Die Autoren möchten sich die Kinder und Erwachsenen Plasmaspendern und das Personal an der Papua-Neuguinea-Institut für Medizinische Forschung anzuerkennen. Die Autoren bedanken sich bei Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny Wilson W, Ivo Müller und Diana S Hansen für ihren Beitrag zur Entwicklung dieser Technik zu danken, und ich danke den australischen Rotes Kreuz für Blut und Serum-Packs. Diese Arbeit über viktorianische Staatsregierung Operational Support der Infrastruktur und der australischen Regierung NHMRC IRIISS ermöglicht. Diese Arbeit wurde vom National Health and Medical Research Council gewährt # 1031212 und # 637406 und National Institutes of Health Zuschuss # AI089686.

Hinweis: Alle Schritte außer Zentrifugation und Durchflusszytometrie, sollte in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt werden, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Achten Sie darauf, die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen zum Umgang mit menschlichen Proben entnommen. Der Test ist sehr empfindlich für kleine Mengen von Plasma. Die zur Verfügung gestellten Verdünnungen sind optimal für die Lösung Antworten reichen von 5 bis 78% mit Plasma von semi-immunen Kinder aus Papua-Neuguinea (PNG). Die optimale Verdünnung kann mit Plasma-Geräten getestet variieren, und es wird daher empfohlen, dass Plasma titriert werden, um Versuchsbedingungen für die jeweilige Anwendung zu bestimmen. Sicherstellen, dass die Aufnahme von 2 negativen Kontrollen THP-1-Zellen mit Merozoiten in Abwesenheit von Plasma; und THP-1-Zellen mit Merozoiten opsonisiertes mit einem Pool von Plasma von Malaria naive Individuen. Dies wird Steuerung für merozoite Einhaltung THP-1-Zellen zu ermöglichen und strenge Durchflusszytometrie Gating der Phagozytose Veranstaltungen zu ermöglichen. Die Verwendung von Plasmaproben war PNGvon der Medical Research Advisory Committee, Papua-Neuguinea Ministerium für Gesundheit, der Walter und Eliza Hall-Institut Human Research Ethics Committee (Projektnummer 04/04) zugelassen. Die schriftliche Einwilligung wurde von den Eltern / Erziehungsberechtigten der Teilnehmer erhalten. 1. THP-1-Kultur <ol><li> Aufrechterhaltung der menschlichen monozytären Zelllinie THP-1 in RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 55 uM 2-mercapthoethanol (THP-1-Medium) ergänzt und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li><li> Aufrechterhaltung Zellen mit einer Dichte von weniger als 5 x 10 5 Zellen / ml. HINWEIS: Überwucherung in Differenzierung in adhärenten Zellen und Down-Regulation von Fc-Rezeptoren führen. Sobald Zellen haben etwa 10 mal passagiert worden ist, tauen ein neues Fläschchen Zell-Phänotyp zu erhalten. </li></ol> 2. Antikörper Probenvorbereitung und Verdünnung <ol><li> Hitze inaktivieren Plasma durch Inkubation bei 56 ° getestet und Malaria-naiven Kontrollplasma, C für 30 min </li><li> Seriell verdünnten Plasmaproben auf 1/2, 000 in THP-1 Medium. </li><li> Speicher verdünnte Plasma bei -20 ° C </li></ol> 3. Kultur der Hoch Synchronisierte P. falciparum HINWEIS: Die GFP-exprimierenden Parasiten Linie D10-PfPHG 27 wurde aufgrund seiner 48 Stunden-Lebenszyklus, die eine Synchronisation von Parasiten und die Zeitkontrolle bei E64 zusätzlich unterstützt eingesetzt. Darüber hinaus, weil diese Linie drückt GFP im Zytosol, diese Linie ermöglicht den Nachweis von Parasitämie und frei von Merozoiten durchflusszytometrischen Nachweis von GFP. Jedoch ist die GFP-Fluoreszenzintensität nicht ausreicht, um die Visualisierung in THP-1-Zellen zu schaffen, und daher werden Merozoiten mit Ethidiumbromid (EtBr) gegengefärbt. Andere Parasitenstämme können verwendet werden, vorausgesetzt, dass die enge Synchronisation erreichbar. Synchronisieren Parasiten mit einer Kombination von Sorbit Behandlung zu reifen Formen 28 und Heparin lysieren Invasion 15 hemmen </sbis&gt;. <ol><li> Pflegen P. falciparum-Parasiten in O + menschlichen Erythrozyten (RBC) in 3% Hämatokrit in RPMI-1640-Medium (pH 7,4) mit 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml Hypoxanthin, 10% gepooltem Humanserum, 2 mg / ml Natriumbicarbonat ergänzt, und 20 ug / ml Gentamycin (Parasite Medium). Mit 5 mg / ml Blasticidin S-Hydrochlorid zu dem Kulturmedium, das für GFP + Parasiten ausgewählt. </li><li> Kulturen in luftdichten Boxen oder alternativ zwei verschlossenen Kulturflaschen bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 1% O &amp;sub2;, 4% CO 2 und 95% N 2. </li><li> Bereiten dünne Schicht gleitet, fix in 100% Methanol für 10 sec, und Fleck mit 10% Giemsa-Lösung in 6,7 mM (pH 7,1) Phosphat-Puffer (Giemsa-Lösung) für 10 min auf Parasitämie überwachen. Nach der Färbung gründlich Folie in Wasser und an der Luft trocknen. Bewerten Parasitämie mit einem 100X-Ölimmersionsobjektiv. </li><li> Pflegen Parasiten Kulturen bei einer Parasitämie unter 5% infizierten RBC durch die Spaltung von Kulturen und das Hinzufügen von nicht infiziertenRBC wie erforderlich. </li><li> Um mit Heparin zu synchronisieren, mit 20 IU / ml Heparin medizinischer Qualität zu Kulturen stufigen läuten. </li><li> Wenn die Mehrheit der Parasiten sind an der Schizontenstufe, Pellet-Zellen bei 300 g für 5 min, entfernen Heparin-haltigem Medium und resuspendieren in Parasit mittel-bis Schizont Bruch und Merozoiten-Invasion zu ermöglichen. </li><li> Nach 4 Stunden, mit 20 IU / ml Heparin zurück zu Kulturen, Sperrung weitere merozoite Invasion. HINWEIS: Mehrere Zyklen von Sorbit und Heparin-Behandlung erforderlich, bevor Parasiten ausreichend synchronisiert werden. Um geeignete Anzahl von Merozoiten erzeugen, bereiten 150 ml Parasit Kultur bei 3-5% Parasitämie. </li></ol> 4. Isolierung von Late Stage P. falciparum Trophozoiten <ol><li> Sechsunddreißig Stunden nach der Rückkehr Heparin Kulturen pelle kultivierten Zellen bei 300 × g für 5 min, und das Pellet erneut in Parasiten Medium mit 25% Hämatokrit. </li><li> Bringen Sie einen großen Magnetsäule (Matrixvolumen von 6,3ml) mit einem Magneten und ins Gleichgewicht der Säule mit Parasiten Medium, so dass alle Luftblasen entfernt werden. </li><li> Fügen Sie den resuspendiert P. falciparum-Kultur auf die Säule und Durchflussmenge einstellen, um ein Tropfen pro Sekunde. </li><li> Sobald Kultur hat durch die Säule geleitet, waschen Sie die Spalte mit Parasiten Medium, bis die Durchfluss klar ist. </li><li> Parasiten eluieren von der Säule in 30 ml 37 ° C Parasiten Medium. </li><li> Bereiten Sie eine dünne Schicht von Parasiten, fix in 100% Methanol für 10 Sekunden und färben mit Giemsa-Lösung für 3 min. Untersuchen Sie die Objektträger unter dem Mikroskop, und sicherzustellen, dass Parasiten fast füllen den roten Blutkörperchen, und scheinen in frühen Stadien Schizont sein. Wenn die Parasiten haben nicht die entsprechenden Reifestadium erreicht, kehren gereinigten Parasiten zu einer 37 ° C-Inkubator in einer Atmosphäre von 1% O 2, 4% CO 2 und 95% N 2, bis entsprechend entwickelt. HINWEIS: Reinheit größer als 90% infizierte rote Blutzellen erforderlich ist, um sicherzustellen, RBC nicht verunreinigen merozoite Zubereitungen. </li><li> Gönnen isolierten Schizonten mit 10 uM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) Butan (E64) für 6 bis 10 Stunden. HINWEIS: Längere Inkubationszeiten mit E64 möglich sind, aber die Merozoiten produziert nicht mehr invasiv sein. </li></ol> 5. Isolierung von P. falciparum Merozoiten <ol><li> Nach der Inkubation mit E64, verschmieren Parasiten fixieren Zellen in 100% Methanol und Fleck mit Giemsa-Lösung, um die Bildung der Membran umschlossenen Merozoiten beurteilen. ANMERKUNG: Eine gute Ausbeute an Merozoiten werden erzielt, wenn mehr als 50% der Parasiten Membran umschlossen Merozoiten gebildet werden. </li><li> Pellet E64-behandelten Schizonten bei 1.900 g für 8 min. Waschen mit 50 ml RT RPMI-1640-Medium (pH 7,4) mit 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml Hypoxanthin, 2 mg / ml Natriumbicarbonat und 20 ug / ml Gentamycin (Waschmedium) ergänzt, um die verbleibenden menschlichen Serum zu entfernen . </li><li> Das Pellet in 2 ml Waschmedium. HINWEIS: Die Verwendung von FCS-haltigem THP-1-Medien produzieren Schaumbildung während der Filtration. </li><li> Filtern Sie die 2 ml des resuspendierten E64-Schizonten durch ein 1,2 mm-Spritzenfilter μm/32. Das Filtrat in einem 10-ml-Tube. HINWEIS: Das Filtrat enthält Merozoiten und Hämozoin Kristalle, mit un-gebrochen Schizonten und Schmutz im Filter gesammelt. </li><li> Bringen Sie einen kleinen magnetischen Spalte ein Magnet, und ins Gleichgewicht mit 500 ul THP-1-Medium. </li><li> Führen Sie das Filtrat über der Magnet Spalte. Sammeln Sie die Durchströmung. HINWEIS: Hämozoin wird an die Säule, während Merozoiten wird passieren. </li><li> Übergeben Sie die Durchfluss über die Säule zwei weitere Male zu Hämozoin entfernen, das Sammeln der durch jede Zeit. </li><li> Mit 2 ml RT THP-1-Medium Spülen der Säule, um alle verbleibenden Merozoiten zu sammeln. </li><li> Hinzufügen EtBr bei 10 ug / ml (Endkonzentration) und Färbung für 30 min bei RT. Vor Licht auf Photobleaching zu verhindern. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle EtBr kontaminierte Flüssigkeit und plastic Abfälle werden in einer für die zytotoxische Chemikalien entsorgt. Merozoiten sind nicht mehr invasive nach dieser Inkubationszeit. </li><li> Spin down Merozoiten bei 4.000 g für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen in geeignete Abfallbehälter. </li><li> Resuspendieren merozoite Pellet in 4 ml THP-1-Medium, und drehen sich mit 4.000 × g nach unten für 10 min. </li><li> In THP-1-Medium bis zu einem Volumen von 15 ml, und vor Licht schützen. </li></ol> 6. Quantifizierung Merozoite Konzentration durch Durchflusszytometrie <ol><li> Bringen Zählen Perlen auf RT. </li><li> Vorbereitung PBS mit 0,5% BSA verdünnt Merozoiten. </li><li> Graf Merozoiten bei 3 Verdünnungen; 1 in 100; 1 zu 50 und 1 in 25. Bereiten 3 FACS-Röhrchen mit 940, 930 und 910 &amp;mgr; l PBS + 0,5% BSA, jeweils. Werden 10, 20 und 40 ul der gereinigten Merozoiten pro Röhrchen auf. </li><li> Vortex Zählen Kügelchen für 30 sec, und 50 ul Perlen pro FACS-Röhrchen verdünnt Merozoiten. </li><li> Führen Sie die drei dilausgeschüttet Merozoiten Proben auf einem Durchflusszytometer mit einem 488 nm Laser. Einem straffen Gate für Merozoiten anhand von EtBr-und GFP-Fluoreszenz duale Fluoreszenz und Gate Zählen Kügelchen durch Fluoreszenz in einem separaten Kanal. Erwerben Veranstaltungen bis 2.000 Perlen gesammelt werden. Hinweis: Diese Anleitung bezieht sich auf das Zählen GFP + Merozoiten, die mit EtBr gegengefärbt haben. Wenn nicht nutzen GFP-exprimierenden Parasiten dann merozoite Tore basierend auf Seitenstreuung und EtBr-Fluoreszenz. </li><li> Bestimmen Sie das Verhältnis von Merozoiten: Perlen, indem die Anzahl der Merozoiten Veranstaltungen der Zählung 2000 Wulst Events, ein Verhältnis berechnen für jede Verdünnung. Verwenden Sie die Perlenzählen Batch-Spezifikationen, um die Anzahl der Perlen in den 50 ul Perlen pro Röhrchen gegeben zu bestimmen. </li><li> Multiplizieren Sie die Anzahl der Perlen in 50 ul mit dem Verdünnungsfaktor und durch die Merozoiten: Wulst-Verhältnis für diesen Verdünnungsfaktor. Diese Anzahl entspricht der Konzentration an Merozoiten pro ml. Führen these Schritte für jede Verdünnung. </li><li> Mittelwert der Merozoiten Konzentrationen in den drei Verdünnungen gemessen. HINWEIS: Die Standardabweichungen von über 10% für die 1 in 50 bestimmt in 100, 1-Konzentrationen und 1 in 25 Verdünnungen zeigen technische Ungenauigkeiten bei der Vorbereitung Zählen Proben. </li><li> Resuspendieren Merozoiten bei 8 x 10 6 Merozoiten / ml in THP-1 Medium, um ein Endverhältnis von vier Merozoiten pro THP-1-Zellen zu gewährleisten. HINWEIS: Weitere merozoite zu THP-1-Verhältnisse verwendet werden können, und die Konzentrationen sollte entsprechend geändert werden. </li></ol> 7. Phagozytose Assay <ol><li> In 200 ul Wärme inaktiv FCS pro Vertiefung 96 und U-Bodenplatten, und lassen bei RT O / N, um Platten zu blockieren. Nach der Inkubation FCS zu entfernen und waschen Vertiefungen zweimal mit 200 ul sterilem PBS. PBS zu entfernen und zu speichern Platten bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Berechnung der Anzahl der THP-1-Zellen erforderlich ist, um Plasmaproben und Kontrollen zu testen, so dass drei Vertiefungen pro Probe bei 1 x 10 <sup&gt; 5 THP-1-Zellen pro Vertiefung. </li><li> Bestimmen, THP-1-Kulturkonzentration durch Laden 10 ul Kultur auf einem Hämocytometer Folie. Die Anzahl der Zellen in 4 Sätze von 16 Plätzen der Ecke Hämocytometers unter einem Mikroskop vorhanden ist, dann ist der Mittelwert der zählt. Multiplizieren die mittlere Zählung von 10.000, um die Anzahl der Zellen pro ml zu berechnen. </li><li> Zentrifugieren Sie die erforderliche Anzahl von THP-1-Zellen bei 500 × g für 5 min und Resuspendieren in 6,7 x 10 5 Zellen / ml in THP-1 Medium. </li><li> Jeweils 150 ul der THP-1-Zellen in THP-1-Medium pro Vertiefung zu einer FCS-blockierten 96-Vertiefungs-U-Bodenplatte, was zu 10 5 Zellen / Vertiefung. Bereiten 3 Wells pro Probe, die getestet werden sollen. Rückplatte, bis Sie sie Merozoiten hinzufügen Inkubator. </li><li> In 150 ul merozoite Vorbereitung auf 8 x 10 6 / ml pro Vertiefung in eine separate FCS-96 blockiert auch U-Bodenplatte. Bereiten Sie eine gut pro Probe getestet </li><li> In 10 ul der vorbereiteten verdünnten Plasmaproben pro Vertiefung zu ter Platte, die die Merozoiten enthält, und gut mischen, um eine homogene Lösung zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie den THP-1-Platte aus dem Inkubator, und 50 ul der Merozoiten / Plasma-Lösung pro Well mit THP-1-Zellen, mit drei Wells pro Plasmaprobe. </li><li> Gut mischen, und bei 37 ° C in 5% CO 2, befeuchteten Inkubator für 40 min. Mit Folie abdecken, um vor Licht zu schützen. </li><li> Nach 40 min, Zentrifuge Proben für 5 min bei 500 × g bei 4 ° C vorgekühlten Zentrifuge Phagozytose zu verhaften. </li><li> Überstand entfernen, waschen und die Zellen zweimal in eiskaltem PBS + 0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS-Puffer). HINWEIS: EDTA wird bei der Aufrechterhaltung einer Einzelzellsuspension für die Durchflußzytometrie-Analyse zu erleichtern. </li><li> Fix-Zellen in 90 ul von 2% Paraformaldehyd (PFA) in PBS + 0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS Fixiermittel). Lassen Sie auf Eis, bis Erwerb, vor Licht geschützt. </li></ol> 8. Durchflusszytometrie <ol><li> Mit einem Durchflusszytometer ausgestattet wi Erwerben Probenth ein 488-nm-Laser und Hochdurchsatz-Plattenlese Anhang. HINWEIS: Dies wird zu 400 Plasmaproben ermöglichen bis zu von einem merozoite Vorbereitung getestet werden. Die Zellen können auch Rohre für die manuelle Probenbeladung übertragen werden. </li><li> Tor tragfähige THP-1-Zellen durch Vor-und Seitenstreuung. </li><li> Stellen Sie die EtBr positive Gate auf der Grundlage der &quot;THP-1-Zellen mit Merozoiten und kein Plasma&quot; Kontrolle. </li><li> Erwerben Sie ein Minimum von 10.000 Ereignissen pro Probe. </li></ol> 9. Datenanalyse <ol><li> Analysieren von Daten mittels Durchflusszytometrie-Analyse-Software und stellen strenge Tore für EtBr positive Ereignisse. </li><li> Der prozentuale Anteil der Phagozytose für jede Probe: Die% EtBr +-Zellen für die Probe abzüglich der% positive Zellen mit nicht-immunen Plasma. </li><li> Durchschnittliche Ergebnisse in dreifacher Ausführung. HINWEIS: Die Standardabweichungen für eine dreifach von mehr als 10% geben an experimentellen Ungenauigkeiten. Einige Hintergrund EtBr positive Ereignisse können als Folge der merozoi beobachtet werdente Haftung auf der Oberfläche von THP-1-Zellen, sollte aber in allen Proben, die Merozoiten konsistent. Einstellen der Tor auf der Grundlage der &quot;THP-1-Zellen mit Merozoiten und kein Plasma&quot;-Steuerelement, und jede Subtraktion Hintergrund der &quot;THP-1-Zellen mit nicht-immunen Plasmakontrolle wird in% Phagozytose, die die Fluoreszenz spiegelt aufgrund verinnerlicht führen / phagozytiert nur Merozoiten. </li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria.">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. 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E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Um merozoite Phagozytose zu messen, wird Kenntnisse in zwei Techniken erforderlich: Reinigung von Merozoiten und THP-1 Phagozytose-Assay. Die wichtigsten Schritte für die Kombination dieser beiden Techniken sind: 1) Hoch synchronisiert Parasiten; 2) Hinzufügen von E64 an der richtigen Zeit, um Membran umschlossen Merozoiten ergeben; 3) Entfernen Hämozoin zu Aggregaten zu vermeiden; 4) Genaue merozoite Zählung mittels Durchflusszytometrie; 5) die Verdünnung des Plasmas verwendet wird; und 6) die Aufrechterhaltung geringer Zelldichte und der Passagenzahl von THP-1-Zellen. Die sorgfältige Abwägung dieser Schlüsselaspekte wird dafür sorgen, robust Phagozytose Reaktionen beobachtet werden. Obwohl hier beschrieben ist die Herstellung von Merozoiten zur Beurteilung Phagozytose, kann die Technik für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Unabhängig von der Nachfolge Methodik optimal merozoite Vorbereitungen hängen korrekt Zeit E64 zusätzlich um Merozoiten generieren. Die hier beschriebene Methode ist E64 bis y gezeigtield invasive Merozoiten für den Einsatz in hochauflösende Mikroskopie der Invasion Ereignisse und Arzneimittelempfindlichkeit Assays 15-20. Während Merozoiten Fähigkeit nicht wesentlich ist für die Phagozytose wird Integrität des Merozoiten-Oberflächenbeschichtung erforderlich. Daher ist die hier beschriebene Methode ermöglicht E64 hochwertigen Merozoiten für Antikörper-Antworten auf die Beurteilung der Oberflächenlack hergestellt werden. Wie in Fig. 1 dargestellt, wenn E64 zu früh oder zu spät zugegeben Membran eingeschlossen Merozoiten nicht ausgebildet sind. Aus diesem Grund sind sehr Synchronparasitenkulturen erforderlich. Hier ist die Verwendung von Sorbit und Heparin Behandlungen klein synchronisieren D10-GFP Parasiten Kulturen zu einem Fenster von 2 Stunden beschrieben. Heparin kann gametocytogenesis Förderung in anderen Labor isoliert, und sollte daher mit Bedacht eingesetzt werden. Alternative Synchronisationsverfahren, wie Alanin können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass dicht synchronisierten Parasiten erzeugt 29. Wenn E64 wird, um asynchrone Parasiten hinzu, eine untere Stützeortion von Membran-umschlossenen Merozoiten produziert werden und die verbleibenden Parasiten infizierten RBC wird entweder normal oder Bruch entwickeln abnorme Morphologie. Die Anwesenheit der Parasiten, die nicht in Membran umschlossen Merozoiten entwickelt haben, in ein Verstopfen des Filters führen und reduzieren die erhaltene merozoite Ausbeute. Bei der Filtration von Membran-umschlossenen Merozoiten ist Hämozoin befreit von der Verdauungs Vakuolen und ist als freie Kristalle in Lösung vor. Hemozoin sehr proinflammatorischen und wurde berichtet, Monozyten-und Makrophagen-Phagozytose Antworten 30, 31 zu modulieren. Zusätzlich zum Modulieren Phagozytose, wie in Fig. 2 gezeigt, kann Hemozoin Aggregaten mit Merozoiten in Lösung zu bilden. Als THP-1-Zellen können diese Aggregate phagozytieren, kann dies ein wichtiger Störfaktor für die Auflösung der Antikörper-vermittelten Phagozytose sein. Daher ist in diesem Test av Entfernen Hemozoin erforderlichenoid zusätzliche Komplexität Hämozoin auf Phagozyten Biologie. Darüber hinaus können zu einem Ausfall Hämozoin entfernen auch schädlich sein, wenn Sie diese Technik, um kostenlos Merozoiten für andere Anwendungen zu erzeugen, vor allem wenn merozoite Quantifizierung erforderlich. Wie in Fig. 4 dargelegt, die Anzahl der Merozoiten zu dem Assay zugesetzt werden das Ausmaß der Phagozytose durch THP-1-Zellen zu beeinflussen. Obwohl Durchflusszytometrie ermöglicht Aufzählung merozoite Konzentration, sorgfältige Pipettieren und replizieren Grafen von Merozoiten sind notwendig, um die Genauigkeit zu verbessern. Dies ist besonders kritisch, wenn mehrere Parasitenlinien nebeneinander getestet werden. Es wurde bereits nachgewiesen, dass Plasma von semi-immunen Kinder von PNG deutlich verdünnt, bevor Antworten sinken 23 werden. Beschrieben wird hier die optimale Verdünnung von Plasma (1/120, 000 endgültigen Verdünnung von Plasma) für eine Kohorte von 5-12 Jahre alten Kinder, die das PNG große Auswahl an phagocyt hergestellt. in 5 beschrieben ose Antworten Dieser Bereich für die Stratifizierung der Antworten erlaubt in vier Gruppen (0 - 19%, 20-39%, 40-59% und 60-79% Phagozytose) und Regressionsanalyse ergab, dass opsonisierenden Antworten wurden im Zusammenhang mit Schutz vor klinischer Erkrankung und hoher Dichte Parasitämie 10 Für verschiedene Kohortenstudien kann es erforderlich sein, Plasmaverdünnung einzustellen, um die Phagozytose durch THP-1-Zellen ausgelassen oder unterhalb der Nachweisgrenze gesättigt. Durchfluss-Zytometrie ermöglicht schnelle und messbare Phagozytose mit verbesserter Genauigkeit über Mikroskopie. Dieses Protokoll ist ein Hochdurchsatz-, Platten-basierte und automatisierte Übernahme von 96-Well-Platten natürlich erworbenen humoralen Immunität zu studieren. Das Verfahren erfordert Anfärbung mit Ethidiumbromid Merozoiten jedoch alternative DNA-Flecken wie SYBRGreen, DAPI und Propidiumiodid, Membranprotein Flecken oder Flecken verwendet werden könnte. Dieser Test wäre zugänglich Primary Monozyten oder Neutrophile und könnte angepasst werden, wenn Phagozyten oder FcR Biologie von Interesse war. Primärzellen oder THP-1-Zellen in vitro mit PMA unterscheiden kann zur Phagozytose in Malaria und anderen Krankheitserregern 12, 32-34 untersuchen. Doch mit Primärzellen kann eine Herausforderung sein, da diese Zellen anhaften und auch anzeigen Nicht-Antikörper-vermittelte Phagozytose 35. Außerdem Variabilität in der Reinheit, der Lebensfähigkeit und Funktionalität sind einige der wichtigsten Einschränkungen für die Verwendung von Primärfresszellen. Die Fc-Rezeptoren in Merozoiten Phagocytose beteiligt bleiben charakterisierter und damit mit blockierenden Antikörpern an spezifische Fc-Rezeptoren könnte der Beitrag jedes Fc-Rezeptor Phagozytose Merozoiten aufzuklären. THP-1 Phagozytose ist FcR abhängig, dies ermöglicht eine einfache Interpretation der beobachteten Phagozytose. Dieser Test eignet sich auch zur Adressierung der Antigenspezifität von opsonisierenden Antikörpern, die durch util erreicht werden konnteizing Knock-out-Parasiten für Merozoiten-Oberflächenantigene oder mit gereinigter menschlicher Antikörper für Oberflächenproteine ​​Merozoiten. Darüber hinaus in der Tiefe Studien Zytokinreaktionen folgenden merozoite Phagozytose fehlen, und konnte in diesem Test erreicht werden. Diese beiden Techniken bilden erhebliche Fortschritte auf die Untersuchung von funktionalen antimerozoite Antikörpern. Die Reinigung von hochwertigen Merozoiten ist vorteilhaft, mit kryokonservierten Merozoiten oder fluoreszierende Mikrosphären mit merozoite Antigenen beschichtet. Obwohl dieser Test wurde als ein Werkzeug für die Bewertung natürlich erworbene Immunität verwendet wurde, kann es ein wichtiges Werkzeug für die Adressierung der Erwerb von Immunität in Reaktion auf die Impfung zu beweisen. Während es wurde kürzlich gezeigt, dass die Phagozytose oder Merozoiten opsonisiert mit Schutz vor klinischer Malaria verbunden sind, ist es nicht möglich, direkte Rückschlüsse aus in vitro-THP-1-Phagozytose in vivo phagocyto zeichnensis von Merozoiten Phagozytose in diesem Test erfolgt unter statischen Bedingungen und in Abwesenheit von konkurrierenden roten Blutkörperchen. Die möglichen Anpassungen dieser Test kann somit ein vielseitiges Werkzeug für das weitere Verständnis von Malaria und merozoite Phagozytose.

Die Bedeutung von Antikörpern zur Immunität gegen Plasmodium falciparum Malaria wurde vor 40 Jahren, als Immunglobulin von hyperimmunen Erwachsenen wurde passiv an Kinder, die an schwerer Malaria was zu Krankheit gelindert 1 übertragen gezeigt. Folglich wurden beträchtliche Anstrengungen versucht, Ziele Malariaschutzimmunität zu identifizieren, vor allem durch Messung der Antikörpertiter gegen Peptide oder bakteriell exprimierten Proteinen durch ELISA. ELISA-Serologie hat sich auch als sehr variabel zwischen Studien und keine Antikörper Funktionalität 2 zu adressieren. Viele Malaria-Antigene induzieren eine cytophilen IgG1 und IgG3 Antikörperprofil, insbesondere Merozoiten-Oberflächenantigene 3. Diese Unterklasse Bias nahe, dass Antikörper-Fc-Rezeptor (EKR) Wechselwirkungen mit Fresszellen sind wichtig für die Effektor-Funktionen von opsonisierenden antimerozoite Antikörper 4. Mehrere merozoite Antigen-Impfstoffe in der Entwicklung sind so ausgelegt,entlocken Phagozyten Effektorfunktionen 5, 6 und obwohl bedeutende Beweise für die Bedeutung der Antikörper-FcR-Wechselwirkungen in Nagetiermodellen von Malaria existiert 7-9, und einige neuere Studien die Bedeutung funktioneller Antikörper und Phagozyten Effektorfunktionen für Immunität gegen Malaria beim Menschen 10, 11, bleibt dieser Bereich nur wenig untersucht. Studie in Merozoiten spezifischen opsonierende Antikörper wurde durch zwei Faktoren begrenzt; die Schwierigkeit bei der Isolierung gute Qualität Merozoiten; und variable Phagozytose Antworten von Primärzellen. Bis vor kurzem wurden Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation oder Percoll Dichtegradienten verwendet, um Merozoiten aus Kulturüberständen von Kulturen Aufbrechen Schizonten zu isolieren. Diese Merozoiten waren selten lebensfähig, und oft durch Dichte-Zentrifugation manipuliert und mehrere Waschschritte 12, 11 oder Kryokonservierung vor der Verwendung in Assays. Diese proczesse möglicherweise lösen viele peripher assoziierte Proteine ​​aus der Merozoitenoberfläche, Proteine ​​bekannt, antigene Ziele von Malaria Immunität 13 sein. Vor kurzem hat die Cystein-Protease-Inhibitor-Epoxysuccinyl trans-L-leucylamido (4-Guanidino)-butan (E64) wurde verwendet, um lebensfähige Merozoiten erzeugen. E64 verhindert Schizonten Bruch, Erzeugen Membran eingeschlossen Merozoiten 14, der durch Filtration aufgebrochen können tragfähige Merozoiten 15, 16 freizusetzen. Diese Technik hat sich auf die räumliche Auflösung von zahlreichen Proteinen während der Erythrozyten-Invasion 15, 17-19 zu führen und hat die Bühne spezifische Wirkung von mehreren Medikamenten gegen Malaria 16, 20 geklärt. Jedoch bleibt die Erzeugung von lebensfähigen Merozoiten technisch anspruchsvoll. Um die Verbreitung dieser Technik und Anwendung auf funktionelle Assays der Immunität, ein detailliertes Protokoll für lebensfähige merozoite Reinigung und ihre Verwendung in eine Beihilfestandardisierte Funktionstest von Antikörper: Zell Zusammenarbeit in Opsonisierung und Phagozytose wird hier beschrieben. Diese Technik zeigt einen deutlichen Fortschritt gegenüber früheren in vitro-Assays von Merozoiten Opsonisierung, wie Neutrophilen Respiratory Burst, Antikörper-abhängige zelluläre Inhibition (ADCI) und alternative merozoite Phagozytose-Assays. Diese Assays sind schlecht reproduzierbar aufgrund der Variation Parasiten Eingänge und der Aktivität der primären phagozytischen Zellen 11, 21. Kontaminierende Hämozoin kann auch tiefgreifend beeinflussen Phagozytenfunktion 22. Eine vor kurzem berichtet, robuste und reproduzierbare merozoite Phagozytosetest 23 nutzt die promonocytic Zelllinie THP-1-24. Dies ist eine ideale Zelltyp für hohen Durchsatz Durchflußzytometrie-Assays, da es nicht anhaftenden und führt insbesondere Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose 25, 26. Eine zusätzliche Komplexität, während Investorentigating Phagozytose ist, dass das Ausmaß der Phagozytose ist abhängig von der Anzahl der Merozoiten in Bezug auf THP-1-Zellen und der Plasmakonzentration. Um die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten zu gewährleisten, sollte Merozoiten zählt werden und eine definierte Konzentration verwendet. Aufgrund ihrer geringen Größe durchflusszytometrische Quantifizierung ist nicht erforderlich. Das hier beschriebene Verfahren entfernt Hämozoin und erzeugt lebensfähig Merozoiten, und beschreibt eine Anwendung dieser Merozoiten für die Durchflusszytometrie Aufzählung der Merozoiten gefolgt von Opsonisierung und Phagozytose. Obwohl technisch anspruchsvoll, können die beschriebenen Techniken nützlich bei der Aufklärung der Beitrag der Merozoiten-Oberfläche spezifische Antikörperantworten auf natürlich erworbene Immunität induziert und Impfstoff beweisen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

Plasmodium falciparum Merozoiten-Antigene sind in der Entwicklung als potentielle Malaria-Impfstoffen. Ein Aspekt der Immunität gegen Malaria ist die Entfernung von freien Merozoiten aus dem Blut durch Fresszellen. Doch die Beurteilung der funktionellen Wirksamkeit von spezifischen merozoite opsonierende Antikörper ist eine Herausforderung aufgrund der kurzen Halbwertszeit von Merozoiten und der Variabilität der primären Fresszellen. Im Detail hierin beschrieben ist ein Verfahren zur Erzeugung lebensfähiger Merozoiten mit dem E64-Protease-Inhibitor und ein Assay von Merozoiten opsonin Phagozytose mit dem pro-Monozyten-Zelllinie THP-1. E64 verhindert Schizont Bruch, während der die Entwicklung von Merozoiten, die durch Filtration des behandelten Schizonten freigegeben werden. Ethidiumbromid markierten Merozoiten mit menschlichen Plasmaproben opsonisierten und THP-1-Zellen gegeben. Die Phagozytose wird durch eine standardisierte Hochdurchsatz-Protokoll bewertet. Lebensfähige Merozoiten sind eine wertvolle Ressource für die Beurteilung der zahlschiedenen Aspekten der P. falciparum Biologie, einschließlich der Beurteilung der Immunfunktion. Antikörperspiegel von diesem Test gemessen werden mit klinischen Immunität gegen Malaria in natürlich exponierten Personen verbunden. Der Test kann auch von Nutzen für die Bewertung Impfstoff induzierte Antikörper sein.

Der Reifestadium-Parasiten vor dem E64-Behandlung ist entscheidend für die Erzeugung von Membran-umschlossenen Merozoiten. 1Ai Abbildung zeigt die entsprechenden Reifestufe der Schizonten für das Hinzufügen von E64. Die Parasiten sollte groß sein und fast füllen die roten Blutkörperchen. Ein gesprenkelt Aussehen der Giemsa-Färbung zeigt Merogonie begonnen hat, und E64 sollte hinzugefügt werden, um membranumschlossenen Merozoiten (Abbildung 1Aii) zu erhalten. Wenn E64 früher hinzugefügt Stadium-Parasiten Trophozoit werden Membran umschlossen Merozoiten auch nicht nach 12 Stunden von E64 erzeugt. Statt Parasiten nehmen abnorme Morphologie wie die Erweiterung des Verdauungs Vakuole (Abbildung 1bi und 1Bii) und Merozoiten nicht gebildet werden. Wenn E64 wird später auf Schizonten hinzugefügt werden, werden membranumschlossenen Merozoiten nicht erzeugt als Schizont Bruch wird ungehemmt (Abbildung 1CI und 1Cii). Ein hohes Maß an Synchronität Parasiten gefordert wird, weitereweise eine Reihe von allen drei beschriebenen Ergebnisse werden nach E64 Behandlung gesehen werden. Entfernung von Hämozoin ist ein weiterer wichtiger Schritt zur Reinigung von Merozoiten. Wenn Merozoiten werden nicht von Hämozoin gereinigt dann merozoite Hämozoin-Cluster zu bilden, die nicht durch Pipettieren verdrängt werden kann. Diese Aggregate werden auf dem Durchflusszytometer als Einzelveranstaltungen, wenn auch mit unterschiedlichen Vorwärtsstreu und Nebenstreueigenschaften als Einzel Merozoiten, was zu ungenauen merozoite Zählung mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2A). THP-1-Zellen können auch phagozytieren Hemozoin können diese Merozoiten-Hemozoin Cluster auch phagozytiert werden (Abb. 2B). Diese Aggregate sind sehr EtBr fluoreszierenden, als sie mehrere Merozoiten enthalten. Phagozytose von Aggregaten führt zu einer THP-1-EtBr-Fluoreszenzprofil entspricht, die für die Phagozytose von mehreren einzelnen Merozoiten beobachtet. Daher, wenn Hemozoin nicht entfernt wird, das EtBr-Fluoreszenz von THP-1-Zellen wird ein O seinverestimate der opsonierende Potenzial für die Plasma getestet. Hemozoin wird auch berichtet, Phagozytenfunktion signifikant. GFP positive Merozoiten Zähler mit EtBr gefärbt, um die Visualisierung von Merozoiten von THP-1-Zellen phagozytiert erhöhen. Mit den in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen werden alle GFP positive Merozoiten mit EtBr, die eine hellere Fluoreszenz Intensität (3A) hat gegengefärbt. Phagozytose Bewertung durch EtBr-Fluoreszenz ermöglicht überlegene Auflösung von Merozoiten Phagozytose als GFP-Fluoreszenz (Abbildung 3B). Die Anzahl der Merozoiten dem Assay zugegeben wird den Betrag der Phagozytose beobachtet modulieren. Aus diesem Grund ist eine genaue Zählung durch Durchflusszytometrie ist kritisch. Zunehmende Verhältnisse von Merozoiten: THP-1 zu einer erhöhten Haftung der Merozoiten an THP-1-Zellen in Abwesenheit von Plasma (4A) führen. Erhöhen Merozoiten: THP-1-Verhältnissen führt auch zu erhöhten phagocytosis Antworten, wenn Merozoiten opsonisiertes (4B). A 4.01 merozoite: THP-1-Verhältnis für robuste phagocytic Antworten empfohlen. Mit diesem Verhältnis, und der Verdünnung des Plasma angegeben, ist dieser Test in der Lage, niedrigen, mittleren und hohen opsonisierenden Antikörper lösen. Zwischen 0 und 78 Prozent Phagozytose Antworten wurden mit PNG Plasmaproben und die anderen beschriebenen Bedingungen beobachtet. Solche Reaktionen sind vor kurzem gezeigt, dass mit natürlich erworbene Immunität gegen Malaria klinischen 10. Abbildung 5 zeigt Beispiele für die vier Quartile der Phagozytose Antworten von PNG Personen zuzuordnen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Zeitpunkt der E64 hinaus ist entscheidend für die Erzeugung von Membran-umschlossenen Merozoiten. (A) Geeignete maturatio. n Stadium der Parasiten i) vor der E64-Behandlung, und ii) nach 6 h Behandlung E64 hergestellte Membran umschlossenen Merozoiten (B) Membran umschlossen Merozoiten werden nicht erzeugt, wenn E64 ist mit unreifen Parasiten aufgenommen; i) Spätstadium Trophozoiten und ii) nach 12 h E64 (C) Schizont Bruch nicht gehemmt wird, wenn E64 wird hinzugefügt, um späten Schizonten segmentiert. i) Spätstadium Schizonten, und ii) nach 6 Stunden von E64. Maßstabsbalken entspricht 10 um. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Hämozoin Entfernung ist entscheidend, um eine Einzelzellsuspension merozoite generieren. Merozoite Hämozoin-Aggregate bilden folgende Filtration von Membran umschlossen Merozoiten, es sei denn Hämozoin wird magnetisch von Merozoiten getrennt. (A) Zukunfts Streu-und Seitenstreudiagramme von Merozoiten mit Hämozoin entferntund Hemozoin beibehalten. (B) Hämozoin-Merozoiten-Aggregate können durch THP-1-Zellen phagozytiert werden. Diff-Quick gefärbt Zyto-Spin-Dias von THP-1-Zellen mit Plasma inkubiert PNG opsonisiertes merozoite Präparate mit oder ohne Hämozoin. Maßstabsbalken entspricht 10 um. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Ethidiumbromid-Färbung ermöglicht eine hohe Auflösung von Merozoiten Phagozytose. D10-GFP gereinigten Merozoiten sind mit EtBr gegengefärbt, um die Fluoreszenzintensität zu verbessern. (A) Durchflusszytometrie Histogramm von gereinigten Merozoiten mit Gating auf GFP positive Merozoiten und eine Dot-Blot zeigt EtBr Fluoreszenz innerhalb dieser Wohn GFP positive Bevölkerung. (B) Zukunftsstreuung gegen GFP und Vorwärtsstreuung gegen EtBr von THP-1-Zellen nach Phagozytose von GFP und EtBr Dual Fluoreszenz Merozoiten. Tore wurden d<html> rawn auf den THP-1-Zellen mit Merozoiten und ohne Plasmakontrolle. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4 Die Merozoiten:. THP-1-Verhältnis beeinflusst den Grad der Phagozytose beobachtet. (A) Fünf merozoite: THP-1-Verhältnisse dargestellt; 50:1, 20:1, 10:1, 4:1 1:1 liegt. Zellen, die nur Steuer zeigt die Hintergrundfluoreszenz aufgrund von THP-1-Zellen. THP-1 EtBr-Fluoreszenz für jedes Verhältnis ist für Merozoiten mit einem Pool von Plasma-oder PNG mit nicht-immunen Australian Plasma opsonisiertes angegeben (B) Mittlere Fluoreszenzintensität der THP-1-Zellen für verschiedene merozoite:. THP-1-Verhältnisse und Opsonisierung mit Pool von PNG-Plasma oder nicht-immunen Australian Plasma (Mittelwert + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Eine große Auswahl an opsonisierenden Antikörper gemessen werden kann. Merozoiten wurden mit Plasma von PNG Personen opsonisiertes und mit THP-1-Zellen inkubiert. Vier Vertreter Phagozytose Reaktionen gezeigt. Tore wurden auf Basis der THP-1-Zellen mit Merozoiten und keine Plasmasteuer gezogen und Zahlen geben die Phagozytose% nach Abzug der THP-1-Zellen mit nicht-immunen Plasmakontrolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Mess Antikörper Funktion ist der Schlüssel zum Verständnis Immunität gegen Plasmodium falciparum Malaria. Diese Methode beschreibt die Reinigung von lebensfähigen Merozoiten und Messung der Opsonisierung-abhängigen Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.7K Aufrufe.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  Mess Antikörper Funktion ist der Schlüssel zum Verständnis Immunität gegen Plasmodium falciparum Malaria. Diese Methode beschreibt die Reinigung von lebensfähigen Merozoiten und Messung der Opsonisierung-abhängigen Phagozytose mittels Durchflusszytometrie. 

Serie: High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Trennung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-infizierten Erythrozyten durch magnetische Mittel

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Reinigung eines hochmolekularen Proteins in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...