Die Autoren danken Voltaire Gungab für die Unterstützung bei Manuskripts. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus unterstützt: die National Institutes of Health (T32 GM008440 zu EJ Walker, R01 NS27713 zu WL Young, P01 NS44155 zu WL Jung und H. Su) und R21 NS070153 H. Su, und die amerikanische Heart Association (AHA 10GRNT3130004 H. Su).

1. Clearing Blut aus Gefäßsystem <ol><li> Anesthetize Maus durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg Ketamin mit 10 mg / kg Xylazin in 0,25 ml Kochsalzlösung verdünnt. </li><li> Nach Betäubung durch keine Reaktion auf eine Pfote Prise bestätigt worden, mit einer Schere einen Schnitt quer über die Brust zu machen mit einer Schere knapp unter dem Schwertfortsatz, durch die Membran geschnitten, und zerschnitten zwischen dorsalen und ventralen Segment der Brustkorb zu Brusthöhle aussetzen. Expose Herzen durch Hochklappen Brustbeins und der angrenzenden Brustwand und sicher mit hemostat. Öffnen Sie den Herzbeutel mit einer Pinzette in das Herz freizulegen. </li><li> Schalten Sie Perfusionspumpe (100 mmHg Druck), verbunden mit PBS plus Heparin (5 Einheiten / ml)-Lösung in heißen Wasserbad bei 37 ° C und Schläuche mit einem stumpfen 22-Gauge-Nadel auf den Abfluss. Warmer </li><li> Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer, in der Nähe der Herzspitze. Unmittelbar schnitt den rechten Vorhof zur systemischen Blut Abfluss zu ermöglichen und spülen, bis das Blut is aus dem Verkehr gezogen. </li></ol> 2. Perfusion von Casting-Agenten in das Gefäßsystem <ol><li> Bereiten Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) Gießlösung pro Protokoll des Herstellers: Mix 5 ml MV Verdünnungsmittel mit 4 ml des gefilterten MV-Verbindung. Fügen Sie 450μl (5%) des Katalysators (MV Härter). Lösung Arbeitszeit beträgt 20 Minuten, sondern mischen unmittelbar vor der Anwendung die richtige Viskosität gewährleisten. </li><li> Ziehen Casting-Agent-Lösung in eine 10ml Spritze, legen einen stumpfen 20-Gauge-Nadel auf die Spritze und füllen Nadel mit Lösung. </li><li> Setzen Sie die Nadel in die linke Herzkammer durch das gleiche Loch für die Spülung des Blutes eingesetzt. Sichere Nadel in Stelle mit hemostat Klemme am Herzen. </li><li> Inject Casting-Agent-Lösung langsam in den linken Ventrikel bei ca. 3 ml / min. Überdruck kann zu falschen Fluss der Casting-Agenten oder potentielle Schiff Bruch führen. </li><li> Achten Sie auf Anzeichen für eine erfolgreiche Perfusion, darunter: Visualisierung von castIng.-Agent in Darm und Leber Gefäßsystem, distalen Gliedmaßen Verfärbung und Nase und Zunge verfärbt. Nachstellen Nadel ggf. richtige Durchblutung zu erreichen. </li></ol> 3. Erhebung und Verarbeitung von Tissue <ol><li> Entfernen Gehirn und in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entwässern des Gehirns, indem sie aus Paraformaldehyd direkt in zunehmendem Maße konzentriert EtOH bei Raumtemperatur: 25% EtOH, 1 Tag, 50% EtOH, 1 Tag, 75% EtOH, 1 Tag, 95% EtOH, 2 Tage, und 100% EtOH, 2 Tage . </li><li> Klären Hirngewebe um die Blutgefäße durch Eintauchen der perfundierten Gehirn in Methylsalicylat für 2 Tage bei Raumtemperatur. </li><li> Gefäßsystem des gesamten ungeschnittenen geklärt Gehirn mit Gehirn in Methylsalicylat unter einem Binokular (Abb. 1) (Leica MZFL III Mikroskop Leica Microsystems, Bannockburn, IL) oder Hellfeld-Mikroskop (Abb. 2) (Leica DM / eingetaucht abgebildet werden LS, Leica Microsystems). </li><li> Reclarificationkann getan werden, wenn Gewebe ist nicht vollständig geklärt werden. Von Methylsalicylat, Transfer Gehirn zu 95% EtOH für 2 Tage, 100% EtOH für 2 Tage, und Methylsalicylat für 2 Tage. </li></ol> 4. Micro-CT-Bildgebung oder histologische Application-Tissue Vorbereitung <ol><li> Das Gehirn kann abgebildet mit Mikro-CT unmittelbar nach Klärung oder nach Rehydrierung (Abb. 4). </li><li> Zur Vorbereitung Hirngewebe für die histologische Analyse, rehydrieren das Gehirn durch serielle Verdünnung EtOH: 100% EtOH, 1 Tag, 95% EtOH, 1 Tag, 75% EtOH, 1 Tag, 50% EtOH, 2 Tage, 25% EtOH, 2 Tage , und speichern in PBS. Das Gehirn kann dann in Paraffin mit einem Standard-Verfahren eingebettet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Nach Kreislauf-Casting, können die cerebrovasculature makroskopisch an der Hirnoberfläche (Abb. 1a) zu sehen. Die Gefäßbaumes im Parenchym visualisiert folgende Klarstellung werden (Abb. 1B). Die detaillierten Gefäßstrukturkönnen abgebildet und analysiert werden unter einem Mikroskop Hellfeld (Abb. 2), Binokular (Abb. 3), und mit Mikro-CT-Scan (Abb. 4). Mit Hellfeldmikroskopie, können die Gefäße in verschiedenen Fokusebenen ohne Schneiden des Gehirns (Abb. 2A) sowie individuelle Mikrogefäßen bei höherer Vergrößerung (Abb. 2B) eingesehen werden. Unter einem Binokular, kann man das gesamte vaskuläre Struktur in einer Brennebene zu sehen, die eine bessere Visualisierung der dreidimensionalen Struktur des cerebrovasculature (Abb. 3). Bilder unter einem Binokular genommen werden zeigen großes Schiff Morphologie und ganze Gehirn Gefäßsystem, aber nicht über die Details in Bildern mit Hellfeld-Mikroskopie (Abb. 2B) übernommen gezeigt. Diese Technik hat uns erlaubt, unregelmäßige Schiffe in unserer experimentellen BAVM erwachsenen Maus-Modell 2 zu erfassen. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel aus dem gleichen unregelmäßige Gefäße durch Mikro-CT-Scan (Abb. 5A) und Hellfeld (Abb. 5B) erkannt. Gemeinsam, zeigt diese Daten, können wir t analysierener dieselbe Probe mit mehreren bildgebenden Verfahren nach vaskulären Gießen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig1.jpg" /> Abbildung 1. Whole Gehirn der Maus nach einer Gefäßverletzung Gießen. Vor (A) und nach (B) Klärung durch Methylsalicylat Lösungsmittel. Schiffe werden übersichtlich visualisiert auf der Hirnoberfläche (A) und in Parenchym folgende Klarstellung Verfahren (B). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig2.jpg" /> Abbildung 2. Hellfeld-Mikroskop Bilder von geklärt vaskulären gegossen Gehirn. Gehirn kann auf verschiedenen Ebenen und in verschiedenen Vergrößerungen abgebildet werden. Maßstabsbalken 200 um (A) und 50 um (B). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig3.jpg" /> Abbildung 3. Präpariermikroskop Bild mit 1x zeigen gesamten erwachsenen Gehirn der Maus cerebrovasculature aus einer Dorsalansicht. &lt;img alt = &quot;Bild 4&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg&quot; /&gt; Abbildung 4. Micro-CT-Scan-Bild der gleichen gesamten erwachsenen Gehirn der Maus in Abbildung 3 aus einer dorsalen Ansicht dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig5.jpg" /> Abbildung 5. Einsatz von vaskulären Gießverfahren ein Gehirn arteriovenöse Missbildung zu erkennen. A) Micro-CT-Scan der vaskulären gegossen Gehirn zeigt Region vergrößert, unregelmäßig AVM-wie Schiffe in der rechten Hemisphäre von einer Ventralansicht. Größeres Bild der Region (white box) ist auf der rechten Seite angezeigt. B) Gleiche unregelmäßige Gefäße sichtbar unter Hellfeld-Mikroskop bei 50facher Vergrößerung. Maßstabsleiste 50 um.

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Experimentelle Verfahren für den Einsatz im Labor Tiere wurden durch das Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of California, San Francisco (UCSF) zugelassen.

Wir berichten hier ein Verfahren zum Gießen von erwachsenen Maus cerebrovasculature, die mit verschiedenen Modalitäten abgebildet werden können. Die Anwendung dieser Methode, um die Krankheit Modell BAVM ermöglicht 3D-Analyse von unregelmäßigen Gefäßen. Mögliche zukünftige Studien umfassen die Quantifizierung der Mikro-CT-Aufnahmen, histologische Analyse der Gewebe und Diagnose von Gefäßerkrankungen Progression. Häufigsten auftretenden Probleme und Anregungen Komplette Durchblutung des Gehirns Gefäßsystem ist nicht immer erreicht. Nachdem genügend Druck auf die distalen Blutgefäße, ohne aufzureißen den linken Vorhof oder Aorta zu erreichen ist eine Herausforderung. Um dies zu überwinden, um für einheitliche Druck von ungefähr 100 mmHg. Stellen Sie auch Nadelposition geeignete Abfluss von Casting-Agenten in die Aorta zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass die Halsschlagadern sind nicht beschränkt, so dass die Casting-Agenten der Hirngefäße erreichen können. Kritische Verfahren, die mit verbesserter kleinen Schiff und korrelierenFusion sind: (1) ordnungsgemäße Abwicklung von Blut aus dem Gefäßsystem, (2) Filtration der Casting-Agent, und (3) Nadel Platzierung bei Casting-Agenten Injektion. Es ist darauf zu Injektion von Casting-Agenten in den linken Vorhof und der Lunge zu vermeiden. Andere Forscher haben erfolgreich Maus 3 und 4 Ratten cerebrovasculature ohne den Einsatz zusätzlicher Verfahren perfundiert. Manuelle Analyse Microfil perfundierten Gefäße gegengefärbt mit Hämatoxilin zeigten 93% Gefäßlumen Perfusion 5. Immer verwerfen oder völlig sauber jedes Werkzeug, das in Kontakt mit dem Casting-Agenten kommt es schnell wird polymerisieren und Werkzeuge können nicht für mehrere Personen verwendet werden. Die Klärung der umgebenden Gehirngewebe der Maus kann eine Herausforderung sein. Nach dem Eintauchen in Methylsalicylat, kann das Gewebe noch undurchsichtig erscheinen, so dass Schiff Bildgebung schwierig. Sicherstellung der ordnungsgemäßen Entwässerung und Klarstellung sollte dieses Problem lösen. Platzieren Hirngewebe auf einer Wippe in Alkohol und Methyl-salicylate Behandlung verbessern kann Gewebe Klärung. Nachteile dieser Technik Die Grenzen dieser Technik sind: (1) ist es notwendig, die Casting-Agent-Lösung unmittelbar nach dem Mischen, wie es schnell wird dicker, nachdem der Katalysator zugegeben injizieren, (2) die Casting-Agenten füllt große Leitfähigkeit Schiffe leicht, aber es funktioniert nicht zuverlässig füllen kleinere Schiffe, wie Arteriolen (Widerstandsgefäße) und Kapillaren (nutritive Gefäße) und (3) es ist nicht die beste Röntgenkontrastmittel für die Mikro-CT-Bildgebung, obwohl einige Gruppen Microfil lieber für die Mikro-CT-Bildgebung 1,6. Im Anschluss an die Vorschläge oben vorgeschlagen, darunter richtige Nadel Platzierung, Position des Schiffs und Perfusionsdruck, Ergänzen Gießen von kleineren Schiffen erreicht werden. Die Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Analyse-Tools macht dieses Anbieters zu einem wertvollen Werkzeug für die Analyse von zerebrovaskulären Struktur, einschließlich arteriellen und venösen Kreislauf, mit verschiedenenPerspektiven. Anwendungen dieser Technik Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner breiten Anwendungspotenzial. Die Besetzung füllt alle Schiffe, einschließlich Arterien, Venen und Kapillaren aller Gewebe im Körper, so vaskulären Strukturen in mehreren Organen verschiedener Spezies analysiert werden kann. Zuvor haben andere Gruppen dieser Perfusion für große 7 und kleine 8 Schiffe in Mensch, Affe 9, Schafe 10, Ratte 4,11,12 und Maus 3,13 verwendet. Wir zeigen nun, Beweise für die Verwendung dieser Technik in die Analyse der Struktur von Mikrogefäßen im Gehirn der Maus, sowohl in gesunden und kranken Zustand 2. Darüber hinaus gibt es Microfil Lösungen mit verschiedenen Viskositäten erhältlich, um Schiffe in verschiedenen Größen und verschiedenen Farben perfuse, um die Visualisierung der Gefäße in verschiedenen Organen zu verbessern. Zum Beispiel kann rot werden einfach visualisiert in den blassen Hirnparenchym und Gelb kontrastiert gut mitdunkelrote Myokard. Außerdem ist, wie das Material radiopaque, können Gefäße mit Mikro-CT-Scannen zu einem 3D-Bild zu erhalten drehbare abgebildet werden. Das Gewebe kann auch für Paraffinschnitte und histologische Analyse, nachdem er abgebildet werden. Abschluss Wir zeigen hier ein Protokoll zu einem Gefäßpräparat der Blutgefäße der erwachsenen Gehirn der Maus, die angepasst mit einer Vielzahl von Analyse-Techniken, um die morphologische Struktur der cerebrovasculature Studie kann zu machen. Wir haben auch Beweise für die Anwendung dieser Methode auf ein Modell der BAVM Krankheitszustand vorgesehen, vertreten durch vergrößert, unregelmäßig geformte Gefäße, Shunt-Blut von arteriellen und venösen Kreisläufe. Es gibt eine Vielzahl von vaskulären Gießverfahren zur Verfügung. Das einfache Protokoll bieten wir hier für eine Gefäßpräparat kann als Werkzeug genutzt werden, um das Gefäßsystem des erwachsenen Gehirn der Maus mit verschiedenen bildgebenden Verfahren zu untersuchen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Hinweise </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> Flowtech, Inc. </td><td> MV130 </td><td> 4 Monate haltbar </td></tr><tr><td> Methylsalicylat </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3695-500 </td><td> um Gewebe zu klären </td></tr></tbody></table>

cerebrovascular casting of the adult mouse for 3d imaging and morphological analysis

Vascular Imaging ist von entscheidender Bedeutung in der klinischen Diagnose und Behandlung von zerebrovaskuläre Erkrankungen, wie z. B. Gehirn arteriovenöse Malformationen (BAVMs). Tiermodelle sind notwendig für das Studium der Krankheitsverlauf und mögliche Therapien für zerebrovaskuläre Erkrankungen. Imaging das Gefäßsystem in großen Tiere ist relativ einfach. Allerdings ist die Entwicklung Schiff bildgebenden Verfahren der murine Gehirnerkrankung Modelle wünschenswert, aufgrund der Kosten und der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mauslinien. Imaging der Maus zerebrale vaskuläre Baum ist eine Herausforderung. Bei Menschen und größere Tiere, der Goldstandard für die Beurteilung der Angioarchitektur am makrovaskuläre (Leitwert) Ebene ist x-ray Katheter Kontrastmittel-basierte Angiographie, eine Methode nicht für kleine Nager geeignet. In diesem Artikel präsentieren wir eine Methode für zerebrovaskuläre Casting, dass eine dauerhafte Skelett des gesamten Gefäßbett produziert, einschließlich Arterien, Venen und Kapillaren, die analysiert werden kann mit vielen dUNTERSCHIEDLICHE Modalitäten. Komplette Besetzung der Mikrogefäßen der Maus cerebrovasculature kann schwierig sein, aber diese Herausforderungen sind in diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll ansprechbar. Durch intrakardiale Perfusion des Gefäßsystems Gießmasse, sind alle Gefäße des Körpers gegossen. Das Gehirn kann dann entfernt und geklärt werden mit dem organischen Lösungsmittel Methylsalicylat. Dreidimensionale Bildgebung des Gehirns Blutgefäße können einfach und kostengünstig visualisiert werden mit jedem herkömmlichen Hellfeld-Mikroskop oder Binokular. Die gegossenen cerebrovasculature können auch abgebildet und quantifiziert werden mit Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) 1. Darüber hinaus, nachdem er abgebildet, kann das Gehirn in Paraffin gegossen für die histologische Analyse eingebettet werden. Der Vorteil dieser vaskulären Gießverfahren als mit anderen Techniken verglichen wird seine breite Anpassung an verschiedene Analyse-Tools, einschließlich Hellfeld mikroskopische Analyse-, Scan-CT aufgrund der röntgendichten Zeichenteristic des Materials, sowie histologische und immunhistochemische Analyse. Diese effiziente Nutzung von Gewebe zu speichern Tier-Nutzung und die Kosten zu senken. Wir haben vor kurzem Anwendung dieser Methode auf die unregelmäßigen Blutgefäße in einem Mausmodell der erwachsenen BAVM auf einer mikroskopischen Ebene 2 sichtbar zu machen, und liefern zusätzliche Bilder des fehlerhaften Schiffe, die von Mikro-CT-Scan abgebildet demonstriert. Obwohl diese Methode hat Nachteile und ist möglicherweise nicht ideal für alle Arten von Analysen, ist es eine einfache, praktische Technik, die leicht erlernt werden können und weit zu vaskulären Gießen von Blutgefäßen im ganzen Körper aufgetragen.

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Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache, praktische Technik für zerebrovaskuläre Casting, das einfach durchzuführen ist und kann zur Abbildung des Gefäßbaumes der erwachsenen Gehirn der Maus eingesetzt werden.

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

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Neuroscience

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Serie: Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

Stimulusspezifische cortical Visual Evokierte potenzielle morphologische Muster

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Fluorescence Angiography for Evaluation of Aneurysm Perfusion and Parent Artery Patency in Rat and Rabbit Aneurysm Models

Brain aneurysm treatment focuses on achieving complete occlusion, as well as preserving blood flow in the parent artery. Fluorescein sodium and indocyanine green are used to enable the observation of blood flow and vessel perfusion status, respectively. The aim of this study is to apply FVA to verify real-time blood flow, vessel perfusion status and occlusion of aneurysms after induction of sidewall aneurysms in rabbits and rats, as well as to validate the procedure in these species.
Twenty sidewall aneurysms were created in 10 rabbits by suturing a decellularized arterial vessel pouch on the carotid artery of a donor rabbit. In addition, 48 microsurgical sidewall aneurysms were created in 48 rats. During follow-up at one month after creation, the parent artery/aneurysm complex was dissected and FVA was performed using an intravenous fluorescein (10%, 1 mL) injection via an ear vein catheterization in rabbits and a femoral vein catherization in rats. Aneurysms were then harvested, and patency was evaluated macroscopically.
Macroscopically, 14 out of 16 aneurysms in rabbits indicated no residual parent artery perfusion with totally occluded luminae, however 11 (79%) were detected by FVA. Four aneurysms were excluded due to technical problems. In rats, residual aneurysm perfusion was macroscopically observed in 25 out of 48 cases. Of the 23 without macroscopic evidence of perfusion, FVA confirmed the incidence of 22 aneurysms (96%). There were no adverse events associated with FVA. Fluorescein is easily applicable and no special equipment is needed. It is a safe and extremely effective method for evaluating parent artery integrity and aneurysm patency/residual perfusion in an experimental setting with rabbits and rats. FVA using fluorescein as a contrast agent appears to be effective in controlling patency of aneurysms and the underlying vessel and can even be adapted to bypass surgery.

We present a protocol to efficiently evaluate aneurysm perfusion and vessel patency of sidewall aneurysm in rats and rabbits, using fluorescein-based fluorescence video angiography (FVA). With a positive predictive value of 92.6%, it is a simple but very effective and economical method with no special equipment required.

Fluoreszenz-Angiographie zur Bewertung von Aneurysmperfusion und Elternarterienpatenz in Ratten- und Kaninchen-Aneurysmus-Modellen

Brain aneurysm treatment focuses on achieving complete occlusion, as well as preserving blood flow in the parent artery. Fluorescein sodium and ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...