Les auteurs tiennent à remercier Kelly A. Burke pour une assistance technique à la préparation du substrat ACC. Basé sur l&#39;article publié dans les biomatériaux, Davis KA, et al, le comportement des cellules à mémoire de forme dynamique sur substrats polymères, biomatériaux, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Ce matériel est basée sur des travaux soutenus par la NSF sous Grant No. DMR-0907578.

1. Isotherme UV du NOA63 <ol><li> Une chambre de durcissement personnalisé a été développé en utilisant une lame de verre (75 mm x 25 mm x 1 mm), de 1 mm d&#39;épaisseur entretoise en téflon et une plaque d&#39;aluminium (75 mm x 25 mm x 3 mm) comme le montre la figure 1. La chambre est maintenu par des clips liant petits. </li><li> Injecter l&#39;NOA63 dans la chambre à travers un trou dans l&#39;entretoise en téflon en utilisant une aiguille de calibre 18. Le NOA63 peut être chauffé doucement à la facilité d&#39;injection. </li><li> Placer la chambre sur une plaque chauffante à 125 ° C et laisser chauffer à une température uniforme pendant 5 min. </li><li> Pré-traitement du NOA63 dans une chambre de la lampe UV (λ max = 365 nm; voir tableau) pendant 20 min avec la lampe de 6,5 cm de la surface du verre. </li><li> Retirez le NOA63 de la chambre à chaud en utilisant une lame de rasoir. </li><li> Post-traitement de la NOA63 sous la lumière UV pendant 3 h 40 m sur la plaque chauffante à 125 ° C. </li><li> Stocker le NOA63 desséchée à -20 ° C. </li></ol> 2. Caractérisation mémoire de forme de NOA63 <ol><li> Préparer un spécimen d&#39;haltère par pressage à chaud une guéri NOA63 film avec un poinçon personnalisé (voir tableau), dont les dimensions sont indiquées dans la figure 2. </li><li> Chargez le spécimen dans un analyseur mécanique dynamique (DMA, voir le tableau) avec fixation à la traction. Régler l&#39;instrument à la &quot;force contrôlée&quot; mode, puis programmez la procédure de test comme suit: <ol><li> S&#39;équilibrer à 95,00 ° C </li><li> Isotherme pour 10,00 min </li><li> Rampe vigueur 0.300 N / min à 2.500 N </li><li> Isotherme pour 5,00 min </li><li> Rampe 2,00 ° C / min à 20,00 ° C </li><li> Isotherme pour 10,00 min </li><li> Rampe vigueur 0.300 N / min à 0,015 N </li><li> Isotherme pour 5,00 min </li><li> Rampe 2,00 ° C / min à 95,00 ° C </li><li> Répétez les étapes 2-9 deux fois plus </li></ol></li></ol> 3. Préparation des substrats de culture cellulaire active <ol><li> Les échantillons individuels peuvent être préparés à partir de la pellicule isotherme guéri SMP. Couper le film SMP avec un rasoir à la taille de l&#39;échantillon désiré. Placez le SMP sur une plaque chauffante réglée à une température supérieure à la Tg de réduire le module et la facilité de découpe. </li><li> La forme temporaire peut être fixé à un certain nombre de façons différentes. Ici, nous utilisons un banc de presse Top hydraulique avec chauffage / refroidissement plateaux pour gaufrer une topographie temporaire. Réglez la température des plateaux à une température supérieure à la Tg. </li><li> Une embosseuse a été faite par Epoxy sur un disque vinyle. Ceci va produire une forme temporaire de rainures parallèles. Ici, l&#39;embosseuse avait pics triangulaires de 35 à 40 um et 60 um haute gamme, espacés 80 um d&#39;intervalle. Le gaufrage peut être fabriqué à partir d&#39;autres matériaux et aux topographies différentes, mais doit être plus rigide que NOA63 à la température de gaufrage. Placer les échantillons SMP face cachée sur l&#39;embosseuse et le lieu des échantillons et embosseuse dans la presse. </li><li> Appliquer une précharge ~ 100 kPa à prendre contact entre les plaques chauffantes et les échantillons et maintenez pendant environ 5 minutes pour permettre les échantillons pour atteindre une température uniforme. </li><li> Appliquer 1-6 MPa à des échantillons et maintenir pendant 1 minute. Un stress de 4,7 MPa conduit à la réplication incomplète de la topographie embosseuse. La topographie temporaires produit a arrondi des pics de 25 à 35 um et 150 um haute gamme. Le SMP fracture si une plus grande contrainte est appliquée. Appliquer petites contraintes d&#39;introduire des topographies avec de petites amplitudes. </li><li> Réduire la température en dessous de la T g. Ici, nous utilisons la capacité de refroidissement d&#39;eau des plateaux de presse. </li><li> Lorsque la température est inférieure à la Tg, retirez la force appliquée. </li><li> Les échantillons peuvent être conservés desséchée à -20 ° C. Lorsqu&#39;elles sont stockées dans ces conditions, nous avons observé une baisse inférieure à 1 um dans la récupération d&#39;amplitude après deux mois pour les échantillons de relief avec l&#39;embosseuse disque vinyle. </li></ol> 4. Actif expérience de culture cellulaire <ol><li> La lumière UV d&#39;une enceinte de sécurité biologique (BSC) est utilisé pour stériliser les échantillons. Disposer les échantillons face vers le bas dans des boites stériles sans couvercle et allumez la lumière UV BSC pendant 6 h. </li><li> Échantillons Flip nouvelles boites stériles face. Allumez la lumière UV BSC pendant 6 h. </li><li> Les échantillons doivent maintenant être équilibrée à un état relativement stable avant l&#39;étalement des cellules. Placer les échantillons dans une plaque de 96 puits et ajouter 150 ul de milieu de croissance complet. </li><li> Mettez la plaque dans un incubateur à 30 ° C avec 5% de CO 2 jusqu&#39;à la récupération souhaité partielle. Ici, nous utilisons 30 h pour produire des échantillons avec une amplitude assez grande pour aligner les cellules. </li><li> Les échantillons peuvent maintenant être plaqués avec des cellules. Placer les échantillons dans une nouvelle plaque de 96 puits. </li><li> Ajouter 150 pi de solution de cellule pour les échantillons. Ici, nous utilisons C3H/10T1/2 fibroblastes embryonnaires de souris à 20.000 cellules / ml pour atteindre des cellules isolées (généralement pas en contact avec d&#39;autres cellules). </li><li> Pour permettre aux cellules d&#39;attacher et de répandre sur la topographie temporaires, placer dans un incubateur à 30 ° C pendant 9,5 h. </li><li> Pour Morphol cellules testgie avant la transition, prélever des échantillons et effectuer des taches et l&#39;imagerie de fluorescence des échantillons. Ce matériau présente l&#39;autofluorescence à travers la plupart de la gamme UV et visible. Fluorophores dans l&#39;extrémité rouge du spectre, comme Alexa Fluor 647 sont recommandés pour réduire de fond. </li><li> Pour déclencher des échantillons de récupérer, déplacer la plaque à un incubateur à 37 ° C et continuer la culture pendant 19 h pour permettre au matériel de récupérer et de permettre aux cellules de s&#39;adapter à leur morphologie la nouvelle topographie. </li><li> Retirer les échantillons et appliquer la couleur appropriée (pour la phalloïdine filamenteuses actine imagerie) et l&#39;imagerie des procédures. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Guéri NOA63 est transparent, solide vitreux qui possède d&#39;excellentes propriétés de mémoire de forme comme le montre la figure 3. Dans ce cas, le matériel a été guéri comme dans le protocole 1 ci-dessus et montre un uniforme Tg de 51,1 ° C (déterminée à partir de l&#39;apparition de la chute de E &#39;). Il est observé de l&#39;un des cycles de manière à mémoire de forme (chauffage, déformant, le refroidissement, la récupération, la figure 3) qui, un grand pourcentage de souche a été fixée après le déchargement à 20 ° C, correspondant à un ratio de 15 fixation (Rf) de 89,3 % (moyenne sur trois cycles: le dessous de même pour R r). La souche fixes récupérés à un taux de récupération (R r) de 84,4% dans une plage de température relativement faible pendant le chauffage. En outre, les performances de mémoire de forme n&#39;a montré aucune altération jusqu&#39;à trois cycles, en ce que toutes les courbes suivent presque exactement avec l&#39;autre. NOA63 a été utilisé dans ce protocole, car il est facilement disponible chez le fabricant et fourni comme une facilement guéries sans solvant prépolymère avec photoamorceur. Cependant, sa composition n&#39;est pas divulguée par le fournisseur. Il a été trouvé pour permettre la fixation des cellules de haute et de la viabilité. Enfin, la température de transition pourrait être réglé pour permettre une magnitude significative de récupération entre les deux températures de cellules compatibles. Un certain nombre d&#39;autres systèmes polymères pourrait également être utilisé avec ce protocole, si la température de transition est compatible avec la culture cellulaire et si elles favorisent l&#39;adhérence et la viabilité cellulaire. L&#39;amplitude de la topographie temporaire (rainures) diminue au fil du temps à 30 ° C. En 30 h à 30 ° C, l&#39;amplitude a été réduite d&#39;environ 50% (figure 4, le temps 0) 16. Il réduit de 10% supplémentaires au cours des prochaines 9,5 h. Lorsque la récupération est déclenchée par l&#39;augmentation de la température à 37 ° C, l&#39;amplitude se réduit à 0,5% de l&#39;amplitude initiale dans 9,5 h. Pour l&#39;embosseuse utilisée et un stress gaufrage de 4,9 MPa, ce qui correspond à un changement fonctionnel des rainures 13 um d&#39;une surface presque plate. Un exemple d&#39;un comportement cellulaire contrôlée par l&#39;utilisation des actifs substrats de culture cellulaire est un changement dans l&#39;organisation du cytosquelette. Sur temporaires substrats rainurés avant la récupération est déclenchée, le microfilaments d&#39;actine s&#39;alignent le long de la direction des rainures (figure 5a) 16. Après la récupération par l&#39;augmentation de la température, les microfilaments sont réorganisés et sont orientés de façon aléatoire. Les échantillons de contrôle qui ont des rainures statique ou une surface plane statiques ne réorganise après l&#39;augmentation de la température (figure 5b, c). <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1: Schéma d&#39;NOA63 chambre de durcissement. Vue en coupe (à gauche) et top-down vue sans couvercle en verre (à droite). <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2: La géométrie d&#39;haltères utilisées pour la caractérisation à mémoire de forme en vrac W:. Largeur de section étroite, L: longueur de section étroite, G: longueur de jauge, WO: largeur hors tout, LO: la longueur totale, D: distance entre les poignées, R: rayon de filet, et RO: rayon extérieur. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3: La mémoire de forme en vrac unidirectionnelle d&#39;un seul NOA63 guérir, répété 3 fois (l&#39;astérisque indique le début d&#39;expérimentation). Au point marquées d&#39;un astérisque, le polymère a été chauffé et est ensuite déformé en appliquant une contrainte de définir sa forme provisoire. Cette souche est maintenue constante, et la température est réduite à fixer la forme ci-dessous temporaires à la Tg du polymère. La température est alors augmentée, et le matériau récupère sa forme permanente que la souche temporaire est réduite. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4: récupération SMP peut être déclenchée en vertu de culture cellulaire compatible températures. L&#39;amplitude de 25,6 ± 0,8 um présents suivantes rec gaufrageovered à 12,6 ± 1,5 um après 30 équilibration h à 30 ° C (temps 0, les cercles noirs). Après les échantillons ont été déplacés vers un incubateur à 37 ° C (9,5 h), l&#39;amplitude récupérés à 1,1 ± 0,2 um à moins de 3,5 h. L&#39;amplitude récupérés à ~ 0,3 ± 0,1 um dans les 9,5 h et aucune diminution détectable au cours de la dernière 9,5 h ont été observés (triangles rouges). Les barres d&#39;erreur représentent un écart type (n = 4-6). Les traces sont de contact scans profilométrie d&#39;échantillons représentatifs. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5: cytosquelette d&#39;actine cellulaire réorganise suite de la transition topographique une des images, confocale de cellules marquées avec la phalloïdine sur des substrats en relief montrent microfilaments aligné avec la direction rainure (flèche blanche) avant de transition et d&#39;augmenter la température.. Après la transition, les microfilaments sont réarrangés sont orientées de façon aléatoire. B, les cellules sur des substrats de contrôle plate montrent microfilaments orientés de façon aléatoire, avant et après augmentation de la température. C, les cellules sur des substrats de contrôle rainuré montrent microfilaments aligné avec la direction sillon avant et après augmentation de la température. La barre d&#39;échelle est de 100 um. Les traces sont comme dans la Figure 4.

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La T g de NOA63 peut être facilement contrôlée via la température de cuisson. Nous avons utilisé ce pour générer des substrats SMP qui peut être déclenchée dans une plage de cellules compatibles. NOA63 est plastifié par l&#39;eau qui abaisse le sèche T g, donc nous avons augmenté le sec T g par cuisson à 125 ° C pour déplacer la plage mouillée Tg entre 30 et 37 ° C. Les substrats de culture de cellules actives démontré sont capables de con...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif ou d&#39;un instrument </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> NOA63 </td><td> Norland Products Inc </td><td> NOA63 </td><td> Numéro de lot 111 </td></tr><tr><td> Dogbone punch </td><td> TestResource, Inc Shakopee, MN </td><td></td><td> À échelle réduite de type IV DogBone (ASTM D638-03) </td></tr><tr><td> Benchtop presse hydraulique </td><td> Sculpteur </td><td> 3851 </td><td></td></tr><tr><td> C3H10T1 / 2 Souris fibroblastes embryonnaires </td><td> ATCC </td><td> CCL-226 </td><td></td></tr><tr><td> Cabinet de sécurité biologique </td><td> Thermo Fisher </td><td> 1357 </td><td></td></tr><tr><td> Lampe UV </td><td> Spectroline </td><td> SB-100PC </td><td></td></tr><tr><td> Dynamique Analyseur mécanique (DMA) </td><td> TA Instruments, Inc </td><td> Q800 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence inversé </td><td> Leica </td><td> Leica DMI 4000B </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal à balayage laser </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> 20x/0.8 NA air ou un objectif 40x/1.30 huile NA </td></tr></tbody></table>

shape memory polymers for active cell culture

Polymères à mémoire de forme (PSM) sont une classe de matériaux «intelligents» qui ont la capacité de changer à partir d&#39;un fixe, forme temporaire à une forme pré-déterminé permanente sur l&#39;application d&#39;un stimulus comme la chaleur 1-5. Dans un cycle de mémoire de forme typique, le SMP est d&#39;abord déformé à une température élevée qui est supérieure à sa température de transition, T trans [soit la température de fusion (T m) ou la température de transition vitreuse (Tg)]. La déformation est élastique dans la nature et conduit principalement à une réduction de l&#39;entropie conformationnelle des chaînes du réseau constitutifs (suivant la théorie de l&#39;élasticité du caoutchouc). Le SMP est déformée, puis refroidi à une température inférieure à son T trans, tout en maintenant la souche externe ou un stress constant. Pendant le refroidissement, les transitions d&#39;un état du matériel plus rigide (semi-cristallins ou vitreux), ce qui cinétique des pièges ou «gèle» la matière dans cet état de faible entropie conduit à fixer la forme macroscopique. Récupération de forme est déclenchée par le chauffage du matériau en continu à travers T trans sous une contrainte-libre (sans contrainte) condition. En permettant les chaînes du réseau (à mobilité retrouvé) pour se détendre à leur thermodynamiquement favorisée, maximum d&#39;entropie état, les changements importants de la forme temporaire de la forme permanente. Les cellules sont capables d&#39;arpentage des propriétés mécaniques de leur environnement 6. Les mécanismes par lesquels les interactions mécaniques entre les cellules et leur comportement physique des cellules environnement de contrôle sont des domaines de recherche très actif. Les substrats de la topographie définie sont apparus comme des outils puissants dans l&#39;enquête sur ces mécanismes. Méso-échelle, microscopique, et les schémas de la topographie nanométrique substrat a été démontré directement l&#39;alignement des cellules, l&#39;adhésion cellulaire, et des forces de traction cellulaire 7-14. Ces conclusions ont souligné le potentiel de la topographie du substrat de contrôler et de doser les interactions mécaniques entre les cellules et leur environnement physique pendant la culture cellulaire, mais les substrats utilisés à ce jour ont été généralement passive et ne pouvait pas être programmé pour changer de façon significative au cours de la culture. Cette stase physiques a limité le potentiel de substrats topographique pour contrôler les cellules en culture. Ici, actif sur culture cellulaire (ACC) substrats SMP sont introduits, qui emploient à mémoire de forme de surface pour fournir un contrôle programmé de la topographie du substrat et de déformation. Ces substrats démontrer la capacité de transition d&#39;une topographie temporaires rainurée pour une seconde, la topographie mémorisé presque plat. Ce changement dans la topographie peut être utilisé pour contrôler le comportement des cellules dans des conditions standard de culture cellulaire.

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Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Une méthode de développement de substrats de culture cellulaire avec la possibilité de changer la topographie lors de la culture est décrite. La méthode permet l&#39;utilisation de matériaux intelligents connus comme les polymères à mémoire de forme qui ont la capacité de mémoriser une forme permanente. Ce concept est adaptable à une large gamme de matériaux et d&#39;applications.

Polymères à mémoire de forme pour la Culture cellule active

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K vues.  Syracuse Biomaterials Institute. Une méthode de développement de substrats de culture cellulaire avec la possibilité de changer la topographie lors de la culture est décrite. La méthode permet l'utilisation de matériaux intelligents connus comme les polymères à mémoire de forme qui ont la capacité de mémoriser une forme permanente. Ce concept est adaptable à une large gamme de matériaux et d'applications.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Recherche

Bio-ingénierie

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabrication microfluidique de fibres polymères et biohybrides avec une taille et une forme redessinées

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

Cellulaire in vitro modèle de culture pour le contrôle des produits chimiques toxiques inhalés

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect &#8220;self-fitting.&#8221; In this way, following exposure to warm saline (~60 &#186;C), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 &#186;C) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Fabrication of a Bioactive, PCL-based &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Scaffold

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Fabrication d&#39;une mémoire de forme &quot;auto-ajustement&quot; à base de PCL bioactifs, Polymer Échafaudages

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Reconnaissance moléculaire Ingénierie avec Polymères Bio-mimétiques sur simple Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...