Die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie ist die Methode zur strukturierten Bestimmung von Makromolekülen bei nahezu atomarer Auflösung. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnungen stehen mehrere Softwarepakete zur Verfügung, doch das Ergebnis auf 3D-Karten variiert oft in Qualität und Auflösung aufgrund der Unterschiede in den Algorithmen, die bei Berechnungen angewendet werden. Daher ist die Verwendung einer Kombination verschiedener Programme oft von Vorteil, um die optimalen Ergebnisse zu erzielen.
Dieses Protokoll führt Benutzer durch die Navigation im Workflow über drei verschiedene Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen: CryoSPARC, RELION und Scipion. Wir werden zeigen, wie man diese Pipeline nutzen kann, um eine hochauflösende Struktur des Adeno-assoziierten Virus zu erhalten, das ein weit verbreiteter Vektor für die Gentherapie ist. Nachdem Sie CryoSPARC v3 in einem Webbrowser geöffnet und den Arbeitsbereich für das Projekt erstellt haben, navigieren Sie zum neuen Arbeitsbereich und öffnen Sie den Job Builder im rechten Bereich.
Klicken Sie auf Filme importieren und geben Sie den Filmpfad und den Referenzdateipfad an. Legen Sie dann die Erfassungsparameter fest. Klicken Sie anschließend auf Warteschlange, wählen Sie eine Lane zum Ausführen des Auftrags und einen Arbeitsbereich aus und klicken Sie auf Erstellen.
Öffnen Sie die Patch-Bewegungskorrektur und die Auftragskarte zum Importieren von Filmen. Ziehen Sie dann die imported_movies Ausgabe auf den Filmplatzhalter des neuen Auftrags und stellen Sie den Auftrag in eine Warteschlange. Um die Kontrastübertragungsfunktion oder die CTF-Schätzung durchzuführen, öffnen Sie die Patch-CTF-Schätzung.
Geben Sie die generierten Mikroaufnahmen ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Um die gemittelten und CTF-korrigierten Mikroaufnahmen zu überprüfen und eine Teilmenge für die weitere Verarbeitung auszuwählen, öffnen Sie die kuratierten Belichtungen, geben Sie die aus dem vorherigen Schritt erhaltenen Belichtungen ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Nachdem der Job in den Wartemodus gewechselt ist, klicken Sie auf die interaktive Registerkarte auf der Jobkarte.
Passen Sie die Parameterschwellenwerte an und akzeptieren oder lehnen Sie einzelne Mikroaufnahmen zur weiteren Bearbeitung ab. Legen Sie bei der Verarbeitung der aktuellen Daten die obere Schwelle des Astigmatismus auf 400 Angström, die CTF-Anpassungsauflösung auf fünf Angström und die relative Eisdicke auf zwei fest. Klicken Sie dann auf Fertig, um die Mikroaufnahmen für die nachgelagerte Verarbeitung auszuwählen.
Öffnen Sie für die manuelle Kommissionierung die manuelle Kommissionierung. Geben Sie die akzeptierten Belichtungen ein und stellen Sie den Auftrag in eine Warteschlange. Klicken Sie dann auf die interaktive Registerkarte, stellen Sie die Boxgröße auf 300 Pixel ein und klicken Sie auf einige hundert Partikel in mehreren Mikroaufnahmen, um überlappende Partikel zu vermeiden.
Wenn Sie mit der Auswahl fertig sind, klicken Sie auf Fertig beim Auswählen der Extraktpartikel. Um Vorlagen für die automatisierte Partikelkommissionierung zu erstellen, klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie die generierten Partikelpicks ein. Ändern Sie dann die Anzahl der 2D-Klassen in 10 und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
Öffnen Sie als Nächstes ausgewählte 2D-Klassen und geben Sie die im vorherigen Schritt erhaltenen Partikel und Klassendurchschnitte ein. Klicken Sie dann auf die interaktive Registerkarte, wählen Sie repräsentative 2D-Klassen mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis aus und klicken Sie auf Fertig. Für die vorlagenbasierte Partikelauswahl öffnen Sie die Vorlagenauswahl und geben Sie die ausgewählten 2D-Klassen und Mikroaufnahmen ein.
Stellen Sie dann den Partikeldurchmesser auf 220 Angström ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Öffnen Sie schließlich den Auszug aus den Mikroaufnahmen und geben Sie die Mikroaufnahmen und Partikel ein, die aus der Inspektion von Partikelpickern gewonnen wurden. Legen Sie dann die extrahierte Boxgröße auf 300 Pixel fest und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
Für die 2D-Klassifizierung klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie die extrahierten Partikel ein. Legen Sie dann die Anzahl der 2D-Klassen auf 50 fest und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Öffnen Sie als Nächstes ausgewählte 2D-Klassen und geben Sie die erhaltenen Partikel und Klassendurchschnitte ein.
Klicken Sie auf die interaktive Registerkarte. Wählen Sie 2D-Klassen basierend auf der Auflösung und der Anzahl der Partikel in der Klasse und klicken Sie auf Fertig. Um ein anfängliches 3D-Volumen zu erzeugen, öffnen Sie die ab-initio-Rekonstruktion und geben Sie die Partikel aus der endgültigen 2D-Klassifizierung ein.
Passen Sie dann die Symmetrie an die Ikosaeder an und stellen Sie den Job in die Warteschlange. Als nächstes öffnen Sie die homogene Verfeinerung, geben Sie das Volumen aus dem vorherigen Schritt und Partikel aus der endgültigen 2D-Klassifizierung ein. Ändern Sie dann die Symmetrie und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.
Wenn der Auftrag abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Fourier-Schalenkorrelation oder die FSC-Kurve und laden Sie das Volume herunter, um es in UCSF Chimera zu untersuchen. Öffnen Sie in CryoSPARC v3 die Jobkarte des ausgewählten 2D-Klassenauftrags aus der endgültigen 2D-Klassifizierung. Klicken Sie dann auf der Registerkarte Details auf Auftrag exportieren.
Konvertieren Sie mit PyEM die particles_exported. CS-Datei durch Ausführen des angegebenen Befehls in das Sternformat. Nachdem Sie auf Partikelextraktion geklickt haben, geben Sie auf der Registerkarte I / O die CTF-korrigierten Mikroaufnahmen und Koordinaten ein.
Klicken Sie dann auf die Registerkarte Extrahieren, ändern Sie die Partikelfeldgröße auf 300 Pixel und führen Sie den Auftrag aus. Verwenden Sie für die 3D-Verfeinerung die in CryoSPARC v3 generierte Karte als erstes Modell in RELION-3. Wählen Sie die Importmethode aus und legen Sie die angegebenen Parameter auf der Registerkarte E/A fest.
Wählen Sie dann auf der Registerkarte Andere die CryoSPARC v3-Karte als Eingabedatei aus, ändern Sie den Knotentyp in 3D-Referenz und führen Sie den Auftrag aus. Wählen Sie als Nächstes die automatische 3D-Verfeinerung aus, und legen Sie auf der Registerkarte E/A Eingabebilder als Partikel fest. Stern-Datei aus dem letzten Auswahlauftrag.
Verwenden Sie die CryoSPARC v3-Rekonstruktion als Referenzkarte, klicken Sie auf die Registerkarte Referenz und ändern Sie den anfänglichen Tiefpassfilter auf 50 Angström und die Symmetrie auf Ikosaeder. Ändern Sie dann auf der Registerkarte Optimierung den Maskendurchmesser in 280 Angström, und führen Sie den Auftrag aus. Für die Nachbearbeitung klicken Sie auf Nachbearbeitung.
Geben Sie auf der Registerkarte E/A die erstellten Halbkarten und die Maske ein und stellen Sie die kalibrierte Pixelgröße auf 1,045 Angström ein. Geben Sie dann auf der Registerkarte "Schärfen" für die automatische Schätzung des B-Faktors ja ein. Für die niedrigste Auflösung für die Auto-B-Anpassung geben Sie 10 ein.
Und für die Verwendung Ihres eigenen B-Faktors, Eingabe-Nr. Legen Sie schließlich auf der Registerkarte Filter die Option FSC-Gewichtung überspringen auf no fest, und führen Sie den Auftrag aus. Öffnen Sie für das Poliertraining das Bayessche Polieren.
Geben Sie auf der Registerkarte E/A die bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen, Partikel und PostProcess ein. STAR-Datei zuvor erhalten. Klicken Sie auf die Registerkarte Training und setzen Sie die optimalen Parameter des Trainings auf ja, den Anteil der Fourier-Pixel zum Testen auf 0,5 und verwenden Sie diese vielen Partikel auf 5.000.
Führen Sie dann den Auftrag aus. Wenn der Schulungsauftrag abgeschlossen ist, klicken Sie auf Bayes'sches Polieren. Legen Sie dann auf der Registerkarte Training die optimalen Parameter des Trainings auf no fest.
Wählen Sie die Registerkarte Politur und geben Sie unter Optimierte Parameterdatei den Pfad zum opt_params_all_groups an. txt-Datei aus dem vorherigen Schritt und klicken Sie auf Ausführen. Um Aberrationen höherer Ordnung zu schätzen, öffnen Sie die CTF-Verfeinerung.
Wählen Sie auf der Registerkarte E/A unter Partikel den Pfad zur Sterndatei aus, die polierte Partikel aus dem kürzlich verfeinerten 3D-Auftrag enthält. Legen Sie dann unter STAR-Datei nach der Verarbeitung den Pfad zur Ausgabe des letzten Nachbearbeitungsauftrags fest. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Anpassung und legen Sie die anisotrope Vergrößerung schätzen auf Nein fest.
CTF-Parameteranpassung an Nr. Schätzen Sie die Strahlneigung auf ja. Schätzen Sie auch Kleeblatt auf ja.
Und schätzen Sie Aberrationen vierter Ordnung auf ja. Führen Sie dann den Auftrag aus. Um die RELION-3-Karte weiter zu verfeinern und zu validieren, starten Sie Scipion 3 und erstellen Sie ein neues Projekt.
Wählen Sie im linken Protokollbereich das Dropdown-Menü Importe aus und klicken Sie auf Partikel importieren. Ändern Sie die Parameter import von in RELION-3 und star file in postprocess.star. Geben Sie dann die Erfassungsparameter wie zuvor gezeigt an und klicken Sie auf Ausführen.
Klicken Sie anschließend auf das Dropdown-Menü Importe und wählen Sie Importvolumes aus. Geben Sie unter Importieren von den Pfad zur RELION-3-Karte ein, ändern Sie die Abtastrate der Pixelgröße auf 1,045 Angström pro Pixel und führen Sie sie aus. Um eine globale Ausrichtung durchzuführen, wählen Sie das Dropdown-Menü "Verfeinern" aus dem Protokollbereich und klicken Sie auf xmipp3-highres.
Geben Sie die importierten Partikel und Volumina aus den vorherigen Schritten als Bilder in voller Größe bzw. Anfangsvolumina ein und setzen Sie die Symmetriegruppe auf ikosaedrisch. Wählen Sie dann auf der Registerkarte Bildausrichtung unter Winkelzuweisung die Option global aus, legen Sie die maximale Zielauflösung auf drei Angström fest und führen Sie den Auftrag aus. Um eine lokale Ausrichtung durchzuführen, wählen Sie xmipp3-highres global aus, ändern Sie continue from previous run in yes und wählen Sie den vorherigen Job aus.
Ändern Sie dann auf der Registerkarte Winkelzuweisung die Bildausrichtung auf lokal und legen Sie die maximale Zielauflösung auf 2,1 Angström fest. Klicken Sie nach Abschluss des Vorgangs im Fenster xmipp3-highres-Ergebnisse auf Diagramme mit Bildschirmauflösung, um zu sehen, wie sich der FSC nach der Verfeinerung geändert hat, und klicken Sie auf Plot-Histogramm mit Winkeländerungen, um zu sehen, ob sich die Euler-Winkelzuweisungen geändert haben. Überprüfen Sie das Volumen in UCSF Chimera.
Zoomen Sie hinein und suchen Sie nach hochauflösenden Funktionen. Mikroaufnahmen mit guter CTF-Passform und niedrigem Astigmatismus wurden für die weitere Verarbeitung ausgewählt, während solche mit hohem Astigmatismus und Forfait verworfen wurden. Mittelwerte der 2D-Klasse mit genau definierten Klassen wurden ausgewählt, und solche mit niedriger Auflösung, Rauschen und partiellen Partikeln wurden abgelehnt.
Hier sind Bereiche der Kryo-Elektronenmikroskopie-Karte mit atomaren Koordinaten eines adeno-assoziierten Virus dargestellt. Gut definierte EM-Dichten ermöglichen die Anpassung von Seitenketten einzelner Aminosäuren, Wassermoleküle und Magnesiumionen. FSC-Kurven, die mit CryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion berechnet wurden, zeigen eine zunehmende Auflösung im gesamten Workflow, Auflösungsschätzungen in vier verschiedenen Schichten durch die Strukturen und Auflösungshistogramme zeigen die inkrementelle Verbesserung der lokalen Auflösung zwischen den Karten während des gesamten Workflows.
Die Kombination von Kryo-EM-Verarbeitungsalgorithmen von CryoSPARC, RELION-3, Scipion und Phoenix führte zu einer Auflösungserhöhung der adenoassoziierten Virusstrukturen von 2,9 auf 2,3 Angström in der gesamten Verarbeitungspipeline. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die in jedem Schritt angegebenen Parameter von Proben und Mikroskopen abhängig sind. Darüber hinaus hängt die Fähigkeit, eine hohe Auflösung zu erreichen, stark von der Qualität der Probe und der Rohdaten ab.
In diesem Video stellen wir den robusten SP-Workflow zur Verarbeitung von Kryo-EM-Daten über verschiedene Softwareplattformen hinweg vor. Mit diesem Ansatz kann man Algorithmen für mehrere Programme implementieren, um Kryostrukturen zu verfeinern und zu validieren. Dieser Workflow kann auf Strukturberechnungen einer Vielzahl von makromolekularen Anordnungen angewendet werden.
