4. Bewertung der Anwesenheit von freiem Metall <ol><li> Lösen Sie die Metall-Komplex in Acetatpuffer (Puffer Zubereitung: Lösen Sie 1,4 ml Essigsäure in 400 ml Wasser, den pH-Wert auf 5,8 mit 1 M NH 4 OH, und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 500 mL produzieren) und fügen Sie die Xylenol orange Anzeige (16 uM in pH 5,8-Puffer). In diesem Video, betrug 0,3 mg Komplex in 0,3 ml Puffer gelöst und 3 ml Indikator-Lösung versetzt. </li><li>Das Vorhandensein von freiem Metall durch Beobachtung einer Farbänderung des Indikators von gelb bis violett. </li><li> Falls gewünscht, kann die Menge des freien Metall durch die Schaffung einer Kalibrierkurve 1 quantifiziert werden. Alternativ kann der Farbstoff Arsenazo III statt Xylenolorange 2 verwendet werden. Wenn freies Metall bleibt, sollte die Probe weiter gereinigt werden mittels Dialyse, ein Entsalzungssäule oder High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) vor Charakterisierung. </li></ol> 5. Bestimmung der Wasser-Koordinationszahl (q) <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung der Eu III-haltigen Komplex (~ 1 mm) in H 2 O und eine andere Lösung der gleichen Konzentration in D 2 O. Vor der Analyse muss die D 2 O-Lösung verdampft und gelöst in D 2 O dreimal um das restliche H 2 O. entfernen </li><li> Fügen Sie die Wasser-Lösung, um eine saubere Küvette, und setzen Sie die Küvette in einem Spektrofluorometer. </li><li> Führen Anregungs-und Emissions-Scans, um die Maxima für jede (~ 395 nm und ~ 595 nm, jeweils) zu bestimmen. </li><li> Führen Sie eine Phosphoreszenz Zeit-Zerfall Experiment mit folgenden Parametern: Anregungs-und Emissionswellenlänge von Schritt 5.3, Anregung und Emission Spaltbreiten (5 nm), Flash-count (100), anfängliche Verzögerung (0,01 ms), maximale Verzögerung (13 ms) bestimmt und Verzögerungsinkrement (0,1 ms). Diese Bedingungen sind für die meisten Komplexe, aber die maximale Verzögerung und den inkrementellen Werten kann erhöht oder verringert werden für Arten mit sehr langen oder sehr kurzen Abklingzeiten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.4 mit der D 2 O-Lösung in Schritt 5.1 vorbereitet. </li><li> Von der Lumineszenz-Zerfall Daten in 5,4 und 5,5 erhalten, Grundstück den natürlichen Logarithmus der Intensität als Funktion der Zeit. Die Steigung dieser Geraden sind die Abbauraten (τ -1) (Abbildung 2). In diesem Video wurde Microsoft Excel 2007 verwendet werden, um den natürlichen Logarithmus Plots aus den Rohdaten zu generieren. Verwenden Sie die Abbauraten in der Gleichung von Horrocks und Mitarbeiter (eq 1) 3 entwickelt. Wenn Ihr Liganden enthält OH-oder NH-Gruppen koordiniert, um das Metall, dann ist die Gleichung müssen vor Gebrauch 3 geändert werden. </li></ol> eq 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> 6. Relaxivität Messungen <ol><li> Wählen Sie die gewünschte Anwendung Modus auf die Relaxationszeit Analysator: T 1 (longitudinale Relaxationszeit) oder T 2 (transversale Relaxationszeit). </li><li> Eine Reihe von Proben, die verschiedene Konzentrationen von Gd III-haltigen Komplex in einem wässrigen Lösungsmittel enthalten. In diesem Video wurde Wasser als Lösungsmittel und Lösungen von 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 verwendet, und 0 mM hergestellt wurden. Andere wässrigen Lösungsmitteln oder Puffer könnte verwendet werden, aber es ist wichtig, um das Lösungsmittel als Blindwert verwendet. Das endgültige Volumen der Probe ist spezifisch für das Instrument, das verwendet wird. </li><li> Legen Sie eine Probe in das Instrument und lassen es 5 min stehen lassen, um die Temperatur des Gerätes (37 ° C in diesem Video) ausgleichen. </li><li> Bestimmen Sie die Relaxationszeit (in Einheiten von s) durch Anpassung der Parameter der Software, um einen reibungslosen exponentiellen Kurve für T 1 oder T 2 (repräsentative Kurven für T 1 und T 2 sind in Abbildung 3 dargestellt) zu erhalten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.3 und 6.4 für alle Proben, einschließlich der leeren. </li><li> Berechnen Sie die inverse der gemessenen T 1 oder T 2-Werte in Einheiten von s -1. </li><li> Zeichnen Sie die T 1 -1 oder T 2 -1 Werte im Vergleich zu Gd III-Konzentration (in Einheiten von mM). Wegen der hygroskopischen Natur der Gd III-Komplexe, bestätigen die Konzentration von Gd III mit Atomabsorptionsspektrometrie oder induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie. Fit das Grundstück mit einer geraden Linie. Ein Vertreter Grundstück ist in Abbildung 4 dargestellt. </li><li> Die Steigung der angepassten Linie ist die Relaxivität (r 1 oder r 2 für T 1 und T 2), gegliedert und verfügt über Einheiten mM -1 s -1. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Daten für die Schritte in diesem Protokoll sind in den Tabellen und Abbildungen Abschnitt aufgenommen worden. Neben der Wasser-Koordinationszahl und Relaxivität Charakterisierung in das Protokoll beschrieben, ist es wichtig, Endprodukte mit Standard-chemischen Verfahren zu charakterisieren. Die Identität der Verbindung kann mithilfe der Massenspektrometrie und Vertreter Massenspektren zeigen die diagnostischen Isotopenmuster für Gd III - und Eu III-haltige Komplexe sind in Abbildung 5 dargestellt. Darüber hinaus, für Nicht-Gd III </sup&gt; Lanthanoid-Komplexe können NMR-Spektroskopie zur Identifizierung des Produkts verwendet werden. Um die Reinheit des Komplexes, HPLC oder Elementaranalyse zu charakterisieren oder beides verwendet werden kann. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 Allgemeine Regelung für die Metallierung und Reinigung:. Scheme Darstellung der allgemeinen Vorschrift zur Metallierung und Gründe für die Wahl verschiedener Reinigungsverfahren Routen. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 Lumineszenz-Intensität Grundstück:. Representative Auftragung des natürlichen Logarithmus der Intensität als Funktion der Zeit aus Abschnitt 5. Die Steigungen der Linien von ähnlichen Kurven für Wasser-und D 2 O-Lösungen erworben generiert werden mit eq 1 verwendet, um das Wasser-Koordination Reihe von EU-III-haltige Komplexe zu charakterisieren. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3 Entspannung Abklingzeit Kurven:. Repräsentative Daten für (links) T 1 und (rechts) T 2 Erwerb. Abweichungen von diesen Kurvenformen erzeugen würde unzuverlässige Daten. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4 Relaxivität Bestimmung:. Ein Vertreter Auftragung von 1 / T 1 gegen die Konzentration von Gd III. Die Steigung der angepassten Linie ist Relaxivität und hat Einheiten mM -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5 Massenspektren:. Representative Massenspektren zeigen die diagnostischen Isotopenmuster für (links) Gd III-haltige Komplexe und (rechts) Eu III-haltige Komplexe. Der schwarze Gaussian Spitzen geben die theoretischen Isotopenverteilung und die roten Linien sind die eigentlichen Daten.

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G., Terreno, E., Aime, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+containing+nanosized+systems+for+MR-molecular+imaging+applications.">Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications.</a> Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).</li><li>Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gadolinium(III)+chelates+as+MRI+contrast+agents:+structure,+dynamics,+and+applications.">Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications.</a> Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).</li><li>Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging:+theory+and+design.">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li><li>Yoo, B., Pagel, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging.">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. 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K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents.">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li><li>Le&#243;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates.">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li><li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Angesichts der zunehmenden Zahl von Publikationen, die Lanthanoid-basierte Kontrastmittel 4-14 zählen, ist es wichtig, dass Pflege in der Vorbereitung, Reinigung und Charakterisierung von Produkten, um reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse zu gewährleisten, wird übernommen. Diese Komplexe werden oft als schwierig zu reinigen und zu charakterisieren gegenüber organischen Molekülen aufgrund ihrer paramagnetischen Natur und die Empfindlichkeit eines funktionellen Gruppen, die für Biokonjugation verw...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagenzien und Geräte </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203254-5G </td></tr><tr><td> p-SCN-Bn-DTPA </td><td> Makrocyclen </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> Ammoniumhydroxid </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Cellulose-Ester (CE) Dialysemembran - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex-LG Filter Units </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> Xylenolorange Tetranatriumsalz </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Inc. </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> Wasserreiniger </td><td> ELGA </td><td> Purelab Ultra- </td></tr><tr><td> Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie und Massenspektrometrie </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> Relaxationszeit Analysator </td><td> Bruker </td><td> mq60 minispec </td></tr><tr><td> UV-VIS Spektralphotometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> Gefriertrockner </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pH-Meter </td><td> Hanna Instruments </td><td> HALLO 221 </td></tr><tr><td> Spektrofluorometer </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> Fluoromax-4 </td></tr><tr><td> Molecular Weight Calculator Version 6,46 von Matthew Monroe, 17. Oktober 2009 heruntergeladen </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Molecular Weight Calculator </td></tr></tbody></table>

preparation, purification, and characterization of lanthanide complexes for use as contrast agents for magnetic resonance imaging

Polyaminopolycarboxylate-Liganden werden häufig verwendet, um Lanthanidionen Chelat, und die resultierenden Komplexe eignen sich als Kontrastmittel für die Kernspintomographie (MRI). Viele im Handel erhältliche Liganden sind besonders nützlich, da sie funktionelle Gruppen, die für schnelle, hochreine ermöglichen, und mit hoher Ausbeute Konjugation an Makromolekülen und Biomolekülen über aminreaktiven aktivierten Estern und Isothiocyanat-Gruppen oder Thiol-reaktive Maleinimide enthalten. Während Metallierung dieser Liganden wird als allgemein bekannt, im Bereich der Biokonjugation Chemie, subtile Unterschiede in Metallierung Verfahren müssen berücksichtigt werden bei der Auswahl Metall Ausgangsstoffe. Darüber hinaus mehrere Optionen für die Reinigung und Charakterisierung existieren, und die Auswahl der effektivsten Verfahren teilweise abhängig von der Auswahl der Ausgangsstoffe. Diese feinen Unterschiede sind oft in veröffentlichten Protokollen vernachlässigt. Hier ist es unser Ziel, gemeinsame Methoden für die Metallierung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoid-Komplexe, die als Kontrastmittel für die MRT (Abb. 1) verwendet werden können demonstrieren. Wir erwarten, dass diese Publikation ermöglicht biomedizinische Wissenschaftler Lanthanoid Komplexierung Reaktionen in ihr Repertoire von häufig verwendeten Reaktionen integrieren durch Lockerung der Auswahl der Ausgangsstoffe und Reinigungsverfahren.

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Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Wir zeigen die Metallierung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoid-Komplexen. Die hier beschriebenen Komplexe können konjugiert werden, um Makromoleküle, damit diese Rückverfolgung Moleküle mittels Magnetresonanztomographie.

Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

preparation-purification-characterization-lanthanide-complexes-for

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Biology

14.9K Aufrufe.  Wayne State University. Wir zeigen die Metallierung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoid-Komplexen. Die hier beschriebenen Komplexe können konjugiert werden, um Makromoleküle, damit diese Rückverfolgung Moleküle mittels Magnetresonanztomographie.

Serie: Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Forschung

Biologie

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantifizierung Mixing mit Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...