Agradecemos a Francisco Candal, CDC Transferência de Tecnologia Escritório, Atlanta Geórgia para HBEC-5i células. Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (4 anos bolsa de estudo para doutorado e AC Fellowship sênior em ciência biomédica básica para JAR, conceder número 084226).

Recomendações gerais Cérebro humano microvascular cultura de células endoteliais (HBEC-5i) tem sido descrito anteriormente em 6, 8. P. parasitas falciparum foram cultivadas como no 9. Ambos HBEC-5i e P. culturas falciparum parasita devem ser mantidos em condições estéreis em todos os momentos. Todos os reagentes devem ser pré-aquecido a 37 ° C. Recomendamos que verifique regularmente se há contaminação por micoplasma 10 por PCR (Minevera Biolabs, as instruções do fabricante do seguinte). O protocolo está resumida na Figura 1. 1. Cultura de rotina da célula endotelial <ol><li> Prepare os reagentes necessários. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Médio para se preparar </td><td> Reagentes </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> &quot;DMEM incompleto&quot; </td><td> DMEM-F12 Ham </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> &amp;nbsp; </td><td> L-glutamina 200mM </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Penicilina estreptomicina / 100X </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1,3 ml (ajustar o pH a 7.4) </td></tr><tr><td> &quot;DMEM completo&quot; </td><td> &quot;DMEM incompleto&quot; </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Fetal bovino soro inativado pelo calor </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> Suplemento de crescimento da célula endotelial </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultura HBEC-5i num frasco de 25 centímetros 2 perfurada com 10ml meio DMEM completo em um 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. </li><li> Células passagem quando eles se tornam confluentes. Remover o meio de idade por sucção e lavar duas vezes com DMEM incompleta ou cultura de tecidos grau PBS (Ca 2 + e Mg 2 + livre) pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de pré-aquecido Tentepsin-EDTA (0,025% Tripsina, 0,5 mM EDTA), agite para cobrir a totalidade do frasco e incubar por ~ 2 min a 37 ° C. </li><li> Seleção em microscópio invertido que pelo menos 90% das células foram destacados. Se necessário, delicadamente bater o fundo do frasco para retirar células aderentes. Adicionar 10 ml de meio completo DMEM para impedir as células de tripsina e transferir para um tubo cônico 15ml. Centrifugar por 4 min a 300 g à temperatura ambiente (RT). </li><li> Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 10 ml de meio completo DMEM. Pipeta a solução cima e para baixo completamente ressuspender as células. </li><li> Adicionar 1 ou 2 ml da suspensão de células para um balão nova cultura e adicione 8ml de meio fresco para manter a cultura. Avaliar o crescimento da cultura todos os dias sob um microscópio invertido e mudança de médio a cada 2 ou 3 dias antes que ele fica amarelo. </li></ol> 2. Preparar células endoteliais para uma seleção <ol><li> Dois dias antes do dia da seleção e<html> n, adicione fibronectina diluído em PBS estéril (2 mg / cm 2) em um (ou mais) 60 mm placa de Petri. Incubar o prato por 5 a 20 min a 37 ° C, em seguida, remova a solução fibronectina, que pode ser armazenado a 4 ° C por um mês e re-utilizado uma vez. </li><li> Células passagem como descrito nas seções 1.3. para 1,5. Assumindo 100% de células confluentes foram destacados e ressuspenso em 10ml meio DMEM completo (seção 1.6., Ressuspender com um volume equivalente de médio se a confluência é menor, por exemplo, ressuspender com 8ml se a confluência foi de 80%), adicionar 1,5 ml da suspensão células à placa de Petri revestidas fibronectina e outro de 1,5 ml de meio completo DMEM. </li><li> Coloque a placa de Petri semeadas na incubadora. Nota: Idealmente, a confluência será em torno de 90% no momento da seleção dois dias depois. </li><li> Opcional. Para ativar HBEC-5i, adicione o TNF de citocina (fator de necrose tumoral) em uma concentração final de 50μg/ml 24 horas antes da seleção. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Plasmodium falciparum cultura de rotina <ol><li> Prepare os reagentes necessários (veja a tabela aqui abaixo). Prepare células vermelhas do sangue (RBC), separando sangue total (grupo O +) pela passagem através de um filtro de remoção de leucócitos (ver &quot;Métodos de Pesquisa em Malária&quot; publicação 11 para cultura geral parasitas da malária). Lavar RBC duas vezes por centrifugação a 400 g por 5 min e ressuspensão com 10 ml RPMI incompleta. Mantenha RBC lavado a 4 ° C em meio incompleta em hematócrito de 50%. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Médio para se preparar </td><td> Reagentes </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> &quot;RPMI incompleto&quot; </td><td> RPMI 1640 (com bicarbonato) </td><td> 500ml </td></tr><tr><td></td><td> Hepes 1M </td><td> 12.5ml </td></tr><tr><td></td><td> Glicose a 20% </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td&gt; <td> L-glutamina 200mM </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0,7 ml (ajustar o pH a 7.2) </td></tr><tr><td> &quot;RPMI completo&quot; </td><td> &quot;RPMI incompleto&quot; </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Agrupados humano (não imunes) de soro </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultura P. falciparum infectados RBC com meio completo RPMI a 37 ° C com 3% de CO 2, 1% O 2, e 96% N 2. hematócrito em 2% e incubar Faça Giemsa esfregaço 11 diárias para avaliar o estágio de desenvolvimento de parasitas (Figura 2). </li><li> Regularmente (aproximadamente uma vez por semana) sincronizar cultura por tratamento sorbitol 12. O dia antes do ensaio da selecção, objectivo para uma cultura anel de estágio na parasitemia 5% ou mais (de preferência pelo menos 10%). </li></ol> 4. Seleção de P. falciparum para cytoadhesion às células endoteliais <ol><li> No dia do ensaio, a cultura deve ser parasita na fase trofozoíto pigmentados (Figura 2) (idealmente parasitemia 10%), enquanto HBEC-5i cultura deve ser de 50 a 100% confluência (idealmente 90%). Volume celular 30μl repleta de cultura parasita é necessário por HBEC-5i placa de Petri. </li><li> Lavar parasitas duas vezes por centrifugação (500 g por 5 min) 1,5 ml da cultura parasita. Elimine o sobrenadante e ressuspender com 10ml de preparados na hora, aquecido meio DMEM, incompleta. Repita a lavagem pela segunda vez. Ressuspender o volume celular 30μl embalado com 1,5 ml de DMEM incompleta com BSA 1%. </li><li> Lave o HBEC-5i placa de Petri revestidas por duas vezes aspiração médio e adicionando 3 ml de DMEM incompleta. </li><li> Adicionar a solução de parasitas para o prato HBEC-5i e incubar a 37 ° C por 75min. Ressuspender parasitas duas vezes (aos 30 e 60 min) durante a incubaçãosuavemente balanço o prato nas quatro direções, bem como no sentido horário e anti-horário. </li><li> Após a incubação, lavar o prato 5 vezes por meio de aspiração, usando um plástico Pasteur pipeta para adicionar 3 ml de meio DMEM quente incompleta, e de balanço suave. Se muitos pratos estão sendo utilizados, mantê-los em uma superfície quente, como um grande frasco cheio de água a 37 ° C. </li><li> Verifique o prato sob um microscópio invertido. Se muitos RBC não infectados ainda são visíveis, não lava mais como descrito acima. Lidar com a placa de Petri com muito cuidado para evitar qualquer risco de contaminação. </li><li> Remova o meio do prato e adicionar 3 ml de meio RPMI quente completo com volume celular 40μl repleta de uRBC fresco. </li><li> Coloque o prato em uma câmara hermética de incubação, o gás por 3 min e colocar a câmara em uma incubadora a 37 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, colher os parasitas por lavagem com RPMI médio incompletos, de um modo semelhante ao descrito na seção 4.4. mas de forma mais vigorosa. Keep todos usados ​​médio (contendo ressuspenso RBC) em um tubo de 15ml cônico. Seleção em microscópio invertido que todos RBC foram removidos do prato. </li><li> Pellet os parasitas, desprezar o sobrenadante, ressuspender em meio RPMI 5ml completo e coloque a mistura em um frasco de cultura normal. </li></ol> 5. Resultados representante Parasitas não selecionados mostram um baixo nível de ligação a HBEC-5i (Figura 3A). Assim, após a primeira rodada de seleção, os parasitas poucos serão colhidos e pode demorar até um mês de cultura para chegar a uma parasitemia suficiente para a segunda rodada de seleção. Após cada rodada de seleção, mais parasitas e mais se ligam a células endoteliais e as seleções pode ser repetido em intervalos de tempo mais curto. Após 4-5 rodadas de seleção, as populações de alta ligação parasita são obtidos (Figura 3). Em nossas mãos, a ligação de HB3-HBEC para HBEC-5i ou ativado HBEC TNF-5i era de simhomólogos de nível (dados não mostrados). O protocolo descrito aqui foi testado com 4 p. cepas falciparum: HB3, IT/FCR3, 3d7 e DD2 (Tabela 1). Apenas o último não provou ser capaz de se ligar a HBEC-5i, mesmo depois de cinco rodadas de seleção. HB3 parasitas também foram selecionados para a citoaderência Humanos dérmica e pulmonar células endoteliais microvasculares (HDMEC e HPMEC). Após 4 rodadas de seleção, usando o método descrito aqui, uma população de alto-binding foi obtido em ambos os HDMEC e HPMEC (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral do processo de seleção. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" /> Estágios figura 2. Desenvolvimento de P. falciparum glóbulos vermelhos infectados. Esfregaço Giemsa visualizados sob microscópio com ampliação de 1000X. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplo típico de parasitas ligação a HBEC-5i. (A) A camada azul é HBEC-5i fixado em glutaraldeído e corados com Giemsa, visualizados sob microscópio com ampliação de 1000X. Fotos foram tiradas após uRBC e iRBC unbound foram lavados. O painel esquerdo mostra um único P. falciparum HB3 (não selecionados) parasita obrigado a HBEC-5i. No painel direito os parasitas HB3-HBEC tinha sido seleccionado para cinco rounds. (B) Os dados representam a média de dois experimentos independentes, cada uma realizada em duplicata. O número de parasitas obrigados por célula endotelial foi contado. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" /> Tabela 1. Resumo das cepas de Plasmodium falciparum que foram selecionados com sucesso para a ligação com HBEC Nota-5i. HB3 que também foi selecionado no TNF-activated HBCE-5i. Após 5 rodadas de seleção, a tensão DD2 não mostrou aumento na ligação para HBEC-5i comparação com unselected-DD2. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" /> Figura 4. Ligação do P. falciparum HB3 parasitas para dérmica (HDMEC) e pulmonar (HPMEC) células endoteliais, antes e depois de quatro rodadas de seleção. Embora o meio de cultura para HDMEC e HPMEC ligeiramente diferente (veja as instruções do fornecedor), o protocolo usado para a seleção foi idêntica como com HBEC-5i. Fotos tiradas com ampliação de 400X. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM-F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> Por meio completo DMEM </td></tr><tr><td> L-glutamina 200mM </td><td>GIBCO </td><td> 25030 </td><td> Para DMEM e meio completo RPMI </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / 100X (10.000 unidades / ml e 10mg/ml) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> Por meio completo DMEM </td></tr><tr><td> Fetal bovino soro inativado pelo calor </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> Por meio completo DMEM </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,025% Tripsina, 0,5 mM EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> Suplemento de crescimento da célula endotelial </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> Por meio completo DMEM </td></tr><tr><td> Cultura de tecidos tratados 60 milímetros X 15 milímetros placas de Petri </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> A fibronectina humana </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> Use a 2 mg / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> R &amp;D Systems </td><td> 210-TA </td><td> opcional, use a 50 mg / ml </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167f </td><td> Por meio completo RPMI </td></tr><tr><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> Por meio completo RPMI </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Lonza </td><td> BE17-737E </td><td> Por meio completo RPMI </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> Linhagem de células primárias </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> Linhagem de células primárias </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Obtido a partir de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Materiais

<ol>
	<li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+malaria:+in+situ+switching,+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum.">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li><li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration.">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li><li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children.">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li><li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts.">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li><li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria:+sequestration,+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction.">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li><li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain.">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li><li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum.">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li><li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication.">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li><li>Moll, K., Ljungstr&#246;m, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2009).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li><li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor(s)+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface.">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li><li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMP-420,+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria.">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li><li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum.">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

A marca da malária cerebral é o seqüestro de P. falciparum iRBC dentro do cérebro microvasculatura 2, 3. No entanto, em culturas in vitro de P. falciparum apenas mal cytoadhere para HBEC-5i, um modelo de cérebro humano endotélio microvascular. Aqui desenvolvemos um ensaio simples para enriquecer uma população para a ligação com HBEC-5i, um mais &quot;in-vivo, como&quot; fenótipo. Três em cada 4 p. cepas falciparum foram selecionados com sucesso usando este método. Além disso, HB3 também foi selecionado em HDMEC e HPMEC, indicando que este protocolo pode ser usado para vários tipos e parasita das células endoteliais. Diferentes hipóteses podem explicar a falta de ligação com a cepa DD2. O mais provável é o fato de que esta linha parasita é knobless, que impede a profundamente citoaderência 13, 14. Recomendamos parasitas cultura não selecionados ao longo do pro seleçãocesso para fornecer um controle para comparação. Isto irá permitir, por exemplo, comparando o transcriptoma de parasitas vinculativa e não vinculativa, com a esperança de descobrir candidatos ligante do parasita. TNF é uma citocina encontrados em nível elevado em pacientes com malária cerebral e foi mostrar para induzir a expressão de proteínas de superfície muitas das HBEC-5i (Claessens et al, em preparação e 8, 15, 16). Neste caso, a quantidade de iRBC ligada foi semelhante em HBEC-5i comparação com ativado HBEC-5i. Este &quot;modelo de sequestro&quot; também pode ser usado para estudar a interação molecular entre os iRBC e as células endoteliais, bem como o efeito do suposto anti-citoaderência drogas. Neste caso, recomendamos plating HBEC-5i em poços menores, tais como &quot;slides oito bem-câmara&quot; (BD 354628) ou &quot;CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA).

selection of plasmodium falciparum parasites for cytoadhesion to human brain endothelial cells

A maioria das mortes por malária humana é causada por parasitas do sangue estágio Plasmodium falciparum. Malária cerebral, a complicação mais risco de vida da doença, é caracterizada por um acúmulo de Plasmodium falciparum glóbulos vermelhos infectados (iRBC) na fase trofozoíto pigmentada na microvasculatura do cérebro 2-4. Esta obstrução microvascular (seqüestro) leva à hipóxia, acidose e prejudiciais citocinas inflamatórias (revisto em 5). Seqüestro também é encontrado na maioria dos tecidos microvascular do corpo humano 2, 3. O mecanismo pelo qual iRBC anexar às paredes dos vasos sanguíneos é ainda mal compreendida. O imortalizado Human Brain microvascular linhagem de células endoteliais (HBEC-5i) tem sido usado como um modelo in vitro da barreira hemato-encefálica 6. No entanto, o Plasmodium falciparum iRBC anexar apenas mal ao HBEC-5i in vitro, ao contrário do sequestrat densaion que ocorre em casos de malária cerebral. Por isso, desenvolveu um ensaio panning para selecionar (enriquecer) p. vários cepas falciparum para adesão ao HBEC-5i, a fim de obter populações de alto-binding parasitas, mais representativa do que ocorre in vivo. Uma amostra de uma cultura parasita (mistura de RBC iRBC e não infectadas) na fase de trofozoíto pigmentada é lavado e incubado em uma camada de HBEC-5i cultivados em uma placa de Petri. Após a incubação, o prato é cuidadosamente lavado e livre de uRBC iRBC desacoplado. URBC fresco são adicionadas ao iRBC alguns anexados a HBEC-5i e incubadas durante a noite. Como parasitas estágio esquizonte estourar, merozoítos reinvade RBC e estes parasitas estágio anel são colhidas no dia seguinte. Parasitas são cultivadas até material suficiente é obtida (geralmente 2 a 4 semanas) e uma nova rodada de seleção pode ser realizada. Dependendo do P. falciparum tensão, 4-7 rodadas de seleção são necessários a fim de obter uma populaçãoonde a maioria dos parasitas se ligam a HBEC-5i. O fenótipo de ligação é progressivamente perdida depois de algumas semanas, indicando uma mudança na expressão do gene variante antígeno de superfície, assim, a seleção regulares sobre HBEC-5i é necessária para manter o fenótipo. Em resumo, nós desenvolvemos um ensaio de renderização seleção P. parasitas falciparum uma forma mais &quot;cerebral da malária adesivo&quot; fenótipo. Fomos capazes de selecionar 3 de 4 p. cepas falciparum em HBEC-5i. Este ensaio também tem sido usados ​​com sucesso para selecionar os parasitas para a ligação com humanos dérmica e pulmonar de células endoteliais. Importante, este método pode ser usado para selecionar populações de tecidos específicos do parasita, a fim de identificar ligantes do parasita candidato para a ligação ao endotélio cerebral. Além disso, este ensaio pode ser utilizado para triagem de suposto seqüestro de anti-drogas 7.

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Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para o seqüestro de malária cerebral é descrita<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Glóbulos vermelhos infectados são selecionados para a ligação com células cerebrais humanas imortalizadas microvascular endoteliais. Os parasitas selecionados mostram um fenótipo distinto. O processo de seleção pode ser aplicado usando diversos<em&gt; P. falciparum</em&gt; Cepas e linhagens de células endoteliais.

Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

18.9K visualizações.  University of Edinburgh. Um In vitro Modelo para o seqüestro de malária cerebral é descrita 1. Plasmodium falciparum Glóbulos vermelhos infectados são selecionados para a ligação com células cerebrais humanas imortalizadas microvascular endoteliais. Os parasitas selecionados mostram um fenótipo distinto. O processo de seleção pode ser aplicado usando diversos P. falciparum Cepas e linhagens de células endoteliais.