Gli autori desiderano ringraziare Kelly A. Burke per l&#39;assistenza tecnica con la preparazione dei supporti ACC. Sulla base l&#39;articolo pubblicato in Biomateriali, Davis KA et al, il comportamento dinamico delle cellule a memoria di forma su substrati polimerici, biomateriali, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Questo materiale si basa su lavoro supportato da NSF sotto Grant No. DMR-0907578.

1. Isotermico UV di NOA63 <ol><li> Una camera di cura personalizzati è stato sviluppato utilizzando una lastra di vetro (75 mm x 25 mm x 1 mm), un 1 distanziatore mm di spessore in teflon, e di una piastra di alluminio (75 mm x 25 mm x 3 mm), come mostrato nella Figura 1. La camera è tenuto insieme con clip legante di piccole dimensioni. </li><li> Iniettare il NOA63 nella camera attraverso un buco nel distanziatore in teflon con un 18 gauge. Il NOA63 può essere riscaldata leggermente per facilitare l&#39;iniezione. </li><li> Posizionare la camera su una piastra riscaldante fissato a 125 ° C e permettono di riscaldare ad una temperatura uniforme per 5 min. </li><li> Pre-curare la NOA63 in una camera lampada UV (λ max = 365 nm, vedi tabella) per 20 minuti con la lampada 6,5 centimetri dalla superficie del vetro. </li><li> Rimuovere il NOA63 dalla camera a caldo con una lama di rasoio. </li><li> Post-cura la NOA63 sotto la luce UV per 3 h 40 m sulla piastra riscaldante a 125 ° C. </li><li> Conservare il NOA63 essiccato a -20 ° C. </li></ol> 2. Caratterizzazione forma di memoria di NOA63 <ol><li> Preparare un campione manubrio da caldo la pressione di un curato NOA63 film con un pugno personalizzato (vedi tabella), le cui dimensioni sono riportate nella Figura 2. </li><li> Caricare il campione in un analizzatore dinamico meccanico (DMA, vedi tabella) con il dispositivo di trazione. Impostare lo strumento per &quot;forza controllata&quot; modalità, quindi programmare la procedura di test come segue: <ol><li> Equilibrare a 95,00 ° C </li><li> Isotermici per 10,00 min </li><li> Rampa di forza di 0,300 N / min a 2.500 N </li><li> Isotermici per 5,00 min </li><li> Rampa di 2,00 ° C / min a 20,00 ° C </li><li> Isotermici per 10,00 min </li><li> Rampa di forza di 0,300 N / min a 0.015 N </li><li> Isotermici per 5,00 min </li><li> Rampa di 2,00 ° C / min a 95,00 ° C </li><li> Ripetere i passaggi 2-9 altre due volte </li></ol></li></ol> 3. Preparazione dei supporti attivi coltura cellulare <ol><li> I singoli campioni possono essere preparati dal film curata isotermicamente SMP. Tagliare la pellicola SMP con un rasoio per dimensione del campione desiderato. Posizionare il SMP su un piatto caldo ad una temperatura superiore a quella g T per ridurre il modulo e la facilità di taglio. </li><li> La forma temporanea può essere fissato in un certo numero di modi diversi. Qui usiamo un top pressa idraulica da banco con riscaldamento / raffreddamento a piastre in rilievo una topografia temporanea. Impostare la temperatura della piastre ad una temperatura al di sopra della T g. </li><li> Un goffratore è stata fatta da epossidico su un disco in vinile. Questo produrrà una forma temporanea di scanalature parallele. Qui, il goffratore avuto picchi triangolare 35-40 micron e 60 micron di alta gamma, distanziati 80 micron di distanza. Il goffratore può essere fatto da altri materiali e con diverse topografie, ma deve essere più rigido NOA63 alla temperatura goffratura. Posizionare i campioni SMP faccia in giù sul goffratore e posto i campioni e goffratore sulla stampa. </li><li> Applicare un precarico ~ 100 kPa di stabilire un contatto tra le piastre di riscaldamento e dei campioni e tenere premuto per ~ 5 minuti per permettere i campioni di raggiungere una temperatura uniforme. </li><li> Applicare 1-6 MPa ai campioni e tenere premuto per 1 minuto. Una tensione di 4,7 MPa porta alla replicazione incompleta della topografia goffratore. La topografia temporanea prodotta ha picchi arrotondati 25-35 micron di altezza e 150 micron di larghezza. La SMP si frattura se uno stress maggiore viene applicata. Applicare piccole sollecitazioni di introdurre topografie con piccole ampiezze. </li><li> Ridurre la temperatura al di sotto del g T. Qui usiamo la capacità di raffreddamento ad acqua della piastre stampa. </li><li> Quando la temperatura è inferiore al g T, rimuovere la forza applicata. </li><li> I campioni possono essere conservati essiccati a -20 ° C. Se conservato in queste condizioni, abbiamo osservato una diminuzione meno di 1 micron di ampiezza di recupero dopo due mesi per i campioni in rilievo con la goffratore disco in vinile. </li></ol> 4. Attivo cella Esperimento Cultura <ol><li> La luce UV di una cappa di sicurezza biologica (BSC) è usato per sterilizzare i campioni. Disporre i campioni a faccia in giù in piatti sterile senza coperchi e accendere la luce UV BSC per 6 h. </li><li> Campioni flip per nuovi piatti sterile a faccia in su. Accendere la luce UV BSC per 6 h. </li><li> I campioni ora devono essere equilibrati a uno stato relativamente stabile prima di placcatura con le cellule. Mettere i campioni in una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 150 ml di mezzo di crescita completa. </li><li> Mettete la placca in un incubatore a 30 ° C con 5% di CO 2 fino a raggiungere la desiderata ripresa parziale. Qui usiamo 30 h per la produzione di campioni con grande ampiezza sufficiente per allineare le cellule. </li><li> I campioni possono essere placcati con le cellule. Mettere i campioni in una nuova piastra da 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 150 ml di soluzione delle cellule ai campioni. Qui usiamo C3H/10T1/2 fibroblasti embrionali di topo a 20.000 cellule / ml per ottenere cellule isolate (in genere non in contatto con altre cellule). </li><li> Per consentire alle cellule di fissare e diffondere sulla topografia temporaneo, posto in un incubatore a 30 ° C per 9,5 h. </li><li> Per morfologia saggio cellularegia prima di transizione, rimuovere campioni e procedere alla colorazione e di imaging di fluorescenza dei campioni. Questo materiale presenta autofluorescenza attraverso la maggior parte della gamma UV e visibile. Fluorofori in fondo rossa dello spettro, come Alexa Fluor 647 sono raccomandati per ridurre il fondo. </li><li> Per attivare i campioni di recuperare, spostare la piastra a 37 ° C in incubatore e continuare la cultura per 19 h per permettere il materiale da recuperare e permettono alle cellule di adattare la loro morfologia alla nuova topografia. </li><li> Rimuovere i campioni e applicare appropriati macchia (falloidina per filamentosa actina imaging) e le procedure di imaging. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Curato NOA63 è un sistema trasparente, solido vetroso che ha eccellenti proprietà di memoria di forma come mostrato nella Figura 3. In questo caso il materiale è stato curato come nel protocollo n. 1 e mostra una uniforme T g di 51,1 ° C (determinato dalla comparsa di caduta E &#39;). Si osserva da quella forma di cicli modo memoria (riscaldamento, deformare, raffreddamento, recupero, figura 3) che, una grande percentuale di ceppo è stato fissato dopo lo scarico a 20 ° C, corrispondenti a un rapporto di fissaggio 15 (R f) di 89,3 % (media su tre cicli: il sottostante stesso per R r). Il ceppo fisso recuperato con un rapporto di recupero (R r) del 84,4% in un range di temperatura relativamente piccola durante il riscaldamento. Inoltre, le prestazioni a memoria di forma non ha mostrato alcun peggioramento sino a tre cicli, nel senso che tutte le curve seguono quasi esattamente con l&#39;altro. NOA63 è stato utilizzato in questo protocollo in quanto è facilmente reperibile dal produttore e fornito come facilmente curata senza solventi prepolimero con fotoiniziatore. Tuttavia, la sua composizione non è indicato dal fornitore. E &#39;stato trovato per consentire l&#39;attaccamento e la vitalità delle cellule alte. Infine, la temperatura di transizione potrebbe essere sintonizzato per consentire una grandezza significativa di recupero tra due temperature cellulari compatibili. Un certo numero di altri sistemi polimerici potrebbe essere utilizzato anche con questo protocollo se la temperatura di transizione è compatibile con le colture cellulari e se promuovono l&#39;adesione cellulare e la vitalità. L&#39;ampiezza della topografia temporanea (scanalature) diminuisce nel tempo a 30 ° C. Da 30 ore a 30 ° C, l&#39;ampiezza è stata ridotta di circa il 50% (Figura 4, tempo 0) 16. Riduce un altro 10% nei prossimi 9,5 h. Quando la ripresa viene attivato aumentando la temperatura a 37 ° C, l&#39;ampiezza si riduce a 0,5% dell&#39;ampiezza iniziale entro 9,5 h. Per la goffratore utilizzati e uno stress goffratura di 4,9 MPa, ciò corrisponde a un cambiamento funzionale di 13 micron scanalature ad una superficie quasi piana. Un esempio di comportamento cellulare controllato attraverso l&#39;utilizzo di substrati attivi coltura cellulare è un cambiamento nella organizzazione del citoscheletro. Su supporti temporanei scanalato prima del recupero è attivato, i microfilamenti di actina allinearsi lungo la direzione delle scanalature (Figura 5a) 16. Dopo il recupero di aumento della temperatura, i microfilamenti sono riorganizzati e sono orientate in modo casuale. I campioni di controllo che hanno scanalature statica o di una superficie piana statico non riorganizzarsi dopo l&#39;aumento di temperatura (Figura 5b, c). <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: Schema per NOA63 camera di stagionatura. Sezione trasversale (a sinistra) e vista dall&#39;alto senza coperchio in vetro (a destra). <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2: La geometria manubri utilizzati per la caratterizzazione di massa a memoria di forma W:. Larghezza della sezione ristretta, L: lunghezza della sezione ristretta, G: lunghezza gage, WO: larghezza complessiva, LO: lunghezza fuori tutto, D: distanza tra le impugnature, R: raggio di raccordo e RO: raggio esterno. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3: Il senso unico memoria di massa la forma di un singolo NOA63 cura, ripetuta 3 volte (l&#39;asterisco indica insorgenza sperimentale). Al punto indicato con un asterisco, il polimero è stato riscaldato e poi viene deformato mediante l&#39;applicazione di uno sforzo per definire la sua forma temporanea. Questo ceppo è mantenuta costante, e la temperatura è scesa a fissare la forma temporanea di sotto della T g del polimero. La temperatura viene poi aumentata, e il materiale recupera la sua forma permanente come la deformazione temporanea è ridotta. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4: recupero SMP può essere attivato in coltura cellulare compatibile temperature. L&#39;ampiezza di 25,6 ± 0,8 micron presenti i seguenti rec goffraturaovered a 12,6 ± 1,5 micron dopo 30 equilibratura ore a 30 ° C (tempo 0, cerchi neri). Dopo che i campioni sono stati spostati in un incubatore a 37 ° C (9,5 h), l&#39;ampiezza recuperato a 1,1 ± 0,2 micron entro 3,5 h. L&#39;ampiezza recuperato a ~ 0,3 ± 0,1 micron entro 9,5 ore e non diminuire rilevabile nelle ultime 9,5 h è stato osservato (triangoli rossi). Le barre di errore rappresentano una deviazione standard (n = 4-6). Le tracce sono scansioni contatto profilometria di campioni rappresentativi. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5: actina del citoscheletro cellulare riorganizza dopo uno transizione topografiche, le immagini confocale di cellule colorate con falloidina su supporti in rilievo mostrano microfilamenti allineata con la direzione scanalatura (freccia bianca) prima di transizione e di aumento della temperatura.. Dopo la transizione, microfilamenti sono riorganizzate sono orientate in modo casuale. B, cellule su substrati di controllo piatto mostrare microfilamenti orientati a caso, prima e dopo l&#39;aumento della temperatura. C, cellule su substrati di controllo scanalati spettacolo microfilamenti allineata con la direzione solco prima e dopo l&#39;aumento della temperatura. Barra di scala è di 100 micron. Le tracce sono come in Figura 4.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

G T di NOA63 può essere facilmente controllato tramite la temperatura di polimerizzazione. Abbiamo usato questo per generare supporti SMP che può essere attivato in un intervallo di celle compatibile. NOA63 è plastificato con l&#39;acqua che abbassa il secco T g, così abbiamo aumentato il secco T g da una cottura a 125 ° C per spostare il campo bagnato Tg tra i 30 ei 37 ° C. L&#39;attivo substrati di coltura cellulare hanno dimostrato in grado di contro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o strumento </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> NOA63 </td><td> Norland Products Inc. </td><td> NOA63 </td><td> Lotto numero 111 </td></tr><tr><td> Dogbone Punch </td><td> TestResource, Inc. Shakopee, MN </td><td></td><td> Ridotta Tipo IV Dogbone (ASTM D638-03) </td></tr><tr><td> Pressa da banco </td><td> Intagliatore </td><td> 3851 </td><td></td></tr><tr><td> C3H10T1 / 2 Mouse fibroblasti embrionali </td><td> ATCC </td><td> CCL-226 </td><td></td></tr><tr><td> Cappa di sicurezza biologica </td><td> Thermo Fisher </td><td> 1357 </td><td></td></tr><tr><td> Lampada UV </td><td> Spectroline </td><td> SB-100PC </td><td></td></tr><tr><td> Analizzatore dinamico meccanico (DMA) </td><td> TA Instruments, Inc. </td><td> Q800 </td><td></td></tr><tr><td> Invertito microscopio a fluorescenza </td><td> Leica </td><td> Leica DMI 4000B </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale a scansione laser </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> 20x/0.8 NA aria o un olio 40x/1.30 NA obiettivo </td></tr></tbody></table>

shape memory polymers for active cell culture

Polimeri a memoria di forma (SMP) sono una classe di materiali &quot;intelligenti&quot; che hanno la capacità di passare da un fisso, la forma temporanea di un pre-determinata forma permanente dopo l&#39;applicazione di uno stimolo come il calore 1-5. In un tipico ciclo di memoria di forma, la SMP è prima deformato a temperatura elevata che è superiore alla temperatura di transizione, T trans [sia la temperatura di fusione (T m) o la temperatura di transizione vetrosa (Tg)]. La deformazione è elastica in natura e porta principalmente ad una riduzione di entropia conformazionale delle catene rete costituente (seguendo la teoria di elasticità della gomma). La deformata SMP è poi raffreddato ad una temperatura inferiore al T trans, mantenendo la tensione esterno o costante stress. Durante il raffreddamento, le transizioni materiale ad uno stato più rigido (semi-cristallina o vetrosa), che cineticamente trappole o &quot;congela&quot; il materiale in questo stato di bassa entropia che porta a fissare la forma macroscopica. Recupero della forma è innescata da continuamente il riscaldamento del materiale attraverso T trans sotto uno stress-free (senza vincoli) condizione. Permettendo che le catene di rete (con mobilità riacquistato) per rilassarsi alla loro termodinamicamente favorito, massima entropia dello stato, i cambiamenti materiale dalla forma temporanea alla forma permanente. Le cellule sono in grado di rilevare le proprietà meccaniche del loro ambiente circostante 6. I meccanismi attraverso i quali interazioni meccaniche tra le cellule e il loro ambiente fisico controllare il comportamento delle cellule sono aree di ricerca attiva. Substrati di topografia definite sono emersi come potenti strumenti nelle indagini di questi meccanismi. Mesoscala, microscala, e modelli su scala nanometrica della topografia del substrato è stato dimostrato per dirigere l&#39;allineamento delle cellule, adesione cellulare, e le forze di trazione delle cellule 7-14. Questi risultati hanno sottolineato il potenziale per topografia del substrato per il controllo e il dosaggio delle interazioni meccaniche tra le cellule e il loro ambiente fisico durante colture cellulari, ma i substrati utilizzati fino ad oggi sono state in genere passivo e non potrebbe essere programmato per cambiare in modo significativo durante cultura. Questa stasi fisica ha limitato le potenzialità di supporti topografici per il controllo delle cellule in coltura. Qui, coltura cellulare attivo (ACC) sono introdotti substrati SMP che impiegano a memoria di forma della superficie per fornire un controllo programmato della topografia del substrato e deformazioni. Questi substrati dimostrare la capacità di passare da una topografia temporanea scanalata per un secondo, topografia quasi piatta memorizzato. Questo cambiamento di topografia può essere utilizzato per controllare il comportamento delle cellule in condizioni standard di coltura cellulare.

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Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Un metodo per lo sviluppo di substrati di coltura cellulare con la possibilità di cambiare topografia durante cultura è descritto. Il metodo si avvale di materiali intelligenti conosciute come i polimeri a memoria di forma che hanno la capacità di memorizzare una forma permanente. Questo concetto è adattabile ad una vasta gamma di materiali e applicazioni.

Shape Memory Polymers per la Cultura cella attiva

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K Views.  Syracuse Biomaterials Institute. Un metodo per lo sviluppo di substrati di coltura cellulare con la possibilità di cambiare topografia durante cultura è descritto. Il metodo si avvale di materiali intelligenti conosciute come i polimeri a memoria di forma che hanno la capacità di memorizzare una forma permanente. Questo concetto è adattabile ad una vasta gamma di materiali e applicazioni.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Ricerca

Bioingegneria

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotazione Cultura sistemi cellulari per colture cellulari umane: cellule del trofoblasto umano come modello

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In vitro delle cellule Cultura modello per Tossico per inalazione Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect &#8220;self-fitting.&#8221; In this way, following exposure to warm saline (~60 &#186;C), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 &#186;C) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Fabrication of a Bioactive, PCL-based &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Scaffold

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Realizzazione di una sede a PCL Bioactive, &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Ponteggio

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...