Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss zu MK und BKK von der Ellison Medical Foundation unterstützt. MK ist eine Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging. Wir möchten Soumya Kotireddy für die Unterstützung danken, während der Dreharbeiten.

Teil 1: Bereiten Stämme und Platten für replikativen Lebensspanne Analyse Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung der festen YEPD Platten für den Einsatz in der replikativen Lebensspanne Experiment und die Vorbereitung der Hefezellen für Lebensdauer-Analyse. <ol><li> Mit geeigneten sterilen Technik vorzubereiten YEPD Agarplatten (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Agar, 2% Glucose), die für die Kultivierung Hefezellen und für replikativen Lebensspanne Analyse verwendet werden. Sie sollten mindestens 2 Platten für alle 4-5 Stämme in der Lebensspanne Experiment analysiert werden vorbereitet. Die Platten sollten bereit sein mindestens 2 Tage vor der Lebensdauer Experiment und darf vor Beginn der Lebensdauer Assay trocken. Wenn das Experiment nicht innerhalb von 4-5 Tagen von Gießen der Platten begonnen werden, sollten sie in einem Kühlbrutschrank gelegt und eingewickelt in Parafilm oder Kunststoff zur Austrocknung zu verhindern. </li><li> Entfernen Hefestämme aus gefrorenen Beständen und Streifen für einzelne Kolonien auf YEPD Agarplatten. Bis zu 6 Stämme können leicht auf dem gleichen YEPD Platte durch die Aufteilung der Platte in gleich große Kuchen-förmige Keile ausgestrichen werden. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 30 ° C für 2 Tage. </li><li> Remove-Zellen aus dem Inkubator-und Patch-Zellen aus einer einzelnen Kolonie auf eine frische YEPD Platte. Zwei Patches aus zwei verschiedenen Kolonien sollten für jeden Stamm erzeugt werden. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Stämme analysiert werden codiert, um sicherzustellen, dass die replikativen Lebensspanne Experiment durchgeführt wird &quot;blind&quot;, wo die Dissektoren nicht wissen, die Identität der einzelnen Stämme werden. </li><li> Inkubieren Sie die gepatchte, codierte Zellen bei 30 ° C bis zum folgenden Abend. </li><li> Entfernen Sie die Zellen und leicht Patch Zellen voneinander kodiert anstrengen, um frische YEPD Platten, die als experimentelle Platten für die replikativen Lebensspanne Analyse dienen soll. Die Zellen sind entlang einer vertikalen Linie auf der linken Seite des YEPD Platte (Abbildung 1) gepatcht werden. Ca. 3-5 Patches pro Platte ist optimal, vorausgesetzt, replikativen Lebensspanne Analyse auf 20 Zellen von jedem Patch. Es ist nicht notwendig (und auch wünschenswert), eine große Anzahl von Zellen, um die frische YEPD Platte zu übertragen, da dies zu den Zellen zu dicht wachsen während der Inkubation über Nacht, die ihre spätere replikativen Lebensspanne begrenzen kann. </li><li> Inkubieren Sie die frisch gepatchte Platten über Nacht auf der Tischplatte. </li></ol> Teil 2: Position Zellen für replikativen Lebensspanne Analyse. In diesem Abschnitt werden wir beschreiben, wie man die Hefezellen auf der Platte und wie Jungfrau, die Tochter Zellen für replikativen Lebensspanne Analyse zu erhalten Position. Von diesem Zeitpunkt an sollten alle Platten parafilmed, außer wenn unterziehen Dissektion werden, um Austrocknung zu verhindern. <ol><li> Mit einem Mikroskop mit einer Mikrodissektion geeigneten Vorrichtung für die Hefe ausgestattet, Transfer ca. 50 Zellen, die aus dem ersten Patch anstrengen, um eine Position auf der Platte distal der gepatchten Zellen. Wenn Ihr Mikroskoptisch wird benotet, kann diese Abstufungen verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen leicht sein wird im späteren Iterationen zu finden. Auf der Zeiss Axioskop 40, können die Zellen aus dem ersten Patch Belastung an den Koordinaten 90 x 10 platziert und vertikal von dort aufgereiht. </li><li> Reinigen Sie die Nadel von Zellen durch wiederholtes Berühren der Agar-Oberfläche, dann erstellen Sie ein Loch in den Agar durch zwingen die Nadel durch die Agar-Oberfläche. Dieses Loch wird als Marker zu orientieren Sie sich auf der Platte dienen bei späteren Iterationen Dissektion und Tochterzelle Entfernung. Achten Sie darauf, Hefezellen in das Loch zu bekommen, oder sie wachsen und bilden eine Kolonie. </li><li> Direkt über dem Loch, vertikal auszurichten einzelnen Hefezellen in 20 gleichmäßig verteilten Positionen, mit 1-3 Nadeldurchmesser (~ 100 nM) zwischen jeder Zelle Position (Abbildung 1). Alle paar Zellen, Platz zwei Zellen nebeneinander in der gleichen Position in der Zeile statt einer. Dies ermöglicht eine Redundanz bei Jungfrau, die Tochter Zelle Auswahl, wenn einer der übertragenen Zellen nicht teilen. </li><li> Zwischen dem 10. und 11. Positionen in der Linie, eine horizontale Reihe von 7-8 Löcher in den Agar. Dies wird als Marker zu orientieren Sie sich auf der Platte während der nachfolgenden Iterationen der Dissektion und Tochterzelle Entfernung dienen. Achten Sie darauf, Hefezellen in die Löcher zu bekommen, oder sie wachsen und bilden eine Kolonie. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,4 für jeden Patch auf der Platte, weiter zu Array-Zellen vertikal entlang der gleichen Achse. Für Schritt 2,2, sollte die Anzahl der Löcher geschaffen, um die Patch-Nummer (ein Loch für den ersten Patch, zwei Löcher für die zweite, etc.) entsprechen. </li><li> Sobald Zellen haben für jeden Patch angeordnet, Parafilm der Platte und inkubieren bei 30 ° C für ca. 2 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,6 für jede Platte in das Experiment. </li></ol> Teil 3: Erhalten Jungfrau, die Tochter Zellen für Lebensdauer-Analyse In diesem Abschnitt werden wir beginnen die Lebensdauer Analyse, indem sichergestellt wird, dass jede Zelle als eine Jungfrau, die Tochter beginntZelle. <ol><li> Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sicherstellen, dass die meisten der angeordneten Zellen haben eine Zellteilung durchlaufen. Wenn zusätzliche Zeit benötigt wird, damit die Zellteilung abgeschlossen ist, geben Sie die Platte in den Inkubator. </li><li> Beginnend mit dem ersten angeordnet Zelle, verwenden Sie die Nadel auf Tochterzellen aus der Mutterzelle durch sanftes Auflegen der Nadel auf der Oberseite des anhaftenden Zellen zu lösen. Manchmal ist es hilfreich zur Seite des Mikroskops Basis klopfen, während die Nadel auf die Zellen ruht. </li><li> Legen Sie die freistehende Tochterzelle in die vertikale Linie, anstelle der Mutterzelle und alle weiteren Tochterzellen und bewegte sie vorübergehend beiseite. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3,2 und 3,3 für jedes der angeordneten Zellen. Wenn eine Zelle nicht teilen, nehmen Sie eine Tochterzelle aus einer der redundanten Zellen in Schritt 2.3 positioniert. Wenn Sie fertig sind, sollten Sie verfügen über 20 Tochter-Zellen für jeden Patch vertikal auf die Lebensdauer Platte ausgerichtet. </li><li> Sammeln Sie alle der Mutter-Zellen und extra Tochterzellen in einen Haufen und übertragen Sie sie zurück in ein Gebiet in der Nähe des Patches (&quot;Friedhof&quot;). Es ist wichtig, um unerwünschte Zellen weit von den Zellen, die eine Lebensdauer-Analyse zur Bildung von Mikrokolonien und die Erschöpfung der lokalen Nährstoffen verhindern zu halten. </li><li> Parafilm der Platte und inkubieren bei 30 ° C für ca. 2 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,6 für jede Platte in das Experiment. </li></ol> Teil 4: Messung der replikativen Kapazität der einzelnen Zellen <ol><li> Bereiten Sie die Lebensdauer Datenblättern. Eine Lebensdauer Datenblatt kann ein einfaches Gitter, wobei jede Zeile entspricht einer einzelnen Mutterzelle und jede Spalte entspricht einem Alter-Punkt (Abbildung 2). Beschriften Sie jedes Datenblatt nach der Zahl der Stämme analysiert werden. </li><li> Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sicherstellen, dass die meisten der angeordneten Zellen haben mindestens eine Zellteilung durchlaufen. Wenn zusätzliche Zeit benötigt wird, damit die Zellteilung abgeschlossen ist, geben Sie die Platte in den Inkubator. </li><li> Beginnend mit dem ersten angeordnet Zelle auf der ersten Platte, visuell zu beobachten Mutter und Tochter Zelle (n) und bestimmen Sie die Anzahl der Zellteilungen, die aufgetreten sind. Es ist im Allgemeinen leicht zu bestimmen, wie viele Tochterzellen eine Mutter produziert hat, basierend auf charakteristische Muster von Zell-Arrangements. Notieren Sie die Anzahl der Tochterzellen von der Mutterzelle in das entsprechende Feld auf die Lebensdauer Notenblatt produziert. </li><li> Verwenden Sie die Nadel auf Tochterzellen aus der Mutterzelle, wie in Schritt 3.2 beschrieben zu lösen. </li><li> Bewahren Sie die Mutterzelle in seiner Position in der vertikalen Linie und bewegen Sie die Tochter Zelle (n) vorübergehend beiseite. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5 für jede der Zellen angeordnet. </li><li> Sammle alle verworfen Tochterzellen und verschieben Sie sie in den &quot;Friedhof&quot;, in der Nähe des ursprünglichen Patches entfernt. </li><li> Parafilm der Platte und inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,8 für jede Platte in das Experiment. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,9, bis alle Mutter-Zellen aufgehört haben sich zu teilen. Als die Mutter Zellen altern, wird der Zellzyklus langsamer und wird es wünschenswert sein, um die Platte für längere Zeit zwischen Alter-Punkte inkubieren. Die Platten können bei 4 ° C über Nacht gelegt werden. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse. Die Rohdaten von einem replikativen Lebensspanne Experiment erzeugt wird, eine Liste Zahlen entsprechend Tochterzellen durch jede Mutter Zelle in jedem Alter-Punkt (Abbildung 2) produziert. Durch Summierung jeder Zeile der Spielberichtsbogen ist der replikativen Lebensspanne für jede Mutterzelle erhalten. Die Daten für Mutter-Zellen aus den gleichen experimentellen Gruppe gepoolt, um ein Überleben Kurve (Abbildung 3A) zu erzeugen und statistische Berechnungen, wie zB mittlere Lebensdauer, mittlere Lebensdauer und die Standardabweichung durchzuführen. Ein nicht-parametrischen Test, wie der Wilcoxon Rank-Sum-Test durchgeführt um festzustellen, ob signifikante Unterschiede in Lebensdauer zwischen experimentellen Gruppen wurden erkannt werden. Wenn das Experiment richtig funktioniert, sollte das Überleben Kurve in etwa im Einklang mit Gompertz-Makeham Kinetik zeigt eine sigmoide shap mit niedrigen Frühletalität folgte eine relativ raschen Rückgang der Überlebensrate und eine Abflachung der Kurve zu einem späteren Alter. Die meisten Wildtyp-Stämme haben replikativen Lebensspanne Werte in der 20-30 Generation Bereich, obwohl Variation außerhalb dieses Bereichs berichtet worden ist. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Abbildung 1.5" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung eines typischen replikativen Lebensspanne Platte. Am Abend vor Beginn Mikrodissektion von Hefezellen, sind 3-5 Stämme leicht auf die Oberfläche eines YEPD Platte (rote Kästen) in einer vertikalen Linie entlang einer Seite der Platte gepatcht. Nach Wachstum über Nacht, sind etwa 30 einzelnen Zellen jedes Stammes vertikal in eine Linie mit 20 Positionen bekleidet. Lebensdauer analysis wird auf v Jungfrau, die Tochter Zellen aus diesen ersten erhaltenen Zellen durchgeführt werden. Extra-Zellen aus Mikrodissektion während des Experiments (zB unerwünschte Tochter-Zellen) gewonnen werden in &quot;The Graveyard&quot; (graues Oval), die weit weg von der experimentellen Zellen befindet, um die lokalen Erschöpfung der Nährstoffe als Kolonien gebildet sind, zu vermeiden platziert. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein replikativen Lebensspanne Strichliste. Raw Daten aus einer replikativen Lebensspanne Experiment ist gezeigt. Jede Zeile entspricht einem Hefe Mutterzelle und jede Spalte entspricht einem Alter-Punkt. Die Zahl in jedem Feld eingegeben wird, die Zahl der Tochterzellen durch die Mutterzelle in diesem Alter-Punkt produziert. Jeder Stamm ist mit einer codierten Zahl, so dass die einzelnen seziert die Hefezellen keine Kenntnis von der Identität der Stämme, die analysiert wurde beschriftet. Twenty-Zellen sind für jeden Stamm untersucht. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Vertreter Überleben und Wachstum Kurven aus einer replikativen Lebensspanne Experiment. (A) Überlebenskurven sind durch Auftragen der Anteil der Mutter-Zellen noch am Leben, als eine Funktion der replikativen Alter (Anzahl der Zellteilungen. (B) erhaltenen Wachstumskurven werden durch Auftragen der erhaltenen durchschnittliche Zahl der Tochterzellen von einer bestimmten Dehnung als Funktion des Alters-Punkt erzeugt. In diesem Beispiel ist der Stamm Nr. 2 langlebiger ist aber langsamer wachsen, als durch die reduzierte anfängliche Steigung der Wachstum Grundstück belegt.

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

Altern ist ein degenerativer Prozess durch eine progressive Verschlechterung der zellulären Bestandteile und Organellen aufgrund der Mortalität gekennzeichnet. Die Bierhefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Wurde ausgiebig auf die Biologie des Alterns Studie verwendet, und mehrere Determinanten der Hefe Langlebigkeit haben gezeigt, dass in vielzelligen Eukaryoten, einschließlich Würmern konserviert werden, Fliegen und Mäusen<sup&gt; 1</sup&gt;. Aufgrund des Fehlens von leicht quantifizieren Alter-assoziierten Phänotypen, Altern in Hefe wurde fast ausschließlich durch die Messung der Lebensdauer von Zellen in unterschiedlichen Kontexten untersucht, mit zwei unterschiedlichen Lebensdauer Paradigmen im allgemeinen Sprachgebrauch<sup&gt; 2</sup&gt;. Chronologische Lebensdauer bezieht sich auf die Länge der Zeit, dass eine Mutter Zelle kann in einem nicht-teilenden, Ruhe-ähnlichen Zustand zu überleben, wird vorgeschlagen, die als Modell für die Alterung der post-mitotischen Zellen in vielzelligen Eukaryoten dienen. Replikativen Lebensspanne, im Gegensatz dazu bezieht sich die Zahl der Tochterzellen von einer Mutterzelle vor Seneszenz produziert, und es wird vermutet, um ein Modell des Alterns in mitotisch aktiven Zellen. Hier präsentieren wir eine verallgemeinerte Protokoll zur Messung der replikativen Lebensspanne von Hefezellen Mutter-Zellen. Das Ziel der replikativen Lebensspanne Test ist zu bestimmen, wie oft jede Mutterzelle Knospen. Die Mutter und Tochter-Zellen können leicht von einem erfahrenen Wissenschaftler mit einem Standard-Lichtmikroskop (Gesamtvergrößerung 160X), wie die Zeiss Axioskop 40 oder ein anderes vergleichbares Modell unterschieden werden. Die physische Trennung der Tochterzellen von der Mutter-Zellen wird durch eine manuelle Mikromanipulator mit einem Glasfaser-Nadel ausgestattet. Typische Labor Hefestämme produzieren 20-30 Tochterzellen pro Mutter und eine Lebensdauer Experiment erfordert 2-3 Wochen.

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der replikativen Lebensspanne von Hefe Mutter-Zellen.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

20.5K Aufrufe.  University of Washington. In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der replikativen Lebensspanne von Hefe Mutter-Zellen.

Serie: Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Forschung

Biologie

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.