Os autores gostariam de agradecer a Kelly A. Burke de assistência técnica com a preparação do substrato ACC. Baseado no artigo publicado em Biomateriais, Davis KA, et al, o comportamento das células de memória dinâmica na forma de polímero substratos, Biomateriais, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Este material é baseado num trabalho apoiado pela NSF Grant sob No. DMR-0907578.

1. Isotérmica de cura UV-NOA63 <ol><li> A câmara de cura personalizado foi desenvolvido utilizando uma lâmina de vidro (75 mm x 25 mm x 1 mm), um espaçador de 1 milímetro de espessura Teflon, e uma placa de alumínio (75 mm x 25 mm x 3 mm), conforme mostrado na Figura 1. A câmara é realizada em conjunto com grampos da pasta pequena. </li><li> Injetar o NOA63 na câmara através de um buraco no espaçador Teflon usando uma agulha de calibre 18. O NOA63 pode ser gentilmente aquecida para facilitar a injeção. </li><li> Coloque a câmara sobre uma chapa quente fixado em 125 ° C e deixe aquecer a uma temperatura uniforme por 5 min. </li><li> Pré-cura do NOA63 em uma câmara da lâmpada UV (λ max = 365 nm, ver tabela) por 20 minutos com a lâmpada de 6,5 cm da superfície do vidro. </li><li> Remover o NOA63 da câmara a quente usando uma lâmina de barbear. </li><li> Pós-cura a NOA63 sob a luz UV por 3 h 40 m na placa quente a 125 ° C. </li><li> Armazenar os NOA63 desidratado a -20 ° C. </li></ol> 2. Caracterização memória de forma NOA63 <ol><li> Prepare um espécime dumbbell por prensagem a quente uma curado NOA63 filme com um soco personalizado (ver tabela), cujas dimensões são mostrados na Figura 2. </li><li> Carregar a amostra em um analisador dinâmico mecânica (DMA; ver tabela) com fixação de tração. Definir o instrumento para &quot;força controlada&quot; modo, então o programa o procedimento de teste da seguinte forma: <ol><li> Equilibrar a 95,00 ° C </li><li> Isotérmicos para 10,00 min </li><li> Rampa de força de 0,300 N / min a 2,500 N </li><li> Isotérmicos para 5,00 min </li><li> Rampa de 2,00 ° C / min para 20,00 ° C </li><li> Isotérmicos para 10,00 min </li><li> Rampa de força de 0,300 N / min a 0,015 N </li><li> Isotérmicos para 5,00 min </li><li> Rampa de 2,00 ° C / min para 95,00 ° C </li><li> Repita os passos 2-9 mais duas vezes </li></ol></li></ol> 3. Preparação de Substratos Cultura atividade celular <ol><li> Amostras individuais podem ser preparados a partir do filme SMP isotermicamente curado. Cortar o filme SMP com uma navalha ao tamanho da amostra desejado. Coloque o SMP em uma chapa quente set a uma temperatura maior que a T g para reduzir o módulo e facilidade de corte. </li><li> A forma temporária pode ser fixado em um número de maneiras diferentes. Aqui usamos um banco de imprensa top hidráulico com quente / frio platens para emboss uma topografia temporária. Regule a temperatura do platens a uma temperatura acima da T g. </li><li> Uma impressora foi feita por cura epóxi em um disco de vinil. Isto irá produzir uma forma temporária de sulcos paralelos. Aqui, a impressora teve picos triangulares 35-40 mM de altura e 60 m de largura, espaçadas 80 mM distante. A impressora pode ser feita de outros materiais e com diferentes topografias, mas deve ser mais duro do que NOA63 na temperatura relevos. Coloque o SMP amostras de bruços sobre a impressora e colocar as amostras e impressora na imprensa. </li><li> Aplicar um pré-carga ~ 100 kPa para fazer o contato entre os pratos de aquecimento e as amostras e segure por aproximadamente 5 minutos para permitir que as amostras para chegar a uma temperatura uniforme. </li><li> Aplicar 1-6 MPa para as amostras e segure por um minuto. A tensão de 4,7 MPa leva a replicação incompleta da topografia impressora. A topografia temporária produzido tem picos arredondados 25-35 mM de altura e 150 m de largura. O SMP será fratura se um maior estresse é aplicado. Aplique tensões menores para introduzir topografias com amplitudes menores. </li><li> Reduzir a temperatura abaixo da T g. Aqui usamos a capacidade de refrigeração de água da platens imprensa. </li><li> Quando a temperatura está abaixo da T g, retire a força aplicada. </li><li> As amostras podem ser armazenadas desidratado a -20 ° C. Quando armazenado sob estas condições, temos observado uma diminuição menos de 1 mícron em recuperação amplitude após dois meses de amostras em relevo com a impressora disco de vinil. </li></ol> 4. Experimento de Cultura ativos celular <ol><li> A luz UV de um gabinete de segurança biológica (CSB) é usado para esterilizar as amostras. Providenciar as amostras de bruços em pratos estéril, sem tampas e ligar a luz UV BSC por 6 h. </li><li> Amostras virar para novos pratos estéril face para cima. Acender a luz UV BSC por 6 h. </li><li> As amostras agora precisam ser equilibrados para um estado relativamente estável antes do plaqueamento com células. Colocar as amostras em uma placa de 96 poços e adicionar 150 mL de meio de crescimento completo. </li><li> Coloque a placa em um 30 ° C incubadora com 5% de CO 2 até alcançar a desejada recuperação parcial. Aqui usamos 30 h para produzir amostras com amplitude grande o suficiente para alinhar as células. </li><li> As amostras podem agora ser revestida com as células. Colocar as amostras em uma placa de 96 novos também. </li><li> Adicionar 150 ml de solução de células às amostras. Aqui usamos C3H/10T1/2 fibroblastos embrionárias de camundongos em 20.000 células / ml para atingir células isoladas (em geral não estão em contacto com outras células). </li><li> Para permitir que as células a unir e espalhar sobre a topografia temporária, coloque em uma incubadora de 30 ° C por 9,5 h. </li><li> A morfologia das células ensaiogia antes da transição, retire amostras e realizar coloração e imagens de fluorescência das amostras. Este material apresenta autofluorescência durante a maior parte da faixa de UV e visível. Fluoróforos no extremo vermelho do espectro, tais como Alexa Fluor 647 são recomendados para reduzir fundo. </li><li> Para disparar amostras para se recuperar, mover o prato para a 37 ° C incubadora e continuar a cultura por 19 h para permitir que o material para a recuperação e permitir que as células de adaptar a sua morfologia para a nova topografia. </li><li> Retirar amostras e aplicar mancha apropriado (phalloidin de actina filamentosa de imagem) e de imagens dos procedimentos. </li></ol> 5. Resultados representativos: Curada NOA63 é um sólido, transparente vítreo que tem propriedades excelente forma de memória conforme mostrado na Figura 3. Neste caso, o material foi curado como no Protocolo 1 acima e mostra um uniforme T g de 51,1 ° C (determinado a partir do início da queda E &#39;). Observa-se da um jeito ciclos de memória de forma (aquecimento, deformação, refrigeração, recuperando-se, a Figura 3) que, uma grande porcentagem de tensão foi fixado após a descarga a 20 ° C, correspondendo a um rácio de fixação 15 (R f) de 89,3 % (em média mais de três ciclos; o mesmo abaixo de R r). A cepa fixa recuperado em uma proporção de recuperação (R r) de 84,4% em uma faixa de temperatura relativamente pequenas durante o aquecimento. Além disso, o desempenho de memória de forma não apresentaram deterioração até três ciclos, em que todas as curvas seguem quase exactamente com o outro. NOA63 foi usado neste protocolo porque está prontamente disponível a partir do fabricante e fornecido como um pré-polímero facilmente curadas sem solvente com fotoiniciador. No entanto, sua composição não é divulgada pelo fornecedor. Verificou-se a permitir a ligação das células de alta e viabilidade. Finalmente, a temperatura de transição podem ser ajustadas para permitir uma magnitude significativa de recuperação entre as duas temperaturas celular compatível. Uma série de outros sistemas de polímero também pode ser usado com este protocolo, se a temperatura de transição é compatível com a cultura de células e se promover a adesão e viabilidade celular. A amplitude da topografia temporária (grooves) diminui ao longo do tempo a 30 ° C. Por 30 h, a 30 ° C, a amplitude foi reduzida em ~ 50% (Figura 4, o tempo 0) 16. Reduz mais 10% nos próximos 9,5 h. Quando a recuperação é desencadeada pelo aumento da temperatura para 37 ° C, a amplitude se reduz a 0,5% da amplitude inicial dentro de 9,5 h. Para a impressora usada e uma tensão de 4,9 MPa relevo, isto corresponde a uma mudança funcional de 13 mM sulcos em uma superfície quase plana. Um exemplo de um comportamento de células controlado através do uso de substratos de cultura de células ativas é uma mudança na organização do citoesqueleto. Em temporária substratos ranhuras antes da recuperação é disparado, o microfilamentos de actina alinhar ao longo da direção dos sulcos (Figura 5a) 16. Após a recuperação por aumento da temperatura, os microfilamentos têm reorganizado e são orientados aleatoriamente. Amostras de controle que têm sulcos estática ou uma superfície plana estática não reorganizar após o aumento da temperatura (Figura 5b, c). <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: Esquema de NOA63 câmara de cura. Cross-section view (esquerda) e top-down vista sem tampa de vidro (direita). <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2: A geometria dumbbell utilizados para a caracterização granel memória de forma W:. Largura de seção estreita, L: comprimento da parte estreita, G: comprimento gage, WO: largura total, LO: comprimento total, D: distância entre apertos, R: raio de filé, e RO: raio externo. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3: A maior parte de memória de forma unilateral de uma cura NOA63 única, repetida três vezes (o asterisco indica o início experimental). No ponto indicado com um asterisco, o polímero foi aquecida e é então deformado pela aplicação de um esforço para definir sua forma temporária. Esta tensão é mantida constante, ea temperatura é diminuída para corrigir a forma temporária abaixo da T g do polímero. A temperatura é então aumentada, eo material recupera a sua forma permanente, a tensão temporária é reduzida. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4: Recuperação de SMP pode ser acionado em cultura de células compatíveis com as temperaturas. A amplitude de 25,6 ± 0,8 mM presente seguintes rec embossingovered para 12,6 ± 1,5 mM após 30 h de equilíbrio a 30 ° C (tempo 0, círculos pretos). Depois que as amostras foram transferidas para a 37 ° C incubadora (9,5 h), a amplitude recuperado para 1,1 ± 0,2 m dentro de 3,5 h. A amplitude recuperado para ~ 0,3 ± 0,1 mícron dentro de 9,5 h e não houve diminuição detectável ao longo dos últimos 9,5 h foi observada (triângulos vermelhos). Barras de erro representam um desvio padrão (n = 4-6). Traços são scans contato perfilometria de amostras representativas. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5: citoesqueleto de actina celular reorganiza seguintes transição topográfica uma imagens, Confocal de células marcadas com phalloidin em substratos em relevo mostram microfilamentos alinhado com sulco direção (seta branca) antes da transição e aumento da temperatura.. Depois da transição, microfilamentos têm reorganizados são orientados aleatoriamente. B, células em substratos de controle plana mostrar microfilamentos orientados aleatoriamente, antes e após o aumento da temperatura. C, células em substratos de controle mostram ranhuras microfilamentos alinhados com a direção sulco antes e depois do aumento da temperatura. Barra de escala é 100 mm. Traços são como na Figura 4.

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	<li>Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+progress+in+shape-memory+polymers.">Review of progress in shape-memory polymers.</a> J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).</li><li>Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+Memory+Polymer+Research.">Shape Memory Polymer Research.</a> Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).</li><li>Lendlein, A., Kelch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+Memory+Polymers.">Shape Memory Polymers.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).</li><li>Ratna, D., Karger-Kocsis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+shape+memory+polymers+and+composites:+a+review.">Recent advances in shape memory polymers and composites: a review.</a> J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).</li><li>Rousseau, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+shape+memory+polymers:+A+review+of+the+progress+toward+overcoming+SMP's+limitations.">Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations.</a> Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).</li><li>Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flexible,+quantum+dot-labeled+cantilever+post+array+for+studying+cellular+microforces.">A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces.</a> Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).</li><li>du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+mapping+in+epithelial+cell+migration.">Force mapping in epithelial cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).</li><li>Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+on-demand+cell+alignment+using+reconfigurable+microtopography.">Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography.</a> Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).</li><li>Stevens, M. M., George, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+and+engineering+the+cell+surface+interface.">Exploring and engineering the cell surface interface.</a> Science. 310, 1135-1135 (2005).</li><li>Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+an+approach+to+isolate+mechanical.">Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical.</a> 100, 1484-1484 (2003).</li><li>Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+human+keratocytes+to+micro-+and+nanostructured+substrates.">Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).</li><li>Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Considerations+of+Micro-+to+Nanoscale+Elastomeric+Post+Arrays+to+Study+Cellular+Traction+Forces.">Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces.</a> Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).</li><li>Zhao, Y., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Mechanics+Study+in+Cardiac+Myocytes+Using+PDMS+Pillars+Array.">Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array.</a> Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).</li><li>DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functionally+Graded+Shape+Memory+Polymer.">A Functionally Graded Shape Memory Polymer.</a> Soft Matter. 7, 68-68 (2011).</li><li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates.">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A T g de NOA63 pode ser facilmente controlado através da temperatura de cura. Usamos isso para gerar SMP substratos que podem ser acionados em um intervalo de células compatíveis. NOA63 é plastificada pela água que reduz a seco T g, por isso aumentou a seco T g por cura a 125 ° C para mover a faixa úmida Tg entre 30 e 37 ° C. Os substratos célula ativa cultura demonstrados são capazes de controlar o comportamento das células. Os resultados de reorg...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou instrumento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> NOA63 </td><td> Norland Products Inc. </td><td> NOA63 </td><td> Número do lote 111 </td></tr><tr><td> Dogbone Soco </td><td> TestResource, Inc. Shakopee, MN </td><td></td><td> Em escala reduzida Tipo IV dogbone (ASTM D638-03) </td></tr><tr><td> Bancada hidráulica Imprensa </td><td> Entalhador </td><td> 3851 </td><td></td></tr><tr><td> C3H10T1 / 2 Mouse fibroblastos embrionárias </td><td> ATCC </td><td> CCL-226 </td><td></td></tr><tr><td> Gabinete de Segurança Biológica </td><td> Thermo Fisher </td><td> 1357 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada UV </td><td> Spectroline </td><td> SB-100PC </td><td></td></tr><tr><td> Analyzer mecânica dinâmica (DMA) </td><td> TA Instruments, Inc. </td><td> Q800 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência invertido </td><td> Leica </td><td> Leica DMI 4000B </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de varredura confocal a laser </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> 20x/0.8 NA ar ou um 40x/1.30 objetivo de óleo NA </td></tr></tbody></table>

shape memory polymers for active cell culture

Polímeros com memória de forma (SMPs) são uma classe de materiais &quot;inteligentes&quot; que têm a capacidade de mudar de uma forma, fixa temporária a uma forma pré-determinada permanente sobre a aplicação de um estímulo, como o calor 1-5. Em um ciclo típico de memória de forma, o SMP é o primeiro deformado a uma temperatura elevada que é superior à sua temperatura de transição, T trans [ou a temperatura de fusão (T m) ou a temperatura de transição vítrea (T g)]. A deformação é elástica na natureza e, principalmente, leva a uma redução da entropia conformacional das cadeias constituintes da rede (seguindo a teoria da elasticidade de borracha). A SMP deformado é então resfriado a uma temperatura abaixo de sua T trans, mantendo a tensão externa ou estresse constante. Durante o resfriamento, as transições de material para um estado mais rígida (semi-cristalino ou vítreo), que cineticamente armadilhas ou &quot;congela&quot; o material neste estado de baixa entropia levando a fixação forma macroscópica. Recuperação de forma contínua é provocada por aquecimento do material através da T trans sob um stress-free condição (sem restrições). Ao permitir que as cadeias de rede (com mobilidade recuperou) para relaxar a sua termodinamicamente favorecido, o estado máximo de entropia, o material muda de forma temporária à forma permanente. Células são capazes de levantamento das propriedades mecânicas do seu ambiente circundante 6. Os mecanismos pelos quais as interações mecânicas entre as células e seus ambiente físico comportamento da célula de controle são áreas de pesquisa ativa. Substratos de topografia definida surgiram como ferramentas poderosas na investigação destes mecanismos. Mesoescala, microescala, e os padrões em nanoescala da topografia do substrato foram mostrados para dirigir o alinhamento celular, adesão celular, e as forças de tração de células 7-14. Esses achados têm ressaltou o potencial para a topografia do substrato para controlar e ensaio as interações mecânicas entre as células e seu meio ambiente físico durante a cultura de células, mas os substratos utilizados até à data têm sido geralmente passivo e não poderia ser programado para mudar significativamente durante a cultura. Esta estase física tem limitado o potencial de substratos topográfica para controlar células em cultura. Aqui, ativos de cultura de células substratos (ACC) são introduzidos SMP que utilizam memória de superfície de forma programada para fornecer controle da topografia do substrato e deformação. Estes substratos demonstrar a capacidade de transição de uma topografia temporária ranhuras para um segundo, topografia quase plana memorizado. Esta mudança na topografia pode ser usado para controlar o comportamento de células sob condições de cultura de células padrão.

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Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Um método para o desenvolvimento de substratos de cultura de células com a capacidade de alterar a topografia durante a cultura é descrito. O método faz uso de materiais inteligentes conhecidos como polímeros com memória de forma que têm a capacidade de memorizar uma forma permanente. Este conceito é adaptável a uma vasta gama de materiais e aplicações.

Forma Polímeros Memória da Cultura célula ativa

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K visualizações.  Syracuse Biomaterials Institute. Um método para o desenvolvimento de substratos de cultura de células com a capacidade de alterar a topografia durante a cultura é descrito. O método faz uso de materiais inteligentes conhecidos como polímeros com memória de forma que têm a capacidade de memorizar uma forma permanente. Este conceito é adaptável a uma vasta gama de materiais e aplicações.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Bioengenharia

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabricação microfluida de fibras poliméricas e biohibridas com tamanho e forma predesigned

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

A cultura in vitro modelo celular para Toxic Chemical Testing Inhaled

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect &#8220;self-fitting.&#8221; In this way, following exposure to warm saline (~60 &#186;C), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 &#186;C) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Fabrication of a Bioactive, PCL-based &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Scaffold

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Fabricação de uma baseada em PCL Bioativos, &quot;Self-fitting&quot; Memória de Forma Polymer Andaime

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...