Dieses Protokoll gibt eine präzise, schrittweise Anleitung für das Gießen der pulmonalen arteriellen Vaskulatur sowohl bei erwachsenen als auch bei frühen postnatalen Mäusen. Diese Technik ermöglicht es Benutzern, das gesamte Gefäßnetzwerk vollständig für die Visualisierung durch eine Vielzahl von Methoden, einschließlich Mikro-CT, zu gießen und gleichzeitig die Integrität des Weichgewebes zu erhalten. Diese Technik ist besonders nützlich für die Betrachtung der pulmonalen vaskulären Morphologie und Architektur, kann aber leicht für das Targeting anderer Gefäßbetten angepasst werden.
Wie viele Operationen und Sezierungen gibt es keinen Ersatz für die Visualisierung eines Verfahrens, und die Zuschauer können davon profitieren, einige der anspruchsvolleren Manöver durchzuführen. Sobald der xiphoide Prozess freigelegt ist, greifen sie den Rippenkäfig vorsichtig und heben. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt in der jetzt exponierten, halbtransparenten Membran.
Die Lunge bricht sichtbar zusammen und zieht sich vom Zwerchfell zurück. Nach der Exposition der Lunge und Luftröhre, Faden 15 Zentimeter PE10 Schläuche auf die Nabe einer 30-Spur-Nadel. Und befestigen Sie dieses Gerät an einer Ein-Milliliter-Spritze, die 10 an den 4 Mol Natriumnitroprussid in PBS enthält.
Steigen Sie in den Kolben, um die Schläuche zu grundieren, bis die gesamte Luft gereinigt ist. Als effektive Alternative zum Text, durchdringen Sie die Spitze des Herzens auf der einen Seite, und passieren Sie die Spitzen der gekrümmten Zange durch den Muskel, und aus der anderen Seite des Gewebes. Greifen Sie ein Ende einer 10-Zentimeter-Länge von 7-0 Seide, und ziehen Sie etwa zwei Zentimeter durch das Gewebe.
Nachdem Sie die Naht abbanden, verwenden Sie die restlichen acht Zentimeter Naht, um das Herz kauarisch zu ziehen. Und klebe das Ende der Naht auf das Operationsbrett. Haken Sie die Spitzen der gekrümmten Zange sowohl unter der aufsteigenden Aorta und Lungenarterie Stamm.
Und ziehen Sie eine Drei-Zentimeter-Länge von 7-0 Seide zurück durch die Öffnung, um eine einzelne Wurf lose Naht zu schaffen. Verwenden Sie eine Schere, um einen Ein- bis zwei Millimeter Schnitt in Richtung der Spitze des Herzens zu machen, durchdringen sie die dünnwandige rechte Herzkammer. Und führen Sie den grundierten Schlauch in den rechten Ventrikel ein und leiten Sie den Katheter sanft in den halbtransparenten, dünnwandigen Lungenarterienstamm.
Stellen Sie visuell sicher, dass der Katheter weder in den linken noch in den rechten Lungenzweig vorgerückt ist und nicht an den Zweigpunkt der Lungenarterie anschließt. Kleben Sie den distalen Teil des Schlauches an das Operationsbrett, und ziehen Sie die lose Naht um die beiden großen Gefäße sanft fest. Schneiden Sie das acht Zentimeter große Stück Naht, um das Herz in eine natürliche Ruheposition zurückzuversetzen.
Und clip das linke Orakel des Herzens, damit der Perfusate die Vaskulatur verlassen kann. Verwenden Sie dann eine Spritzenpumpe, um das Natriumnitroprussid mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min zu gießen, um sowohl das Blut zu spülen, als auch die Vaskulatur maximal zu erweitern, bis das Perfusat klar verläuft. Um die Lungenaufblaseinheit zu konstruieren, schneiden Sie den flexiblen 24-Spur-Intravenus-Katheter aus einer Wanne und verbinden Sie sich mit der Nadel eines Schmetterlingsinfusionssets.
Befestigen Sie dieses Gerät am Hahn und befestigen Sie den Hahn an einer offenen 50-Milliliter-Spritze. Nach dem Beladen der Spritze mit Formalin und Grundierung des Katheters, mit dem Stopcock geschlossen, positionieren Sie die Spritze in einem Ringständer, bis zu dem Punkt, an dem der Meniskus 20 Zentimeter über der Luftröhre ist. Legen Sie zwei lose Nähte, zwei bis vier Millimeter voneinander entfernt, schlechter als der cricoid Knorpel, und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt in der Cricothyroid-Band zu machen, besser als die Nähte.
Setzen Sie den Katheter in die Öffnung ein und bringen Sie die Spitze über die beiden lockeren Nähte hinaus. Ziehen Sie die Nähte um die Luftröhre, und öffnen Sie den Stopphahn, damit das Formalin durch die Schwerkraft in die Lunge gelangen kann. Warten Sie fünf Minuten, bis sich die Lunge vollständig aufbläht.
Wenn die Lunge während der Inflation am Rippenkäfig haftet, verwenden Sie stumpfe Zangen, um die Außenseite des Rippenkäfigs zu erfassen, und bewegen Sie die Rippen in alle Richtungen, um bei der Befreiung der Lappen zu helfen, ohne direkten Kontakt mit der Lunge zu nehmen. Nach fünf Minuten, ziehen Sie den Katheter hinter der ersten Naht und Ligate. Dann ziehen Sie den Katheter hinter der zweiten Naht und Ligate.
Die Lunge sollte nun in einem geschlossenen, unter Druck stehenden Zustand aufgeblasen werden. Um die Vaskulatur zu gießen, laden Sie einen Milliliter einer 8-1-1 Lösung des Polymerverdünnungsmittels in eine Ein-Milliliter-Spritze. Und legen Sie den Kolben vorsichtig ein.
Wenn die Spritze invertiert ist, drücken Sie den Kolben, um die Luft zu entfernen, und um die Bildung eines Meniskus an der Spitze der Spritze zu ermöglichen. Entfernen Sie die Natrium-Nitroprussid-Spritze von der Nabe der Nadel und tropfen Sie die Zugabe PBS in die Nabe, um einen Meniskus zu erzeugen. Verbinden Sie die Polymer-Compound-Spritze mit der Nabe, und starten Sie die Infusion mit 0,02 Millimetern pro Minute.
Überwachen Sie die Verbindung, während sie sich frei durch den Schlauch bewegt, und notieren Sie das Spritzenvolumen, während es in den Rumpf der Lungenarterie eintritt. Setzen Sie die Fülle fort, bis alle Lappen vollständig gefüllt sind, bis zum kleinsten Gefäß. Stoppen Sie die Pumpe, und notieren Sie noch einmal das Spritzenvolumen.
Bedecken Sie die Lunge mit einem faseroptischen Reinigungstuch, und wenden Sie PBS freimütig an. Lassen Sie das Exemplar 30 bis 40 Minuten ungestört bei Raumtemperatur sitzen. Sobald die Polymerverbindung ausgehärtet und gehärtet ist, trennen Sie die Gliedmaßen und die untere Hälfte der Maus.
Und legen Sie den Kopf und Thorax in eine 50-Milliliter konisch gefüllt 10%gepuffert Formalin, über Nacht. Greifen Sie am nächsten Morgen die Luftröhre, um Herz und Lunge sanft vom verbleibenden Rippenkäfig und Thorax zu trennen. Legen Sie den geernteten Gewebeblock in eine formal gefüllte Szintillationsdurchstechflasche.
Eine erfolgreiche Besetzung führt zu einer gleichmäßigen Befüllung des gesamten Lungenarteriennetzes. Wenn die Lungen- oder Lungenwege beschädigt werden, verhindern kleine Lecks, dass die Lunge Druck hält. Eine patchy oder unvollständige Füllung kann durch eine Luftschleuse entstehen, da Luft über den Katheter in das Gefäßsystem eingebracht wird, wodurch der nachgeschaltete Fluss der Verbindung blockiert wird.
Unterfüllung tritt auf, wenn zu wenig Verbindung in die Vaskulatur eingeführt wird. Alternativ kann eine Überfüllung oder zu schnelle Einführung zu viel Polymerverbindung zu arteriellen Bruch oder, häufiger, venöser Transit führen. Das Vorrücken des Katheters zu weit nach unten den Lungenstamm kann dazu führen, dass sich die Spitze in einen Lungenarterienzweig verkeilt, wodurch ein Ungleichgewicht im Durchfluss entsteht und eine Seite schneller als die andere füllt.
Sorgfältige Leistung der Technik, wie gezeigt, mit der entsprechenden direkten Überwachung der distalen Vaskulatur Endpunkte, und Standard-Infusionsraten können zu einer optimalen Füllung der Lungenvaskulatur führen. Darüber hinaus kann die Anpassung dieser Technik an die systemische Vaskulatur in anderen Gefäßbetten gleichermaßen günstige Ergebnisse liefern. Nach dem Gießen können Proben für mikrocomputerische Tomographie-Scans verarbeitet werden.
Für die Nachbearbeitung kann ein kommerzielles Softwarepaket verwendet werden, um eine 3D-Volumenwiedergabe des Lungen-Gefäßbaums zu erzeugen. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, seien Sie besonders vorsichtig um die zerbrechliche Lunge und die Lungenarterie. Am wichtigsten ist, vermeiden Sie das Einbringen von Luft in den Gefäßkreislauf.
Nach einer erfolgreichen Besetzung kann eine Probe mit micro-CT gescannt werden, und Fragen der vaskulären Morphometrie und Architektur können untersucht werden.
