This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Illinois zugelassen. Alle Tiere wurden in der Tierbetreuungseinrichtungen von der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care genehmigt gebracht. Jeder Versuch unternommen wurde, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren und Leid in allen Phasen der Studie zu reduzieren. 1. Vorbereitung und Beseitigung von Gehirn von Maus für Slicing <ol><li> Bereiten Sie für die Perfusion und Scheibe Inkubation. <ol><li> Etwa 30 Minuten vor dem Schneiden, bereiten hohen Saccharose Schneidlösung und niedrige Kalzium aCSF für die Inkubation der Scheibe vor der Aufzeichnung oder Abbildung. </li><li> Legen Sie alle notwendigen Werkzeuge (große stumpfe Ende Schere, kleine Feder Schere, anatomische Pinzetten, große Schere oder Guillotine, Iris Schere, Juweliere Zangen, 10 ml Spritze mit 27G x 1/2 Zoll Nadel, kleines Stück von 1 cm x 2 cm Filter Papier und ein gebrochen gekippt Pasteur-Pipette für slEis-Transfer) für die Durchblutung und Schneiden, und bereiten Perfusion Fach. </li><li> Up Inkubation Kammer mit sauerstoff aCSF in einem 32 ° C Wasserbad und einer Kulturschale mit Schnittlösung gefüllt wird. </li></ol></li><li> Bereiten Schneidphase für das Schneiden. <ol><li> Schneiden Sie ein kleines Stück von 3% Agar etwa 1 cm 3 als Rücklaufsperre für das Gehirn und 1,5 cm x 1,5 x 3 mm für eine Beule zu verwenden, um zur Stützung der IC werden. </li><li> Kleben die Rücklaufsperre auf die Bühne mit Cyanacrylatkleber sowie die Höcker auf der rechten Seite der Rücklaufsperre derart, dass sie eine 80 o Winkel bilden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Gehirn. <ol><li> Tief betäuben eine p12-p20 (idealer p14-18) Maus mit Ketamin 100 mg / kg und xylaxine 3 mg / kg (oder vergleichbar Ethikkommission genehmigten Verfahren). Hinweis: Bestätigen Sie die richtige Anästhesie Ebene über mangelnde Reaktion bis zu den Zehen Prise. Das Tier unter Narkose ist kurz gesagt, Augensalbe unnötig. </li><li> Verwendung stumpfeEnde Schere, setzen den Brustkorb von der Schwertfortsatz bis zum Hals. <ol><li> Finden Sie den Schwertfortsatz, und machen einen horizontalen Schnitt von ca. 1,5 cm. </li><li> Machen Sie zwei vertikale Schnitte von den Enden der vorherigen horizontalen Schnitt bis zu den Schultern, etwa 1,5 cm jeweils. </li></ol></li><li> Durch die Membran und den kostochondralen Gängen geschnitten, um das Herz freizulegen. </li><li> Mit kleinen Federschere, machen Sie eine kleine, 2-5 mm im rechten Vorhof geschnitten, von der ventralen zur Seite des Herzens dorsal. </li><li> Mit einem 10-ml-Spritze mit einer 27G x 1/2 Zoll Nadel, spritzen den linken Ventrikel und schnell durchströmen das Tier mit hohen Saccharose Schneidelösung. </li><li> Sobald das Blut läuft klar, verwenden Sie größere Schere, um den Kopf zu entfernen. Hinweis: Wir haben noch nicht systematisch den Nutzen der Perfusions bewertet. Aber nach unserer Erfahrung transcardiac Perfusion bei Mäusen dieser junge mit nahezu 100% Erfolg durchgeführt werden und hat den Vorteil der Beseitigung der roten blood-Zellen, die fluoreszieren und stören Bildgebung kann. </li><li> Schneiden Sie die Haut nach unten die Mittellinie, um den Schädel freizulegen. </li><li> Verwendung gebogen Iris Schere, schnitt den Schädel zwischen den Augen, dann ausgehend von der Schnitt zwischen den Augen, sorgfältig von anterior geschnitten, um entlang der Mittellinie Naht kümmert sich nicht um das Gehirn unter beschädigen posterior. Hinweis: Die Dura kommt in der Regel mit dem Schädel. Entfernen Sie gegebenenfalls die Dura, bevor sorgfältig Entfernen des Gehirns. </li><li> Verwendung Juweliere Zangen, hebeln Sie den Schädel und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn, dann das Gehirn in Schnittlösung. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Rinden. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung Gehirn für Slicing <ol><li> Vorbereiten des Gehirns für die Montage auf Vibratom Bühne. <ol><li> Mit Hilfe eines Objektträgers mit zwei Linien bei 90 o markiert und eine diagonale Linie bei 17 o von oben links nach unten rechts, wo die beiden sich kreuzenden Linien treffen, legen Sie die Gehirnrückenseite auf, miteine Rasierklinge, entfernen 2-4 mm des rostralen Ende Gehirn die Schaffung einer ebenen Fläche. </li><li> Legen Sie das Gehirn Schwanzseite nach oben auf die neu geschaffene flache Oberfläche, und richten Sie die dorsale Oberfläche des Gehirns mit der horizontalen und der Mittellinie des Gehirns mit der vertikalen Linie. </li><li> Richten Sie die Rasierklinge mit der 17 O-Leitung, kippen Sie den Rasierer in einem 30 ° Winkel und entfernen Sie etwa 3 mm von der rechten Cortex im Doppelschrägschnitt (17 o von der horizontalen Ebene und 60 o von der koronalen). </li></ol></li><li> Montage Hirn auf Vibratom Bühne. <ol><li> Stellen ein kleines Stück Filterpapier 1 cm x 2 cm auf der ventralen Seite des Gehirns, so daß die lange Abmessung rechtwinklig zu der Mittellinie. </li><li> Eine kleine Menge von Cyanacrylatkleber vorsichtig auf der den Bereich vor der Rücklaufsperre (und links des Höckers). </li><li> Der doppelte diagonal geschnitten Gehirn Gesicht auf den Leim, so dass der kaudalen Teil des Gehirns und Hinterhirn sind prgeopt auf dem Höcker und der rechten Seite des Gehirns, ist gegen die Rücklaufsperre. </li><li> Zart unten drücken Gehirn, so dass die gesamte Oberfläche in Kontakt mit der Schneidkammer. </li></ol></li></ol> 3. Abrufen der Colliculo-thalamokortikalen Scheibe <ol><li> Nehmen schnell die Schnitt Bühne und Platz in der Vibratom, füllen die Bühne mit modern Lösung. </li><li> Richten Sie die Klinge mit der Spitze (Bauchseite) des Gehirns. </li><li> Entfernen 1-1,5 mm von der Spitze des Gehirns, entfernen 300-500 &amp; mgr; m Scheiben und bewerten Tiefe nach Entfernen. Hinweis: Wenn der IC, der MGB und das Corpus geniculatum laterale (LGN) sind sichtbar, und der Gyrus dentatus bildet ein &quot;C&quot; Form annehmen 1.59 600 um Scheiben schneiden. Siehe 3A. </li><li> Die Scheiben in beheizten (32 ° C) Aufnahmekammer. </li></ol> 4. Imaging der Scheibe <ol><li> Vorbereitung für Flavoprotein Autofluoreszenz-Bildgebung. <ol> &lt;li&gt; Bereiten aCSF für die Perfusion von slice in einem Standard-elektrophysiologischen Aufzeichnungskammer, bubble aCSF mit 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Ziehen Glaselektrode für die Stimulation. Man beachte, dass mehrere verschiedene Stimulationselektroden und Konfigurationen (Glas, Wolfram, Kohlenstoff-Faser, monopolar, bipolar) alle Arbeiten sehr gut in Verbindung mit Flavoprotein Autofluoreszenz. </li><li> Schalten Sie Computer, Kamera, Mikromanipulator, Lichtquelle, Stimulationssoftware, Bildaufnahmesoftware. </li><li> Perfundieren die Aufnahmekammer mit sauerstoff aCSF, legen Sie benutzerdefinierte Brücke (Design-in Zusätzliche Materialien verfügbar), um Scheibe in der Kammer zu erhöhen. Hinweis: Perfusionsrate kann mit jeder einzelnen Einrichtung zu variieren; 5-15 ml / min zum Einsatz. </li><li> Zeigen Scheibe in der Kammer, senken Sie den Füllstand in der Kammer, um die Scheibe vom Abheben der Brücke zu verhindern, während Platzierung speziell konstruierten Harfe über Scheibe, wobei darauf zu vermeiden, dass Harfensaiten über Wege der interest (Abbildung 1A). Erhöhen Flüssigkeitspegel auf ca. 1-2 mm über Slice aCSF Satz ober- und unterhalb Scheibe zu halten. Hinweis: Wenn Neupositionierung notwendig ist, verwenden Sie den gebrochenen Ende Pasteur-Pipette oder erlauben dem aCSF Ebene zu erheben und verwenden Pinzette mit äußerster Vorsicht. </li><li> Legen Silberchlorid-Elektrode in die Glaselektrode mit aCSF gefüllt, legen Sie die Glaselektrode in die Mikromanipulator und eine Verbindung zum Isolator Reiz, und sorgfältig zu platzieren Glaselektrode in IC / weißen Substanz, die zu Thalamus (siehe 1A). </li></ol></li><li> Flavoprotein Autofluoreszenzbildaufnahme. <ol><li> Sammeln Bilder bei 4 Hz (mit einem unendlich korrigierte 2X Makro-Objektiv (NA 0,13)) und eine Kamera für 105 sec, während die elektrische Stimulation (jeder Stimulation besteht aus 1 s von 40 Hz 2 msec Impulse Gewebe bei 0,05 Hz fünfmal) während Beleuchtungs das Gewebe mit blauem Licht von 470 bis 490 nm und die Erfassung über 515 nm. Damit das Bild ist weder zuo dunkler, noch ausgeblasen siehe Abbildung 3 auf der linken Seite als Referenz. Hinweis: Sammelzeit, Sammlung Frequenz und Stimulationsfrequenz kann geändert werden, um das Experiment, das benutzerdefinierte Programm ergänzende Materialien enthalten können als solche geändert werden, zu entsprechen. </li><li> Export von Bildern in Matlab, und mit Hilfe der benutzerdefinierten geschriebenes Programm in Zusatzmaterialien zum spektralen Leistungs der Bilder bei 0,05 Hz zu analysieren. Das resultierende Bild wird angeschlossene Signalwege zu zeigen. Hinweis: Der individuelle Programm verwendet eine schnelle Fourier-Transformation der Pixelwerte in der Zeitreihe, um das Bild zu erzeugen. </li></ol></li><li> Vorbereitung für die Kalzium-Imaging. <ol><li> Bereiten Sie kleine Inkubationskammer mit einem 3 cm Kulturschale und hob Kulturmembran, damit aCSF, um sowohl die Ober- und Unterseite der Scheibe, und auf ein Heizkissen erreichen Temperatur bei ca. 32 o C zu erhalten </li><li> Füllen Sie kleine Inkubationskammer mit warmem aCSF und langsam Blase mit 95% O2/5% CO 2. </li><li> Mischungs 2 ul Pluronic F-127 Säure und 50 ug Fura-2AM in 48 ul DMSO gelöst. </li><li> Platz Scheibe in kleinen Inkubationskammer auf erhöhten Membran und sorgfältig mit einer Mikropipette hinzufügen Färbemischung direkt über der MGB (oder eine andere Struktur von Interesse). </li><li> Bedeckung Scheiben Bleichen vor der Bilderzeugung zu verhindern und zu ermöglichen Scheiben für 45 min inkubieren - 1 Std. </li><li> Entfernen Scheiben Warmhalteraum für 10-15 min abzuwaschen überschüssiges Material. </li><li> Führen Sie die Schritte 4.1.1 bis 4.1.6 für die Zubereitung zu stimulieren und die Bild colliculo-thalamokortikalen Slice. </li></ol></li><li> Calcium Bildaufnahme. <ol><li> Sammeln Sie Bilder mit 10 Hz (unter Verwendung eines 20X Wasserimmersionsobjektiv) für 25 sec, während elektrische Stimulation (jede Stimulation besteht aus einem 2 ms Puls) Gewebe bei 0,2 Hz fünf Mal beim Beleuchten des Gewebes mit Licht von 365 nm und die Erfassung Fluoreszenz oberhalb 510 nm. </li&gt; <li> Export von Bildern in Matlab und das benutzerdefinierte geschriebenes Programm in Zusatzmaterialien zum spektralen Leistungs der Bilder bei 0,2 Hz zu analysieren. Das resultierende Bild wird aktiven Zellen zu zeigen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse.">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li><li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+(barrel)+cortex+in+vitro.">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li><li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro.">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li><li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway.">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li><li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+thalamocortical+slice.">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li><li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus.">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li><li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons.">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li><li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat.">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li><li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms.">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li><li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Paradigm+for+Optical+Imaging:+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal.">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li><li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus.">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning.">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li><li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse:+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy.">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

Im auditorischen System, obwohl es eine wesentliche Verarbeitung von Informationen zwischen der sensorischen Peripherie und dem Colliculus inferior, gibt es erhebliche zusätzliche Verarbeitung, bevor es den auditorischen Cortex erreicht. Wir wissen sehr wenig darüber, wie die Verarbeitung durchgeführt wird und deshalb wenig darüber, wie die Transformation ermöglicht es dem Gehirn, um eingehende sensorische Information zu interpretieren. Mit Ausnahme des Geruchssinns, hat jede der Richtungen eine sehr ähnliche Organisation mit Peripheriesignale anfänglich mit hoher Wiedergabetreue, die als das Signal steigt zum Cortex lehnt weitergeleitet. Der Cortex sendet dann Projektionen zu den unteren Strukturen weiter zu modulieren, die eingehenden Informationen. Dieses komplexe System in eine Vielzahl von Arten sowohl in vivo als auch in einer Reihe von in vitro-Präparationen untersucht. In der ehemaligen, alle Verbindungen intakt sind, so dass die Forscher, jede Menge von Verbindungen zu untersuchen, während die sensorischen Input und MessenAusgabe in einem bestimmten Gebiet. Mit diesem Ansatz gibt es wenig bis gar keine Kontrolle über die große Auswahl an anderen Eingängen, einschließlich anderer Sinneseindrücke, Erregung und Aufmerksamkeit, was zu einem intensiv komplexe Ausgangs. In vitro Hirnschnitten geschnitten worden, um entweder einen einzigen Satz zu erfassen von Vorsprüngen oder zwei verbundenen Hirnareale, die Forscher zu stimulieren und zu evaluieren verschiedene Afferenzen oder Gehirnbereiche zu ermöglichen. Diese sind häufig entweder thalamocortical oder tectothalamic Scheiben, bei denen entweder der Eingang für den Thalamus oder den Thalamus und dessen Ausgang mit dem Kortex bewahrt 2-5. Diese Präparate ermöglichen eine Vielzahl von pharmakologischen, elektrischen und optogenetischen Manipulationen. Jedoch mit nur zwei Hirnregionen, sie in erster Linie zu bewerten die Übertragung von Informationen und die Fähigkeit fehlt, die Umwandlung von Informationen auswerten, wenn er durch den Thalamus läuft. Auch die reticulo-Thalamus-Projektion, die in der Aufmerksamkeit Modulation eine Rolle spielen kann 6-9 prESENT in dieser Scheibe. Hier zeigen wir Verbesserungen an unseren früheren Herstellungsbeispiel 1, das die Ermittler Steuerung verschiedener Eingänge zum Thalamus ermöglicht, eine einzigartige Perspektive, wie Thalamus Toren und Filter Informationen. Wir Paar dieser Roman Schnittpräparat mit Flavoprotein Autofluoreszenz für die Beurteilung der Scheibe Konnektivität und groß angelegte Aktivierungsanalyse, Kalzium-Imaging im Thalamus zur neuronalen Populationsanalyse und Einzelzellableitung, um die Auswirkungen der verschiedenen Eingänge auf einer Einzelzellebene zu messen. Um bei der Aufrechterhaltung dieser weit verbreiteten Verbindungen unterstützen wir auch zum Halten der Hirnschnitt an Ort und Stelle und eine Brücke, um die Scheibe für eine verbesserte Durchblutung zu erhöhen entwickelt eine Reihe von Änderungen des normalen Schichtanker (aka &quot;harp&quot;). Die Harfe wird in einer modifizierten Hufeisenform entwickelt, um die Scheibe zu umgeben und ermöglichen anpassbare Befestigungspunkte für die Harfensaiten. Drei Saitenangebracht ist, dass i) eine horizontal liegt entlang der medialen Rand der Scheibe, ii) eine sich von der kaudalen Rand des IC bis zum kaudalen Rand des AC und iii) eines diagonal von der medialen Rand der Scheibe in einen Bereich erstreckt, rostral des AC (siehe 1A). Kleine Vertiefungen in dem Rahmen zum Kleben (mit Sekundenkleber) der Harfensaiten ermöglichen eine verringerte Menge an Druck auf die Scheibe zur Aufrechterhaltung Scheibe Integrität (siehe Abbildung 1B). Durch die Verwendung von dreidimensionalen Drucken, können wir kundenspezifisch anfertigen Harfen unserer einzigartigen Spezifikationen, sowie Brücken, die für eine ideale Strömung des künstlichen Liquor (aCSF) oberhalb und unterhalb des Gewebes zu ermöglichen. Dies hält auch große Flächen für Licht, um das Gewebe für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu durchdringen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low calcium aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Lot: 1572C502</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td>Lot: 144912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Lot: 1499369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large culture dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-13</td>
			<td>100x15mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td align="right">353001</td>
			<td>35x10mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raised culture membrane</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMNIB</td>
			<td>470&#8211;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&#160; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium imaging fluorescence cube</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>BX-18</td>
			<td>XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for blocking brain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% by weight in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Ein Beispiel colliculo-thalamocortical Maushirnschnitt in P15-Maus ist in Figur 2 gezeigt ist. Die ideale Scheibe werden die vier Haupthirn und Vorderhirn Gehörstrukturen IC, MGB, TRN und AC, die alle aktiviert werden, wenn die IC-stimuliert enthalten (2A). Verwendung von Fourier-Analyse wird die spektrale Leistung zu der elektrischen Stimulationsfrequenz gemessen wird, verbunden mit Hirnregionen, die Aktivität, die periodisch ist und an der Stimulationsfrequenz<...

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Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Aufrufe.  University of Illinois Urbana-Champaign.  Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst. 

Serie: Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

3-D-Bildgebung und Analyse von Neuronen Infizierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Mit<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, typically 3 mm x 3 mm. This protocol introduces a method for creating a substantially larger 7 mm x 6 mm cranial window exposing most of a cerebral hemisphere over the mouse temporal and parietal cortices (e.g., bregma 2.5 - 4.5 mm, lateral 0 - 6 mm). To perform this surgery, the head must be tilted approximately 30&#176; and much of the temporal muscle must be retracted. Due to the large amount of bone removal, this procedure is intended only for acute experiments with the animal anesthetized throughout the surgery and experiment.
The main advantage of this innovative large lateral cranial window is to provide simultaneous access to both medial and lateral areas of the cortex. This large unilateral cranial window can be used to study the neural dynamics between cells, as well as between different cortical areas by combining multi-electrode electrophysiological recordings, imaging of neuronal activity (e.g., intrinsic or extrinsic imaging), and optogenetic stimulation. Additionally, this large craniotomy also exposes a large area of cortical blood vessels, allowing for direct manipulation of the lateral cortical vasculature.

This protocol presents a method for creating a large unilateral craniotomy over the temporal and parietal regions of the mouse cerebral cortex. This is especially useful for real time imaging over an expansive area of a cortical hemisphere.

Ein Großer Lateral Craniotomy Verfahren für Mesoskalige Breitfeld Optical Imaging von Hirnaktivität

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...