Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Aviären Virologie zu beantworten, z. B. wie immunsuppressive Viren mit B-Zellen interagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Zellen relevanter sind als verewigte Zelllinien, die derzeit im Labor verwendet werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Reaktion von Hühnerzellen auf IBDV bietet, kann sie auch auf ALV und REV angewendet werden.
Diese Methode reduziert die Anzahl der Vögel in unserer Forschung, und es ist vorteilhaft für die drei Rs, die für den Ersatz, die Verringerung und Die Verfeinerung der Verwendung von Tieren in der Forschung steht. In einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank den BF in 30 Milliliter kaltes PBS mindestens dreimal waschen. Übertragen Sie das gewaschene Gewebe in eine Petrischale und fügen Sie fünf Milliliter einer 1X Kollagennase D-Lösung hinzu.
Verwenden Sie eine sterile Schere oder eine Skalpellklinge, um den BF in Stücke mit einem Durchmesser von weniger als fünf Millimetern zu schneiden. Bei 37 Grad Celsius mit periodischer sanfter Rührung 30 Minuten inkubieren. Danach verwenden Sie eine sterile Pasteur Pipette, um die Mischung wiederholt anzusaugen, um den Zerfall des Gewebes zu fördern.
Fügen Sie weitere fünf Milliliter 1X Kollagennase D-Lösung in das Gewebe, und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius mit periodischer sanfter Agitation für weitere 30 Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Mischung ansipirieren, frische Kollagenase D-Lösung hinzufügen und inkubieren, bis das Gewebe vollständig verdaut ist. Beachten Sie, dass es kleine Granulate geben wird, die sich nicht weiter auflösen.
Übergeben Sie die verdaute Zellsuspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in 20 Milliliter 1x HBBS ohne Kalzium. Zentrifuge bei 400 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter n1X RPMI mit 5%FBS wieder auf.
Dann überlagern Sie 10 Milliliter der Zellsuspension auf fünf Milliliter Dichtegradientenmedien, die Polysucrose und Natriumdiatrizoat enthalten. Stellen Sie sicher, dass es eine klare Schnittstelle zwischen den beiden Ebenen gibt. Zentrifuge bei 900 mal g und vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Die Zellen sollten ein Band an der Schnittstelle zwischen dem Zellmedium und dem Dichtegradientenmedium bilden. Als Nächstes verwenden Sie eine sterile Pasteur Pipette, um die Zellen zu entfernen und sie in ein Rohr mit kaltem PBS zu übertragen. Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie fünf Minuten lang mit 400 mal g zentrieren und dann in kaltem PBS wieder aufhängen.
Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Zunächst zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 mal g für fünf Minuten. Setzen Sie die Zellen in 30 Millilitern des 1x kompletten IMDM aus.
Nehmen Sie ein Aliquot der Zellsuspension und fügen Sie es zu einer Trypan blue Lösung hinzu. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die Trypan blau ausschließen, und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und die prozentuale Lebensfähigkeit. Danach zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 mal g für fünf Minuten.
Resuspend die Zellen in vollständig IMDM ergänzt mit einer Ein-zu-20 Verdünnung von Huhn CD40 Liganden mit einer Dichte von 10 Millionen Zellen pro Milliliter. Kultur die Zellen in entweder 96-oder 24-Well-Platten für 48 bis 72 Stunden. 48 bis 72 Stunden nach der Isolation, tauen Sie ein Aliquot des Virus.
Wirbeln Sie die Probe, und speichern Sie es auf Eis. Setzen Sie die primären Bohrzellen im IMDM-Medium wieder aus. Nehmen Sie einen 10-Mikroliter Aliquot der Zellsuspension, und fügen Sie es zu 10 Mikroliter einer Trypan blau Lösung.
Bestimmen Sie dann die Anzahl der Zellen und die prozentuale Lebensfähigkeit. Verdünnen Sie das Virus in 1X komplette IMDM auf die entsprechende Vielzahl von Infektionen, um das Virus inoculum zu machen. Mischen Sie diese Verdünnung durch Wirbel.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie als Nächstes den Überstand, und suspendieren Sie die Zellen im Virus inoculum. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit periodischer Aufregung.
Danach zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie das Virus inoculum, und waschen Sie die Zellen in 1X komplette IMDM-Medien. Kultur die Zellen entweder in 96-oder 24-Well-Platten.
In dieser Studie werden Hühner-Primär-Bursalzellen sukzessive ex vivo in Gegenwart von löslichem Huhn CD40 Ligand kultiviert. Zellen, die in Gegenwart von löslichem Huhn CD40 Ligand kultiviert werden, werden gesehen, um das Vierfache von 902, 000 auf 3,63 Millionen pro Milliliter über einen Zeitraum von sechs Tagen zu erhöhen. Die Zelllebensfähigkeit wird auch in Gegenwart von Huhn CD40 Ligand deutlich verbessert.
In repräsentativen konfokalen Mikroskopiebildern wird eine grüne Fluoreszenz um den Zellkern gesehen, die mit dem Vorhandensein von IBDV im Zytoplasma übereinstimmt. Dies ist offensichtlich für zwei Stämme von IBDV, eine zellkulturangepasste Sorte, D78, und eine sehr virulente Sorte, UK661. Die RNA wird dann nach der Infektion nach fünf, 18, 24 und 48 Stunden extrahiert und RT-qPCR mit Primern unterzogen, die spezifisch für eine konservierte Region des IBDV VP4-Gens sind.
IbDV VP4 Ausdruck wird gesehen, um auf 16, 603 Kopien bei 48 Stunden nach der Infektion mit D78 und auf 38, 632 Kopien bei 48 Stunden Nachinfektion mit UK661 zu erhöhen. Diese Daten zeigen, dass primäre Bursalzellen von Hühnern die Replikation zellkulturangepasster und sehr virulenter IBDV-Stämme unterstützen können. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie RT-qPCR, Microarray oder RNA-Seq durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Zellen auf die Infektion reagieren.
Wir haben verglichen, wie die Zellen auf infektionen mit einem abgeschwächten Stamm und einem sehr virulenten Stamm von IBDV reagieren und wir untersuchen nun, wie sie auf andere Virusinfektionen reagieren. Die Fähigkeit, diese Zellen zu kultizieren, ermöglicht es uns, Aspekte der Viruspathogenese und Immunsuppression zu untersuchen, ohne Vögel infizieren zu müssen. Dies wird erhebliche Auswirkungen auf die drei R, die Ersetzung, Verfeinerung und Verringerung des Einsatzes von Tieren in der Forschung haben.
