Wir möchten Laura Schippers zum Schreiben der ersten Versionen der Zelle Laden Protokoll und Marcus de Goffau und Guille Zampar für Scoring mitochondrialen Morphologie danken.

1. Produktion und Herstellung eines Silizium-Wafers Mold Mikrofluidik-Chips aus einem Silizium-Wafer Form durch weiche Lithographie erzeugt. Diese Wafer kann viele Male wiederverwendet werden, um Mikrofluidik-Chips produzieren. Es ist ratsam, dass die Produktion eines entsprechenden Wafer von einer Gruppe in der Mikrofluidik spezialisiert 6 durchgeführt wird. Der Wafer wird in einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung von Photolithographie zwei unterschiedliche Schichten mit negativer Photolack SU-8 7 hergestellt. Die untere Schicht wird verwendet, um die Zelle Fangebene (SU-8 2002, Höhe 3-4 um) zu erzeugen, während die Kanäle mit der Deckschicht (SU-8 2010, Höhe 10 um) hergestellt werden. Einen Eindruck von der Wafer-Produktion kann in Huang et al 8 gefunden werden. Die Zeichnungen der mikrofluidischen Chips können von den Autoren sowie Ratschläge, wie man einen entsprechenden Wafer erhalten erhalten werden. <ol><li> Sobald der Wafer erhalten, schneiden Sie ein Stück Tough-Tag into dünne Streifen von etwa 0,5 mm bis 3 mm mit einem Skalpell und legen Sie sie vorsichtig auf dem Wafer leicht auf der Oberseite des Kanals Struktur zwischen den Kanälen und dem Einlass microPad array (Abbildung 2A). Dies wird bei der Bildung einer großen zusätzlichen Kanal in jedem Chip, die nicht nur während Zellladung einsetzbar wäre, ist aber auch für den stabilen Betrieb der mikrofluidischen Vorrichtung wichtig. </li><li> Bedecken Sie den Glas Petrischale mit einer doppelten Schicht aus Aluminiumfolie und legte die Scheibe in der Petrischale. Die Aluminiumfolie wird PDMS von aktiv zwischen dem Wafer und der Petrischale zu verhindern. Wenn PDMS tut Kriechen zwischen dem Wafer und dem Glas Petrischale wird der Wafer fixiert werden dauerhaft in der Petrischale. Obwohl der Wafer noch verwendbar, wird es nicht möglich sein, die Glas-Petrischale ersetzen, wenn er bricht das PDMS müssen später heraus geschnitten werden. </li></ol> 2. Herstellung von Mikrofluidik-Chips <ol><li> Legen Sie eine leere PlastikflascheTasse auf die Waage stellen und tarieren. Gießen Sie 40 g PDMS Basis in den Plastikbecher (für eine 12 cm Durchmesser Glas Petrischale). In PDMS Härter mit einem Einweg-Pipette in aw / w-Verhältnis von 1:10, also etwa 4 ml. </li><li> Mischen Sie die PDMS und Härter gründlich mehrere Minuten. Dies kann mit Einweg-Kunststoff-Pipette, mit der das Härtungsmittel Pipette erfolgen. Es ist wichtig, dass das Gemisch gut vor dem Gießen auf der Oberseite des Wafers gemischt. Eine schlechte Vermischung bewirkt Teil des PDMS nicht polymerisieren. </li><li> Gießen Sie das PDMS auf der Oberseite des Wafers im Glas Petrischale. </li><li> Mischen von PDMS mit dem Härter wird Blasenbildung im PDMS-Gemisch führen. Diese Blasen müssen entfernt werden, bevor die PDMS polymerisiert werden. Die PDMS kann nach dem Gießen sie auf der Oberseite des Wafers, indem der Petrischale in einem Exsikkator mit einer Vakuumpumpe entgast werden. Mit diesem Setup, dauert es etwa 30 Minuten, um alle Luftblasen aus dem Gemisch zu entfernen. </li><li> Polymerisieren the PDMS, indem Sie die Petrischale mit dem Wafer auf einer Heizplatte bei 120 ° C für 1 Stunde und dann bei 65 ° C für eine weitere Stunde. </li><li> Entfernen Sie die Alufolie zusammen mit dem Wafer und polymerisiert PDMS aus dem Glas Petrischale. Peel off der Aluminiumfolie und der dünnen Schicht aus polymerisierten Rest PDMS von der Rückseite des Wafers. Die Schicht aus PDMS auf dem Wafer kann dann vom Wafer nach oben heraus sorgfältig abgetrennt werden. </li><li> Legen Sie die PDMS-Schicht auf den Kopf (mit den Kanälen nach oben) auf der Bank und schneiden Sie die Single-Chip-Designs auf der PDMS vorsichtig mit einem Skalpell aufgedruckt. Versuchen bis etwa 3 mm von PDMS an den Rändern der Kanäle zu halten, um die Befestigung des Chips auf dem Deckglas später zu verbessern. </li><li> Lochung in der PDMS an den Enden der Eingangs-, Ausgangs-und Seitenkanal (2A), indem Sie einen 20 Messgerät Luer Stub den ganzen Weg durch das PDMS in einer geraden Weise. </li></ol> Achten Sie darauf, die PDMS-Chipliegt noch kopfüber auf der Bank, während Stanzen der Löcher. Dies verhindert PDMS Kleben an der Innenseite des Kanals, die Blockierung des Kanals führen kann. <ol start="9"><li> Nach dem Stanzen jedes Loch, entfernen Sie die Spalte von PDMS in der Luer Stub mit einer Pinzette, bevor Sie die Stub wieder heraus. Die PDMS Spalte sonst bleiben hinter und blockieren die gerade gestanzte Loch. </li><li> Reinigen Sie die Oberflächen des Chips von Staubpartikeln und Rest PDMS indem Klebeband drauf und sofort Entfernen des Bandes wieder. Ebenso reinigen das Deckglas auf dem der Chip angebracht werden. </li><li> Platzieren Sie den Chip gereinigt und Deckglas unter der UV-Lampe der Benchtop UV-Ozon-Reiniger. Die Seiten, die miteinander verbunden werden sollen, müssen vor der Lampe. </li><li> Setzen Sie die PDMS und Deckglas dem UV-Licht für 6-8 min und direkt danach setzen Sie den Chip auf dem Deckglas, indem die freiliegenden Flächen auf der jeweils anderen. </li><li> Sanft um die Seiten des Chips tippenum die Befestigung des PDMS auf dem Deckglas zu fördern und mögliche Luftblasen zu entfernen. Nicht auf der Oberseite des Kanals Struktur tippen, da dies kann dazu führen, die micropads auf dem Deckglas angebracht sowie zu bekommen. </li><li> Legen Sie die neu gemacht mikrofluidischen Setup auf einer Heizplatte bei 100 ° C für 60 min. Testen Sie die Stärke der Bindung zwischen dem Deckglas und PDMS-Chip, indem Sie versuchen, heben die Kanten des PDMS-Chip leicht. Wenn der PDMS-Block nicht aus der Glasoberfläche angehoben werden, ist die Verbindung erfolgreich und der Chip ist betriebsbereit. </li></ol> 3. Vorbereiten der Chip für Handy geladen Der Ausfall einer Mikrofluidik-Vorrichtung kann somit zu Leckage von Medium in das Mikroskop. Um dies zu vermeiden, ist es, um eine beratende Halter aus Metall zu verwenden und / oder dichten die Seiten des Chips, wo die PDMS erfüllt das Glas mit Nagellack oder Epoxid-Kleber. Dies verhindert das Auslaufen des Mediums bei der PDMS-Chip ist nicht gut genug, um das Deckglas geklebt. Auch die SchläucheVerbindungen kann um die Ansatzstellen in ähnlicher Weise befestigt werden, um eine Leckage von Medium zu vermeiden. Ein hausgemachtes Wasser-Sensor, schaltet die Spritzenpumpe im Falle einer Leckage kann als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme verwendet werden. Zeichnungen der Halter aus Metall speziell für die Mikrofluidik-Chip konstruiert sind den Autoren erhalten werden. <ol><li> Platzieren des mikrofluidischen Chips in dem Metall-Halter, mit Silikon-Gel zwischen dem Glas des Chips und den Metallteilen der Halterung, um eine wasserdichte Abdichtung zu schaffen. Schrauben Sie die Muttern vorsichtig, damit das Glas nicht brechen. </li><li> Verbinden dünne Röhren (ca. 5-15 cm lang) auf dem Seitenkanal und dem Auslasskanal des Chips. Die Verwendung einer Pinzette erleichtert, um den Schlauch in die gestanzten Löcher einzufügen. </li><li> Füllen Sie eine 50 ml Spritze Luer-Lok mit Kulturmedium, entfernen Sie die Luft aus der Spritze und verbinden Sie es nacheinander mit einer Spritze Filter, einem 20 Spur Luer Stummel, einen kurzen dicken Schlauch (ca. 2 cm lang) und einen dünnen Schlauch. Stellen Sie sicher, dass die dünne Wannee ist lang genug, um den Abstand zwischen der Spritzenpumpe und dem Mikroskoptisch erstrecken. </li><li> Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe, schneller Vorlauf, bis die Pumpe den dünnen Schlauch vollständig mit Medium gefüllt ist. </li><li> Schieben Sie den dünnen Schlauch mit der Spritze in den Einlasskanal des Chips und lassen Sie das Medium durch den Chip bei 10 ml / min (Abbildung 2B). Sammeln Sie das Medium verlässt den Chip (zB in einer Petrischale). Das Medium zur Neige gehen über den Seitenkanal wegen des Widerstandes zwischen der Tough-Tag groß gemacht Seitenkanal und den Auslasskanal. </li><li> Platzieren Sie den Chip im Mikroskop Bühne und den Fokus des Mikroskops auf den Pads. </li></ol> Die Verwendung von Ölimmersionsobjektive wird über die von Wasser Immersionsobjektive bevorzugt, weil das Öl nicht austrocknet über den zeitlichen Verlauf des Experiments. Abhängig von der Mikroskop könnte es Probleme mit der Beibehaltung der focus in den ersten Stunden des Experiments. Es ist daher ratsam, den Chip für ein bis zwei Stunden in dem Mikroskop Bühne zu verlassen, damit es zu begleichen können sich vor dem Laden Zellen und Beginn des Experiments. 4. Laden von Hefezellen in der Mikrofluidik-Chip <ol><li> Schließen Sie ein 5 ml Luer Spritze zu einer 20 Spur Luer Stub und einem dicken Rohr (ca. 3 cm). </li><li> Nehmen einer Probe von der Zellkultur in den Chip geladen. </li></ol> Die bevorzugte Zellzahl für die Beladung zwischen 1-5 x 10 6 Zellen pro ml. Kulturen mit höheren Zellzahlen müssen vor der Beladung verdünnt werden. Wenn Kultivierung von Zellen auf YPD können Zellenbelastung verbessert viele-fach werden, wenn die Zellen zunächst mit gewaschen und erneut in Minimalmedium mit Glucose einen ähnlichen Prozentsatz vor dem Laden. Während des Betriebs des Chips kann YPD-Medium wieder sicher verwendet werden. <ol start="3"><li> Legen etwa 1 ml der Zellsuspension in the Spritze und entfernen Sie die Luft aus der Spritze. </li><li> Verringern Sie die Flussrate der Spritzenpumpe bis 0,5 ml / min. Die niedrigen und kontinuierlichen Fluss von der Spritzenpumpe während des Ladens (in Schritt 4.5) durchgesetzt wird Push fraktionslosen Zellen erfolgt über den Seitenkanal (Abbildung 2C). </li><li> Die Spritze mit der Zellsuspension in das Rohr des Auslasskanals. Laden der Zellen durch Drücken auf den Kolben der Spritze vorsichtig. Beachten Sie die Zellen, die in und Abrechnung unter den micropads über die Augen oder über den Computer-Bildschirm. </li><li> Behalten Sie den Druck auf den Kolben, bis genügend Zellen unter den Pads zu begleichen. Die optimale Belastung 1-3 Zellen pro Pad. Als Zellen unter den Pads zufällig zu regeln, ist es durchaus üblich, dass ein paar Pads enthalten keine Zellen und andere Polster vollständig mit Zellen gefüllt. </li><li> Trennen Sie die Spritze für die Zell-Beladung und dem dicken Schlauch verbunden, um sie von der dünnen Schlauch des Auslasskanal verwendet, spülen Sie die Seite channel für ein paar Minuten bei höheren Flussraten (10 ul / min), um Luftblasen zu entfernen und / oder Zellen, die noch nicht verlassen den Chip (2B). Wenn Zellen, die nicht von der Seite-Kanal entfernt sind, können sie beginnen, in dem Seitenkanal wachsen und stören das Experiment später. </li><li> Setzen Sie den Fluss von der Spritzenpumpe wieder auf 0,5 ml / min und schließen Sie den Seitenkanal durch den Anschluss an einen dicken Schlauch (ca. 5 cm lang) mit einem Katheter Stecker an seinem Ende (2D). </li><li> Erhöhen Sie die Durchflussmenge zu einer endgültigen Flussrate von 1-5 ml / min. Durchflussmengen je nach Medium und Hefestamm. </li><li> Starten Sie einen Film mit dem Mikroskop und Kamera-Einstellungen für das Ziel des Experiments. Stellen Sie sicher, dass die Geschwindigkeit des Mikroskops auf einen so niedrigen Geschwindigkeit, daß das Öl folgen ist. Für die Bestimmung der replikativen Lebensspanne, Bild-Zellen alle 10 min. Um Zellen aus den winzigen Mengen von UV-Licht durch die Halogen emittiert schützenLampe, die während DIC Übernahme verwendet wird, empfiehlt es sich, einen zusätzlichen UV-Filter in den Strahlengang zu platzieren. Bei der Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, ist es bevorzugt, Bild der Zellen weniger häufig (zB alle 20 Minuten) phototoxische Wirkungen zu vermeiden. Das Experiment wird beendet, wenn alle Zellen zu Beginn des Experiments geladen tot, die unter normalen Bedingungen dauert bis zu 5 Tagen. Es wird empfohlen, regelmäßig zu überprüfen, den Fokus der Bilder während des Experiments und gegebenenfalls einstellen. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die mikrofluidischen hier beschriebene Methode ist ein wichtiges Werkzeug in Roman Altersforschung, wie es einfache und automatisierte Erzeugung von Hefe replikativen Lebensspanne Daten in Kombination mit kontinuierlichen hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Diese Attribute sind wesentliche Verbesserungen gegenüber den experimentellen Möglichkeiten der klassischen Dissektion Methode, aber es gibt ein paar Einschränkungen der Methode, die berücksichtigt werden müssen. Beachten Sie, da...

Bäckerhefe ist ein wichtiger Modellorganismus für Alternsforschung 1. Bis vor kurzem Studium replikativen Alterung in Hefezellen ein aufwändiger Prozess erfordern eine Dissektion Verfahren, in dem jeder Keim wurde manuell aus der Mutterzelle 2,3 entfernt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir vor kurzem einen neuen mikrofluidischen Einrichtung der Lage, einzelne Zellen Mutter während ihrer gesamten Lebensdauer 4 verfolgen. In unserem mikrofluidischen Chips werden Hefezellen unter weichen Elastomer-basierte micropads gefangen (siehe Abbildung 1). Ein kontinuierlicher Strom des Mediums wäscht neu gebildeten Tochterzellen und stellt die Zellen mit frischen Nährstoffen. In einem einzigen Experiment, kann bis zu 50 Mutter-Zellen in einem vollautomatisch während ihrer gesamten Lebensdauer replikativen überwacht werden. Bedingt durch die hervorragenden optischen Eigenschaften des mikrofluidischen Chips, ist es möglich, gleichzeitig zu überwachen verschiedenen Aspekte der Hefezelle biology (zB </em&gt; mit fluoreszierenden Proteinen). Im Vergleich zu den klassischen Dissektionsverfahren stellt die mikrofluidischen Einrichtung wesentliche Vorteile. Er sorgt für einen definierten und konstanten Umwelt während des gesamten Experiments Alterung. Es erfordert keine teure Spezialausrüstung und kann auf jedem Mikroskop mit automatischer Fokussierung und Zeitraffer-Fähigkeiten sowie Temperatur-Kontrolle zur Zellkultivierung ausgestattet ausgeführt werden. Die Produktion und den Betrieb der mikrofluidischen Chips können in wenigen Tagen erlernt werden. Darüber hinaus können die Zellen direkt aus einer exponentiell wachsenden Kultur, ein Vorteil gegenüber anderen kürzlich veröffentlichten mikrofluidischen Verfahren 5, die Biotinylierung Mutter Zellen erfordert geladen werden. Kombiniert mit einer hochauflösenden Bildgebung, die hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, um graduelle Veränderungen zu messen in zelluläre Morphologie, Alterung Protein Expression und Lokalisation während Hefe in beispielloser Weise. Die Fähigkeit,Langzeit-Monitoring von Einzelzellen bietet auch einzigartige Möglichkeiten für Hefe-Zellzyklus-Studien. a Diese Methode wurde kürzlich optimiert, um die Biotinylierung von dem Protokoll 16, die veröffentlicht, während dieses Manuskript war in Bewertung wurde entfernen.

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 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

Wir zeigen die Verwendung eines einfachen mikrofluidischen Einrichtung, in der einzelne Hefe-Zellen über die gesamte Lebensdauer verfolgt werden kann. Die Mikrofluidik-Chip nutzt die Größenunterschied zwischen Mutter und Tochter-Zellen mit einer Reihe von micropads. Bei Belastung werden die Zellen unter diesen micropads eingeschlossen, weil der Abstand zwischen der microPad und Deckglas ist ähnlich dem Durchmesser einer Hefezelle (3-4 um). Nach dem Ladevorgang wird Kulturmedium kontinuierlich durch den Chip, der nicht nur eine konstante und definierte Umwelt während des gesamten Experiments gespült, sondern auch spült den Schwellenländern Tochterzellen, die nicht unter den Pads aufgrund ihrer geringeren Größe zurückgehalten werden. Der Aufbau behält Mutter Zellen so effizient, dass in einem einzigen Experiment bis zu 50 einzelne Zellen in einer vollautomatisch während 5 Tagen überwacht werden oder, falls erforderlich, länger. Darüber hinaus ermöglichen die hervorragenden optischen Eigenschaften des Chips hoherAuflösung Bildgebung von Zellen während des gesamten Alterungsprozess.

In diesem Protokoll werden die Zellen in dem mikrofluidischen Chip direkt vom mittleren exponentiellen Kultur geladen. Um festzustellen, ob die Altersverteilung der Zellen in der mikrofluidischen Chips gefangen ähnlich wie der Kultur vor dem Beladen wurden die Zellen mit Weizen agglutinin konjugiert FITC (WGA-FITC) zu visualisieren Sprossnarben gefärbt. Wie in 3 zu sehen ist, ist der Einschluß von Zellen unter den micropads des mikrofluidischen Chips nicht an Zellen eines bestimmten Alters vorgespann...

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Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K Aufrufe.  University of Groningen. Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.

Serie: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Die richtige Positionierung und Zurückhaltung einer Ratte Hind Extremität für fokussierte hochauflösende Bildgebung von Knochen-Mikroarchitektur mit In Vivo Mikro-Computertomographie

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Hochauflösende 3D Bildgebung des menschlichen Bauchspeicheldrüse Neuro-insularen Netzwerks

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

Hochauflösende Musterung mit zwei Modi der Electrohydrodynamic Jet: Drop-on-Demand und Nahfeld-Elektrospinnen

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Hochauflösende gemustert Biofilm Abscheidung mittels pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...