Diese Arbeit wurde vom NIH Grant 1R21AG031965-01A1 unterstützt. MK ist eine Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging.

Teil 1: Vorbereitung der alternden Kulturen <ol><li> Streak-Stämmen von Interesse aus gefrorenen Beständen auf YEPD Agarplatten (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Agar, 2% Glucose). </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 30 ˚ C für 48 Stunden oder bis einzelne Kolonien erscheinen. </li><li> Wählen Sie einzelne Kolonien und impfen in 5 ml YEPD flüssigen Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Glucose) in Reagenzgläsern. </li><li> Wachsen Kulturen über Nacht bei 30 ˚ C unter Beibehaltung konstanter Bewegung entweder mit einem Shaker oder Bandage. </li><li> Impfen 5 ml synthetischen komplett (SC)-Medium (Tabelle 1) mit 50 ul der Übernacht-Kultur. In der Regel drei SC Kulturen sind für jeden Stamm zu dreifacher Ausfertigung biologische Replikation der Lebensdauer-Analyse für jeden Stamm untersucht bieten vorbereitet. </li><li> Pflegen Sie die Kulturen bei 30 ˚ C unter ständigem Rühren auf eine Bandage für das gesamte Experiment (in der Regel 2 Wochen oder mehr). </li></ol> Teil 2: Taking a Lebensfähigkeit Alter-Punkt Nach zwei Tagen der Kultur in SC Medien sollten die Zellen in der stationären Phase und das erste Lebensjahr-Punkt bereit ist, entnommen werden. Nachfolgende Alter-Punkte sollte jeder genommen werden 2-3 Tage bei einem Mindestaufenthalt von zwei Wochen. Für jedes Alter Punkt: <ol><li> Bereiten Sie die Bioscreen 100-und Honeycomb-Platten für die Impfung durch das Ausfüllen jedes Well mit 145 ul der YEPD. Achten Sie darauf, mindestens ein gut gefüllt mit nur YEPD und keine Zellen für die Datenanalyse später verlassen. </li><li> Entfernen Sie den alternden Kulturen aus dem Inkubator. </li><li> Kurz Wirbel die erste Kultur, in die Wabenplatte geimpft werden, während sie darauf, dass keine der Kultur zu verschütten. </li><li> Entfernen 5 ul der Mischkultur und Pipette in das erste Bohrloch des Honeycomb Platte. Flamme der Mündung jedes Reagenzglas vor und nach dem Entfernen der 5 ul-Aliquot. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden alternden Kultur sicher zu sein, die gut zu positionieren, die der jeweiligen Kultur zur Kenntnis. Identisch auch Positionen sollten für jede nachfolgende Alter-Punkt während des gesamten Experiments verwendet werden. </li><li> Ersetzen Sie die Kulturen in den 30 ˚ C Inkubator, wenn sie mit den Impfungen abgeschlossen. </li></ol> Teil 3: Laden der Bioscreen C MBR-Maschine <ol><li> Expose des Inkubators Fach durch Anheben des Deckels und entfernen Sie die Abdeckung der Probenteller. </li><li> Legen Sie die neu geimpft Honeycomb Platte in Probenteller (verwenden Sie den linken Steckplatz, wenn Sie nur zu lesen sind eine Platte). </li><li> Setzen Sie den Deckel auf die Probenteller und senken Sie den Deckel in den Inkubator Fach. </li><li> Überprüfen Sie, ob der Wärmeträgerflüssigkeit wird über der minimalen Füllstand. Wenn niedrig, fügen Sie mehr mit einem 1000 ul Pipette mit dem Wärmeträger zur Verfügung gestellt. </li><li> Mit dem Bioscreen Software &quot;EZExperiment&quot;, die folgenden Parameter, um geeignete Wachstumskurven für Saccharomyces cerevisiae erhalten: <ul><li> Anzahl der Proben: Geben Sie die Anzahl der Brunnen mit den Medien oder 200 </li><li> Filter: 420-580nm, Wideband </li><li> Temperatur: 30 ˚ C </li><li> Experiment Dauer: 1 Tag, 0 Stunden, 0 Sekunden </li><li> Messintervall: 30 Minuten </li><li> Shaking: On, kontinuierlichem Schütteln, High </li></ul></li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot; zu Lesungen beginnen. </li></ol> Teil 4: Data Analysis In der Regel sind sechs alters-Punkte im Laufe von zwei Wochen aufgenommen. Das Alter-Punkte sind an den Tagen 2, 4, 6, 9, 11 und 13 übernommen. Abhängig von der Versuchsplanung und-Stämme getestet, kann es wünschenswert sein Alter-Punkte mehr oder weniger häufig oder für länger als 2 Wochen dauern. Es ist wichtig, die Wabenplatte in der gleichen Reihenfolge laden für jedes Alter-Punkt, so dass jeder alternden Kultur auf die gleiche Position auch in jedem Alter-Punkt entspricht, wie dies zu machen Datenanalyse viel einfacher. <ol><li> Besorgen Sie sich die Output-Dateien aus dem Bioscreen C MBR Maschine. Die Software &quot;EZExperiment&quot; ausgegeben der Bioscreen Daten als tab-getrennte Datei, die kompatibel mit Microsoft Excel sowie andere Software ist. Die erste Spalte zeigt an, wann der OD-Messung wurde während des Experiments genommen, mit folgenden Spalten repräsentieren jeweils auch in der Bioscreen Honeycomb-Platten (Abbildung 1). </li><li> Löschen Sie die erste OD Lesung aus jeder Spalte. Diese Lesart ist &quot;Rauschen&quot;. </li><li> Normalisieren der Daten durch Subtraktion der OD-Wert des Brunnens mit allein von allen OD-Werten in jeder Spalte YEPD. Dadurch wird der Hintergrund Absorption durch die Medien. </li><li> Plot der Auswuchs Kurven. Die Kurven werden als Funktion des Alters (Abb. 2) zu verlagern. Zum Beispiel, indem man die Folge Kurven aus Spalte 1 (gut 1 des Honeycomb-Platte) in den sechs Zeitpunkten, gibt es eine deutliche Rechtsverschiebung der Kurven über die Zeit. </li><li> Berechnen Sie die Verdoppelungszeit (δ) für jeden gut auf die Wachstumskinetik des Tages 2 Alter-Punkt-Basis. Die Gleichung zur Verdopplungszeit berechnen is: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="Gleichung" /> wo OD 1 und OD 2 aufeinanderfolgenden OD-Messungen und t 1 und t 2 wird die Zeit zwischen den Messungen darstellen. Berechnen Verdoppelungszeiten nur zwischen OD-Werten von 0,2 bis 0,5. Der Durchschnitt dieser Werte ist die Verdoppelung Zeit für so gut. Berechnen Verdoppelungszeiten nur zwischen OD-Werten von 0,2 bis 0,5. Der Durchschnitt dieser Werte ist die Verdoppelung Zeit für so gut. Die meisten Wildtyp-Hefestämme sollte eine Verdoppelung der Zeit-Wert zwischen 85 bis 90 Minuten. </li><li> Für jedes Alter-Punkt, berechnen Sie die Zeitverschiebung (At) in das Auswachsen Kurven gegenüber der ursprünglichen Zeit-Punkt (Tag 2). Eine einfache Möglichkeit, dies zu tun ist, um den Unterschied in der Länge der Zeit, für jeden gut fand zu einer OD von 0,3 zwischen dem ersten Lebensjahr-Punkt und jedes weitere Lebensjahr-Punkt erreichen zu bestimmen. Die Zeit, die ein bestimmtes gut einer OD von 0,3 erreicht werden können aus der linearen Regressionsgleichung entspricht ln (OD) als Funktion der Zeit zwischen den beiden Zeitpunkten Bracketing OD = 0,3 berechnet werden. </li><li> Berechnen Sie den Bruchteil überlebt in jedem Alter-Punkt, um ein Überleben Kurve (Abbildung 3) zu generieren. Definieren Sie den ersten Jahren-Punkt (Tag 2) zu 100% Lebensfähigkeit werden. Für jeden weiteren Alters-Punkt-Berechnung der prozentualen Überlebensrate nach der Gleichung: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="Zweite Gleichung" width="245" height="115" /> wo s n das Überleben Prozentsatz ist, ist At n die Zeitverschiebung und δ n ist die Verdoppelung der Zeit. </li><li> Generieren Überlebenskurven (Abbildung 3B) als für jeden gut (oder replizieren Brunnen) gewünscht, indem die Fraktion (oder Prozent) der lebensfähigen Zellen als Funktion des Alters. </li><li> Berechnen Sie das Überleben Integral (SI) für jeden gut. SI ist als die Fläche unter der Kurve Überleben definiert und können durch die Formel abgeschätzt werden: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="Gleichung 3" width="400" height="79" /> wo Alter n ist das Alter-Punkt (zB 2, 4, 6, 9, 11 und 13) und s n ist das Überleben Wert in diesem Alter-Punkt. </li><li> Bestimmen Sie statistische Parameter replizieren Brunnen aus dem SI-und Überlebensdaten. Gemeinsamen statistischen Parameter von Interesse sind Mittelwert, Median, und die Varianz für jede Gruppe von biologischen repliziert. Ein t-Test oder ähnliche Analyse kann für paarweisen Vergleich der SI für verschiedene Versuchs-und Kontrollgruppen verwendet werden. Es kann auch wünschenswert sein, Überlebenskurven, wie in 4.8 von durchschnittlich biologischen Replikate beschrieben generieren. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse Nach Beendigung des Versuchs, haben Sie geplottet das Überleben Kurve und durchgeführt Datenanalyse ausreichen, um die chronologische Hautalterung Potenzial für verschiedene Stämme oder Bedingungen zu bestimmen. Wenn korrekt durchgeführt, sollte die Wachstumskurven von der Bioscreen C MBR Maschine erhalten ähnlich aussehen wie die in Abbildung 2 dargestellt und die daraus resultierenden Überlebenskurven sollten diese in Abbildung 3 dargestellt aussehen. Im Allgemeinen wird Wildtyp-Zellen unter den hier beschriebenen Bedingungen kultiviert eine mediane chronologischen Lebensdauer in der Größenordnung von 7 Tagen. Erhebliche Unterschiede in der Überlebensrate in verschiedene Stämme und unter bestimmten Bedingungen, wie Wachstum in 0,05% Glucose Medien beobachtet wird, kann mediane Überlebenszeit 30 Tage überschreitet. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Abbildung 1. Datenausgabe aus dem Bioscreen Programm &quot;EZExperiment&quot;. Spalte A zeigt die Uhrzeit an, einen Absorptionswert wurde. Sukzessive Säulen stellen die Vertiefungen der Honeycomb-Platte mit Zellen altern Kulturen entnommen geimpft. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> Abbildung 2. Outgrowth Kurven aus einer biologischen replizieren sich im Laufe eines Experiments. Es gibt eine deutliche Verschiebung in den Kurven über die Zeit als Zellen in der alternden Kultur zu verlieren Lebensfähigkeit. Die Länge der Zeit zwischen dem ersten Zeitpunkt (Tag 2) und einer sukzessiven Zeitpunkt bestimmt Lebensfähigkeit zu diesem bestimmten Alter. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> Abbildung 3. A) Ein Überleben Kurve erzeugt mit der Folge von Daten aus Abbildung 1. Der Tag 2 Zeitpunkt wird als 100% Lebensfähigkeit Punkt zu setzen. B) Final Überlebenskurven der beiden Stämme in das gleiche Experiment getestet. Diese Überlebenskurven repräsentieren die durchschnittliche Bewohnbarkeit von drei biologischen Wiederholungen für jede Anstrengung. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung innerhalb biologischer repliziert. Die schraffierte Fläche unter der Kurve stellt das Überleben des Überlebens Integral (SI) für DMS 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tabelle 1. Synthetische definierten Mediums für chronologischer Alterung Studien verwendet (Stamm background BY4743) </td></tr><tr><td> Komponente </td><td> Konzentration (g / L) </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Hefestickstoffbase (-AA/AS) </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Asparaginsäure </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Glutaminsäure </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> L-Lysin </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Phenylalanin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Serin </td><td> 0,375 </td></tr><tr><td> L-Threonin </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> L-Tryptophan </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 0,1 </td></tr></tbody></table> Hinweis: Dieses Rezept macht Auxotrophien in diploiden BY4743 Belastung. Aminosäure Auxotrophien sollte, indem ein 5fach-Endkonzentration der synthetischen Vollmedium kompensiert werden.

<ol>
	<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).</li><li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast.">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).</li><li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).</li></ol>

Die High-Throughput-chronologische Lebensspanne beschriebene Assay ist hier eine effektive Methode zur Quantifizierung der Alterungspotential einer großen Zahl von Stämmen mit hoher Genauigkeit und Präzision. Der primäre Voraus dieser Methode gegenüber klassischen Methoden zur Bestimmung der Überlebenszeit durch Zählen Kolonie-bildenden Einheiten (siehe z. B. 3) ist die Verwendung eines Shakers / Inkubator / Platte Lesegerät wie dem Bioscreen C MBR-Maschine mit hoher Auflösung Wachstumskurven bei erh...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacto Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>288620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.</td>
<td>Reagent</td>
<td>MidSci</td>
<td>J630-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum</td>
<td>AM185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>D16-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen C MBR machine</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>5101370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen 100-well Honeycomb plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>9502550</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells

Die Bierhefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Hat sich als wichtiger Modellorganismus auf dem Gebiet der Alternsforschung werden<sup&gt; 1</sup&gt;. Die replikativen und chronologische Lebensspanne gibt zwei etablierte Paradigmen zur Untersuchung Altern in Hefe. Replikativen Altern ist wie die Zahl der Tochterzellen einer Hefe Mutter Zelle produziert, bevor Seneszenz definiert; chronologischer Alterung wird durch die Länge der Zeit-Zellen definiert werden kann in einer nicht-teilenden, Ruhe-ähnlichen Zustand zu überleben<sup&gt; 2</sup&gt;. Wir haben einen High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Messung des zeitlichen Lebensdauer entwickelt. Dieses Verfahren beinhaltet Alterung der Zellen in einem definierten Medium unter Rühren und bei konstanter Temperatur. An jedem Alter-Punkt, ist ein Sub-Population von Zellen aus der Alterung der Kultur entnommen und geimpft in Rich-Wachstumsmedium. Ein hochauflösendes Wachstumskurve wird dann für diese Subpopulation von gealterten Zellen mit einem Bioscreen C MBR-Maschine erhalten. Ein Algorithmus wird dann angewendet, um den relativen Anteil der lebenden Zellen in den einzelnen Sub-Population auf die Wachstumskinetik in jedem Alter-Punkt zu ermitteln. Diese Methode erfordert wesentlich weniger Zeit und Ressourcen im Vergleich zu anderen chronologischen Lebensdauer Assays unter Beibehaltung Reproduzierbarkeit und Präzision. Die High-Throughput-Natur dieses Tests sollte für eine groß angelegte genetische und chemische Bildschirme ermöglichen es, neue Langlebigkeit Modifikatoren für weitere Tests in immer komplexeren Organismen zu identifizieren.

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Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Chronologischer Alterung in Hefe bezieht sich auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit in der stationären Phase assoziiert. Hier beschreiben wir eine High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Bestimmung Hefe chronologische Lebensspanne.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Aufrufe.  University of Washington. Chronologischer Alterung in Hefe bezieht sich auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit in der stationären Phase assoziiert. Hier beschreiben wir eine High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Bestimmung Hefe chronologische Lebensspanne.

Serie: Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Ein schnelles Verfahren für die Visualisierung von Live-immobilisierten Hefezellen

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Forschung

Biologie

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.