Name: modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging
Uploaded: 2015-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging at JoVE.com

This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Illinois zugelassen. Alle Tiere wurden in der Tierbetreuungseinrichtungen von der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care genehmigt gebracht. Jeder Versuch unternommen wurde, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren und Leid in allen Phasen der Studie zu reduzieren. 1. Vorbereitung und Beseitigung von Gehirn von Maus für Slicing <ol><li> Bereiten Sie für die Perfusion und Scheibe Inkubation. <ol><li> Etwa 30 Minuten vor dem Schneiden, bereiten hohen Saccharose Schneidlösung und niedrige Kalzium aCSF für die Inkubation der Scheibe vor der Aufzeichnung oder Abbildung. </li><li> Legen Sie alle notwendigen Werkzeuge (große stumpfe Ende Schere, kleine Feder Schere, anatomische Pinzetten, große Schere oder Guillotine, Iris Schere, Juweliere Zangen, 10 ml Spritze mit 27G x 1/2 Zoll Nadel, kleines Stück von 1 cm x 2 cm Filter Papier und ein gebrochen gekippt Pasteur-Pipette für slEis-Transfer) für die Durchblutung und Schneiden, und bereiten Perfusion Fach. </li><li> Up Inkubation Kammer mit sauerstoff aCSF in einem 32 ° C Wasserbad und einer Kulturschale mit Schnittlösung gefüllt wird. </li></ol></li><li> Bereiten Schneidphase für das Schneiden. <ol><li> Schneiden Sie ein kleines Stück von 3% Agar etwa 1 cm 3 als Rücklaufsperre für das Gehirn und 1,5 cm x 1,5 x 3 mm für eine Beule zu verwenden, um zur Stützung der IC werden. </li><li> Kleben die Rücklaufsperre auf die Bühne mit Cyanacrylatkleber sowie die Höcker auf der rechten Seite der Rücklaufsperre derart, dass sie eine 80 o Winkel bilden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Gehirn. <ol><li> Tief betäuben eine p12-p20 (idealer p14-18) Maus mit Ketamin 100 mg / kg und xylaxine 3 mg / kg (oder vergleichbar Ethikkommission genehmigten Verfahren). Hinweis: Bestätigen Sie die richtige Anästhesie Ebene über mangelnde Reaktion bis zu den Zehen Prise. Das Tier unter Narkose ist kurz gesagt, Augensalbe unnötig. </li><li> Verwendung stumpfeEnde Schere, setzen den Brustkorb von der Schwertfortsatz bis zum Hals. <ol><li> Finden Sie den Schwertfortsatz, und machen einen horizontalen Schnitt von ca. 1,5 cm. </li><li> Machen Sie zwei vertikale Schnitte von den Enden der vorherigen horizontalen Schnitt bis zu den Schultern, etwa 1,5 cm jeweils. </li></ol></li><li> Durch die Membran und den kostochondralen Gängen geschnitten, um das Herz freizulegen. </li><li> Mit kleinen Federschere, machen Sie eine kleine, 2-5 mm im rechten Vorhof geschnitten, von der ventralen zur Seite des Herzens dorsal. </li><li> Mit einem 10-ml-Spritze mit einer 27G x 1/2 Zoll Nadel, spritzen den linken Ventrikel und schnell durchströmen das Tier mit hohen Saccharose Schneidelösung. </li><li> Sobald das Blut läuft klar, verwenden Sie größere Schere, um den Kopf zu entfernen. Hinweis: Wir haben noch nicht systematisch den Nutzen der Perfusions bewertet. Aber nach unserer Erfahrung transcardiac Perfusion bei Mäusen dieser junge mit nahezu 100% Erfolg durchgeführt werden und hat den Vorteil der Beseitigung der roten blood-Zellen, die fluoreszieren und stören Bildgebung kann. </li><li> Schneiden Sie die Haut nach unten die Mittellinie, um den Schädel freizulegen. </li><li> Verwendung gebogen Iris Schere, schnitt den Schädel zwischen den Augen, dann ausgehend von der Schnitt zwischen den Augen, sorgfältig von anterior geschnitten, um entlang der Mittellinie Naht kümmert sich nicht um das Gehirn unter beschädigen posterior. Hinweis: Die Dura kommt in der Regel mit dem Schädel. Entfernen Sie gegebenenfalls die Dura, bevor sorgfältig Entfernen des Gehirns. </li><li> Verwendung Juweliere Zangen, hebeln Sie den Schädel und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn, dann das Gehirn in Schnittlösung. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Rinden. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung Gehirn für Slicing <ol><li> Vorbereiten des Gehirns für die Montage auf Vibratom Bühne. <ol><li> Mit Hilfe eines Objektträgers mit zwei Linien bei 90 o markiert und eine diagonale Linie bei 17 o von oben links nach unten rechts, wo die beiden sich kreuzenden Linien treffen, legen Sie die Gehirnrückenseite auf, miteine Rasierklinge, entfernen 2-4 mm des rostralen Ende Gehirn die Schaffung einer ebenen Fläche. </li><li> Legen Sie das Gehirn Schwanzseite nach oben auf die neu geschaffene flache Oberfläche, und richten Sie die dorsale Oberfläche des Gehirns mit der horizontalen und der Mittellinie des Gehirns mit der vertikalen Linie. </li><li> Richten Sie die Rasierklinge mit der 17 O-Leitung, kippen Sie den Rasierer in einem 30 ° Winkel und entfernen Sie etwa 3 mm von der rechten Cortex im Doppelschrägschnitt (17 o von der horizontalen Ebene und 60 o von der koronalen). </li></ol></li><li> Montage Hirn auf Vibratom Bühne. <ol><li> Stellen ein kleines Stück Filterpapier 1 cm x 2 cm auf der ventralen Seite des Gehirns, so daß die lange Abmessung rechtwinklig zu der Mittellinie. </li><li> Eine kleine Menge von Cyanacrylatkleber vorsichtig auf der den Bereich vor der Rücklaufsperre (und links des Höckers). </li><li> Der doppelte diagonal geschnitten Gehirn Gesicht auf den Leim, so dass der kaudalen Teil des Gehirns und Hinterhirn sind prgeopt auf dem Höcker und der rechten Seite des Gehirns, ist gegen die Rücklaufsperre. </li><li> Zart unten drücken Gehirn, so dass die gesamte Oberfläche in Kontakt mit der Schneidkammer. </li></ol></li></ol> 3. Abrufen der Colliculo-thalamokortikalen Scheibe <ol><li> Nehmen schnell die Schnitt Bühne und Platz in der Vibratom, füllen die Bühne mit modern Lösung. </li><li> Richten Sie die Klinge mit der Spitze (Bauchseite) des Gehirns. </li><li> Entfernen 1-1,5 mm von der Spitze des Gehirns, entfernen 300-500 &amp; mgr; m Scheiben und bewerten Tiefe nach Entfernen. Hinweis: Wenn der IC, der MGB und das Corpus geniculatum laterale (LGN) sind sichtbar, und der Gyrus dentatus bildet ein &quot;C&quot; Form annehmen 1.59 600 um Scheiben schneiden. Siehe 3A. </li><li> Die Scheiben in beheizten (32 ° C) Aufnahmekammer. </li></ol> 4. Imaging der Scheibe <ol><li> Vorbereitung für Flavoprotein Autofluoreszenz-Bildgebung. <ol> &lt;li&gt; Bereiten aCSF für die Perfusion von slice in einem Standard-elektrophysiologischen Aufzeichnungskammer, bubble aCSF mit 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Ziehen Glaselektrode für die Stimulation. Man beachte, dass mehrere verschiedene Stimulationselektroden und Konfigurationen (Glas, Wolfram, Kohlenstoff-Faser, monopolar, bipolar) alle Arbeiten sehr gut in Verbindung mit Flavoprotein Autofluoreszenz. </li><li> Schalten Sie Computer, Kamera, Mikromanipulator, Lichtquelle, Stimulationssoftware, Bildaufnahmesoftware. </li><li> Perfundieren die Aufnahmekammer mit sauerstoff aCSF, legen Sie benutzerdefinierte Brücke (Design-in Zusätzliche Materialien verfügbar), um Scheibe in der Kammer zu erhöhen. Hinweis: Perfusionsrate kann mit jeder einzelnen Einrichtung zu variieren; 5-15 ml / min zum Einsatz. </li><li> Zeigen Scheibe in der Kammer, senken Sie den Füllstand in der Kammer, um die Scheibe vom Abheben der Brücke zu verhindern, während Platzierung speziell konstruierten Harfe über Scheibe, wobei darauf zu vermeiden, dass Harfensaiten über Wege der interest (Abbildung 1A). Erhöhen Flüssigkeitspegel auf ca. 1-2 mm über Slice aCSF Satz ober- und unterhalb Scheibe zu halten. Hinweis: Wenn Neupositionierung notwendig ist, verwenden Sie den gebrochenen Ende Pasteur-Pipette oder erlauben dem aCSF Ebene zu erheben und verwenden Pinzette mit äußerster Vorsicht. </li><li> Legen Silberchlorid-Elektrode in die Glaselektrode mit aCSF gefüllt, legen Sie die Glaselektrode in die Mikromanipulator und eine Verbindung zum Isolator Reiz, und sorgfältig zu platzieren Glaselektrode in IC / weißen Substanz, die zu Thalamus (siehe 1A). </li></ol></li><li> Flavoprotein Autofluoreszenzbildaufnahme. <ol><li> Sammeln Bilder bei 4 Hz (mit einem unendlich korrigierte 2X Makro-Objektiv (NA 0,13)) und eine Kamera für 105 sec, während die elektrische Stimulation (jeder Stimulation besteht aus 1 s von 40 Hz 2 msec Impulse Gewebe bei 0,05 Hz fünfmal) während Beleuchtungs das Gewebe mit blauem Licht von 470 bis 490 nm und die Erfassung über 515 nm. Damit das Bild ist weder zuo dunkler, noch ausgeblasen siehe Abbildung 3 auf der linken Seite als Referenz. Hinweis: Sammelzeit, Sammlung Frequenz und Stimulationsfrequenz kann geändert werden, um das Experiment, das benutzerdefinierte Programm ergänzende Materialien enthalten können als solche geändert werden, zu entsprechen. </li><li> Export von Bildern in Matlab, und mit Hilfe der benutzerdefinierten geschriebenes Programm in Zusatzmaterialien zum spektralen Leistungs der Bilder bei 0,05 Hz zu analysieren. Das resultierende Bild wird angeschlossene Signalwege zu zeigen. Hinweis: Der individuelle Programm verwendet eine schnelle Fourier-Transformation der Pixelwerte in der Zeitreihe, um das Bild zu erzeugen. </li></ol></li><li> Vorbereitung für die Kalzium-Imaging. <ol><li> Bereiten Sie kleine Inkubationskammer mit einem 3 cm Kulturschale und hob Kulturmembran, damit aCSF, um sowohl die Ober- und Unterseite der Scheibe, und auf ein Heizkissen erreichen Temperatur bei ca. 32 o C zu erhalten </li><li> Füllen Sie kleine Inkubationskammer mit warmem aCSF und langsam Blase mit 95% O2/5% CO 2. </li><li> Mischungs 2 ul Pluronic F-127 Säure und 50 ug Fura-2AM in 48 ul DMSO gelöst. </li><li> Platz Scheibe in kleinen Inkubationskammer auf erhöhten Membran und sorgfältig mit einer Mikropipette hinzufügen Färbemischung direkt über der MGB (oder eine andere Struktur von Interesse). </li><li> Bedeckung Scheiben Bleichen vor der Bilderzeugung zu verhindern und zu ermöglichen Scheiben für 45 min inkubieren - 1 Std. </li><li> Entfernen Scheiben Warmhalteraum für 10-15 min abzuwaschen überschüssiges Material. </li><li> Führen Sie die Schritte 4.1.1 bis 4.1.6 für die Zubereitung zu stimulieren und die Bild colliculo-thalamokortikalen Slice. </li></ol></li><li> Calcium Bildaufnahme. <ol><li> Sammeln Sie Bilder mit 10 Hz (unter Verwendung eines 20X Wasserimmersionsobjektiv) für 25 sec, während elektrische Stimulation (jede Stimulation besteht aus einem 2 ms Puls) Gewebe bei 0,2 Hz fünf Mal beim Beleuchten des Gewebes mit Licht von 365 nm und die Erfassung Fluoreszenz oberhalb 510 nm. </li&gt; <li> Export von Bildern in Matlab und das benutzerdefinierte geschriebenes Programm in Zusatzmaterialien zum spektralen Leistungs der Bilder bei 0,2 Hz zu analysieren. Das resultierende Bild wird aktiven Zellen zu zeigen. </li></ol></li></ol>

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	<li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse.">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li><li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+(barrel)+cortex+in+vitro.">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li><li>Cruikshank, S. J., Rose, H. 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The authors have nothing to disclose.

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to our previous work1, which increase the yield of connected slices. These modifications include a slightly different cutting angle in the horizontal plane 17o compared to 20o, an added angle in the coronal plane, 60o from coronal and a smaller bump under the IC 1.5 mm compared to 2 mm. While small, these modifications greatly improve the yield and reliability of the method, with practice slices should be obtained 80-100% of the time. Along with obtaining the colliculo-thalamocortical slice, the protocol also describes rapid assessment of the connectivity of the slice ensuring that the slice is connected before further experimentation is done. With the enhanced reliability of the slice, it will be easier to use in conjunction with disease models to understand changes in the auditory system in the diseased state.
There are a few critical steps to optimize obtaining the colliculo-thalamocortical slice. While it is possible to use mice from postnatal day 12 through postnatal day 22, the highest rates of obtaining full connectivity in the slice are between postnatal day 14 and 18. Another critical step is rapid removal of the mouse brain, this will help ensure the health of the tissue providing for a better experiment. After removing the brain from the mouse and removing the frontal cortex, the double angled cut is the most critical step; a clean, fluid motion of the cut as well as maintaining the appropriate angles is necessary to align the appropriate brain structures. If the angled cuts are performed incorrectly, it is likely the connections from the MGB to the AC will not be maintained. If the 17 o angled cut is off by more than a few degrees, the connections from the IC to the MGB will be lost as well. Similarly, if the step underneath the IC is too large, the IC and MGB will be out of alignment. Using flavoprotein autofluorescence imaging, it is easy to quickly determine slice connectivity. If the slice is not fully connected, the stimulator can be moved around the slice to quickly determine which parts of the slice are connected so corrections can be made in future experiments. 
While this slice provides a method to explore information flow through the auditory system, there are some limitations. One of the major strengths of this method is the control of inputs to the nuclei of study, however many connections are severed in the slice. The functions are more complex in vivo so the modeling of this system would be incomplete. Similarly, the stimulation paradigms currently available will be different than the signals generated from sensory perception. Though these limitations are inherent in this in vitro system, the preparation is useful to understand information flow in the auditory system. Though onset of hearing in mice is approximately p1212,13the central auditory system is not yet fully developed at the time that these slices are prepared. This lack of full maturity of these slices may limit the generalizability of the findings derived from this slice.
The use of three-dimensional printing for specialized hardware for preserving and maintaining the slice's connections allows the experimenter to customize these pieces to their needs. Advances in three-dimensional printing allow for a highly customizable set of harps and bridges using materials better suited for placement of strings to hold down the slice at more precise tensions as well as holding up the slice and allowing for better fluid perfusion. These designs are easily customizable to the individual setup without the need for expensive or difficult to make pieces of equipment.

Im auditorischen System, obwohl es eine wesentliche Verarbeitung von Informationen zwischen der sensorischen Peripherie und dem Colliculus inferior, gibt es erhebliche zusätzliche Verarbeitung, bevor es den auditorischen Cortex erreicht. Wir wissen sehr wenig darüber, wie die Verarbeitung durchgeführt wird und deshalb wenig darüber, wie die Transformation ermöglicht es dem Gehirn, um eingehende sensorische Information zu interpretieren. Mit Ausnahme des Geruchssinns, hat jede der Richtungen eine sehr ähnliche Organisation mit Peripheriesignale anfänglich mit hoher Wiedergabetreue, die als das Signal steigt zum Cortex lehnt weitergeleitet. Der Cortex sendet dann Projektionen zu den unteren Strukturen weiter zu modulieren, die eingehenden Informationen. Dieses komplexe System in eine Vielzahl von Arten sowohl in vivo als auch in einer Reihe von in vitro-Präparationen untersucht. In der ehemaligen, alle Verbindungen intakt sind, so dass die Forscher, jede Menge von Verbindungen zu untersuchen, während die sensorischen Input und MessenAusgabe in einem bestimmten Gebiet. Mit diesem Ansatz gibt es wenig bis gar keine Kontrolle über die große Auswahl an anderen Eingängen, einschließlich anderer Sinneseindrücke, Erregung und Aufmerksamkeit, was zu einem intensiv komplexe Ausgangs. In vitro Hirnschnitten geschnitten worden, um entweder einen einzigen Satz zu erfassen von Vorsprüngen oder zwei verbundenen Hirnareale, die Forscher zu stimulieren und zu evaluieren verschiedene Afferenzen oder Gehirnbereiche zu ermöglichen. Diese sind häufig entweder thalamocortical oder tectothalamic Scheiben, bei denen entweder der Eingang für den Thalamus oder den Thalamus und dessen Ausgang mit dem Kortex bewahrt 2-5. Diese Präparate ermöglichen eine Vielzahl von pharmakologischen, elektrischen und optogenetischen Manipulationen. Jedoch mit nur zwei Hirnregionen, sie in erster Linie zu bewerten die Übertragung von Informationen und die Fähigkeit fehlt, die Umwandlung von Informationen auswerten, wenn er durch den Thalamus läuft. Auch die reticulo-Thalamus-Projektion, die in der Aufmerksamkeit Modulation eine Rolle spielen kann 6-9 prESENT in dieser Scheibe. Hier zeigen wir Verbesserungen an unseren früheren Herstellungsbeispiel 1, das die Ermittler Steuerung verschiedener Eingänge zum Thalamus ermöglicht, eine einzigartige Perspektive, wie Thalamus Toren und Filter Informationen. Wir Paar dieser Roman Schnittpräparat mit Flavoprotein Autofluoreszenz für die Beurteilung der Scheibe Konnektivität und groß angelegte Aktivierungsanalyse, Kalzium-Imaging im Thalamus zur neuronalen Populationsanalyse und Einzelzellableitung, um die Auswirkungen der verschiedenen Eingänge auf einer Einzelzellebene zu messen. Um bei der Aufrechterhaltung dieser weit verbreiteten Verbindungen unterstützen wir auch zum Halten der Hirnschnitt an Ort und Stelle und eine Brücke, um die Scheibe für eine verbesserte Durchblutung zu erhöhen entwickelt eine Reihe von Änderungen des normalen Schichtanker (aka &quot;harp&quot;). Die Harfe wird in einer modifizierten Hufeisenform entwickelt, um die Scheibe zu umgeben und ermöglichen anpassbare Befestigungspunkte für die Harfensaiten. Drei Saitenangebracht ist, dass i) eine horizontal liegt entlang der medialen Rand der Scheibe, ii) eine sich von der kaudalen Rand des IC bis zum kaudalen Rand des AC und iii) eines diagonal von der medialen Rand der Scheibe in einen Bereich erstreckt, rostral des AC (siehe 1A). Kleine Vertiefungen in dem Rahmen zum Kleben (mit Sekundenkleber) der Harfensaiten ermöglichen eine verringerte Menge an Druck auf die Scheibe zur Aufrechterhaltung Scheibe Integrität (siehe Abbildung 1B). Durch die Verwendung von dreidimensionalen Drucken, können wir kundenspezifisch anfertigen Harfen unserer einzigartigen Spezifikationen, sowie Brücken, die für eine ideale Strömung des künstlichen Liquor (aCSF) oberhalb und unterhalb des Gewebes zu ermöglichen. Dies hält auch große Flächen für Licht, um das Gewebe für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu durchdringen.

<table><tbody><tr><td>High sucrose cutting solution</td><td></td><td></td><td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 11.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 0.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Low calcium aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 1.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 2.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Lot: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Lot: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Lot: 1499369</td></tr><tr><td>Large culture dish</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13</td><td>100 x 15 mm culture dish</td></tr><tr><td>Small culture dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm culture dish</td></tr><tr><td>Raised culture membrane</td><td>Millicell</td><td>PICMORG50</td><td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td></tr><tr><td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&amp;ndash;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&amp;nbsp; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td></tr><tr><td>Calcium imaging fluorescence cube</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission</td></tr><tr><td>Agar for blocking brain</td><td></td><td></td><td>3% by weight in water</td></tr><tr><td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td><td>3D Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Ein Beispiel colliculo-thalamocortical Maushirnschnitt in P15-Maus ist in Figur 2 gezeigt ist. Die ideale Scheibe werden die vier Haupthirn und Vorderhirn Gehörstrukturen IC, MGB, TRN und AC, die alle aktiviert werden, wenn die IC-stimuliert enthalten (2A). Verwendung von Fourier-Analyse wird die spektrale Leistung zu der elektrischen Stimulationsfrequenz gemessen wird, verbunden mit Hirnregionen, die Aktivität, die periodisch ist und an der Stimulationsfrequenz 10 mitgerissen wird. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von der aufsteigenden Informationsfluss besonders im Thalamus als eine Verknüpfung zwischen dem Mittelhirn und Kortex. Während dieses Protokoll hilft bei der Produktion des angeschlossenen colliculo-thalamokortikalen Scheibe sowie Bereitstellung einer leicht kunden Satz von Hardware mit dem Einbau von 3D-Druck, enthalten sind ein Beispiel für eine Scheibe nicht aus dem Thalamus zum Kortex (2B verbunden ), ein<html> s sowie eine Anbindung Muster, bei dem der Thalamus keine Aktivität mit Flavoprotein Autofluoreszenz (2C) zu zeigen. Dies ist aufgrund der Verbindung wobei innerhalb des Scheibe derart, dass die Aktivierung nicht auf der Oberfläche der Scheibe und daher nicht mit dem Flavoprotein Autofluoreszenz ersichtlich wahrscheinlich. Es ist möglich, wenn auch unwahrscheinlich, dass dies antidromic Aktivierung. Wir haben beobachtet, wenn die Aktivierung antidrome Stimulierung der weißen Substanz des thalamocortical Vorsprünge 11, und mit dieser Stimulation Paradigma synaptischen Blockade im Thalamus bewirkt eine reversible Ausschaltung des kortikalen Signal 1. Mit Hilfe dieser Schicht, ist es auch möglich, bei Zellpopulation Aktivität im Thalamus mit elektrischer Stimulation des IC zu suchen. Eine Probe Calcium Imaging Experiment zeigt die Spikeaktivität einer kleinen Population von Thalamus-Neuronen in Reaktion auf einen Reiz im Mittelhirn (Abbildung 3). <html> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53067/53067fig1.jpg" /> Abbildung 1. Rendering von 3D-Druckmaterialien. (A) Übertragenes Bild der Scheibe sitzt auf der Brücke mit der bedruckten Harfe an Ort und Stelle. Der Pfeil zeigt die Strömung des aCSF. (B) Gerenderten Bild Hervorhebung Kerben für die Saiten der Harfe so dass für die dickere Scheibe (Kreise). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53067/53067fig2.jpg" /> Abbildung 2. Das Schneiden des Gehirns zum Schneiden. (A) Agar Positionierung auf der Schneidstufe. (B) Slide für Gehirn Positionierung. (C) Position des Gehirns, die für anteriore Schnitt. (D) Position des Gehirns und der Rasierer zum Doppelschrägschnitt. (E) Endgültige Sperrung von Gehirn zum Schneiden . <html> /ftp_upload/53067/53067fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Flavoprotein Autofluoreszenz-Bildgebung von colliculo-thalamokortikalen Hirnschnitt. (A) Verbunden colliculo-thalamokortikalen Hirnschnitt durch Flavoprotein Autofluoreszenz bestätigt. Die elektrische Stimulation bei 0,05 Hz der IC abgebildet mit 4 Hz und Fourier verarbeitet werden, um Leistung bei Stimulationsfrequenz zeigen. Hinweis Aktivierung der MGB, TRN und AC sowie Striatum (CS). (B) Nicht verbundene Scheibe. Die elektrische Stimulation des IC mit nur Aktivierung des MGB. Gesamten Weg wurde nicht erfasst wahrscheinlich auf 17 o Winkel etwas zu steil. (C) Atypische Aktivierung von AC. Die elektrische Stimulation des IC mit der Aktivierung der AC ohne sichtbares Signal in der MGB oder TRN. Weg wahrscheinlich intakt aber die aktiven Zellen in der MGB sind wahrscheinlich an der anderen Seite des Gewebes. ad / 53.067 / 53067fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Calcium Imaging. (A) Raw image beispielScheibe für Kalzium-Imaging beleuchtet. (B) Raw 20X Bild des MGB, sind helle Punkte Zellen. Maßstabsbalken 100 um. (C) Calcium-Signals mit elektrischen Stimulation des IC. Fourier-Verarbeitung zeigt Aktivierung der beiden Zellen weiße Pfeile und Neuropil schwarze Pfeilspitze. Inset, Zeitverlauf der gemittelten Signals (Einschub Maßstab 0,5% Veränderung der Fluoreszenz, 1 sec).

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Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Aufrufe.  University of Illinois Urbana-Champaign.  Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst. 

Serie: Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Verhalten

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Zwei-Photonen- und Weitfeld-Kalziumbildgebung im Colliculus superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung der neuronalen Kodierung und der Mechanismen der visuellen Verarbeitung im Colliculus superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Mehrschicht-Cortical Ca

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus