Nous remercions S. Robertson Jinks et E. Heidenreich pour fournir des plasmides et des souches de levure; P. Pham et MF Goodman pour aider les withthe TLS dosage. Ce travail a été soutenu en partie par la Fédération américaine pour la recherche sur le vieillissement de subvention et par le NIH AG20642, AG025135.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Liquid cultures du vieillissement présentent parfois une repousse / phénotype haletant 13, ce qui complique l&#39;analyse CLS. La repousse se produit généralement lorsque plus de 90-99% de la population a perdu sa viabilité. Ce phénotype est souvent associé au stress oxydatif accru et / ou de protection a diminué dans la cellule. Par exemple, la fréquence de ce phénotype fait plus que doubler dans les cellules dépourvues superoxyde dismutase cytosolique et réduit considérablement dans la longue durée de vie des mutants (par exemple, ou sch9 Δ Δ RAS2) ou des mutants surexprimant superoxyde dismutase 22. En pratique, nous définissons la repousse comme une augmentation de la viabilité ou la stabilisation de la viabilité pour les trois prélèvements consécutifs dans la phase de forte mortalité au cours du vieillissement chronologique. Fonction de l&#39;âge des fréquences des mutations d&#39;ADN varient grandement en fonction du contexte de contrainte, la manipulation génétique, les conditions de culture, ainsi que la repousse / haletant et de survie extrêmement faible. Pré-essais devraient être effectués à des moments tels que la survie moyenne et maximale avec une densité de placage de divers essais sur la mutation de déterminer gamme de fréquence de mutation avant d&#39;échelle d&#39;analyse performingthe durée de vie complet. La souche de type sauvage doit toujours être inclus dans une durée de vie ou étudier la fréquence de mutation en parallèle à tout traitement ou mutants génétiques, telles que les inter-expérience-variations peuvent être comptabilisées. Plusieurs répliques biologiques devraient être inclus dans l&#39;étude, et, à la fois liquide et in situ la viabilité / mutation essais devraient être effectués pour corroborer les résultats. Au lieu de se concentrer sur un type particulier de mutation de l&#39;ADN, profilage d&#39;une instabilité génomique dépendant de l&#39;âge en utilisant des dosages multiples en combinaison, peuvent faire la lumière sur les dommages d&#39;ADN spécifiques et de système de réparation de l&#39;ADN des dommages (s) qui contribuent à l&#39;instabilité génomique âge-dépendante. Par exemple, une augmentation significative de la brute réarrangements chromosomiques (RME), comparés à ceux des mutations de l&#39;ADN d&#39;autres, est observé dans la levure de type sauvage suggérant une pause brin elevationof double et / ou une déficience des non-homologue fin (NHEJ) au cours de la levure vieillissement chronologique (tableau 2). Le spectre de la mutation CAN1 (séquençage du gène CAN1) obtenu dans la levure de vieillissement de type sauvage a suggéré une augmentation des dommages oxydatifs au cours du vieillissement chronologique et d&#39;erreurs réparation de l&#39;ADN, tandis que, à long vécu mutants Δ sch9, dommages à l&#39;ADN moins oxydatif et beaucoup plus réduite synthèse trans erreurs ont été observées 20. Les méthodes décrites ici peuvent être encore dépensés pour étudier l&#39;instabilité génomique âge-dépendante. Par exemple, les cellules au repos et non de repos peut être isolé de la levure en phase stationnaire des cultures en utilisant la méthode du gradient de densité décrite par Allen et al. 23. Combiné avec le test de mutation décrit ici, nous avons signalé qu&#39;une grande partie de la fonction de l&#39;âge découle de mutations des cellules quiescentes, plutôt que les diviser, les cellules endommagées ou apoptotiques 20,24.

studying age-dependent genomic instability using the s. cerevisiae chronological lifespan model

Les études utilisant le modèle Saccharomyces cerevisiae vieillissement ont découvert des voies durée de vie de régulation qui sont partiellement conservés chez les eucaryotes supérieurs 1-2. La simplicité et la puissance du modèle de la levure de vieillissement peuvent aussi être explorées pour étudier les dommages de l&#39;ADN et la maintenance du génome ainsi que leurs contributions à des maladies au cours du vieillissement. Ici, nous décrivons un système à l&#39;étude des mutations d&#39;ADN dépendante de l&#39;âge, y compris des substitutions de base, cadre-déplacement des mutations, des réarrangements chromosomiques brute, et homologue / homéologues recombinaison, ainsi que l&#39;activité réparation de l&#39;ADN nucléaire, en combinant la durée de vie de la levure chronologique avec l&#39;ADN simples dommages et des essais de mutation. Les méthodes décrites ici devraient faciliter l&#39;identification des gènes / voies qui régulent l&#39;instabilité génomique et les mécanismes qui sous-tendent mutations de l&#39;ADN dépendante de l&#39;âge et le cancer chez les mammifères.

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Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Nous décrivons ici un ensemble d&#39;essais sur la mutation d&#39;ADN qui peuvent être combinés avec le modèle de la levure chronologique durée de vie à étudier les gènes / voies de régulation ou de contribuer à l&#39;instabilité ADN génomique au cours du vieillissement.

Etudier Instabilité génomique fonction de l&#39;âge en utilisant les S. cerevisiae Modèle chronologique Lifespan

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

15.5K vues.  University of Southern California, Los Angeles. Nous décrivons ici un ensemble d'essais sur la mutation d'ADN qui peuvent être combinés avec le modèle de la levure chronologique durée de vie à étudier les gènes / voies de régulation ou de contribuer à l'instabilité ADN génomique au cours du vieillissement.