Primäre Hepatozyten der Maus sind in Leberstudien wichtig. Besonders für den Glukosestoffwechsel und hepatische Drogentests. Zeitlich kann der Isolationsprozess zeitaufwendig und der Energieaufwand sein.
Dieses Protokoll kann eine effiziente Möglichkeit bieten, primäre Hepatozyten der Maus zu isolieren. Es ist zeit- und arbeitsfreundlich. Erfordert nur sehr wenige Schritte mit allen im Handel erhältlichen Regionen.
Beginnen Sie mit der Peristaltikpumpe, um mit dem Pumpen von erwärmtem doppelt destilliertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 4 ml pro Minute für fünf Minuten zu beginnen. Wechseln Sie dann das Pumprohr von Wasser auf erwärmtes Perfusionsmedium. Überwachung der Luftblase zwischen Wasser und Perfusionsmedium.
Wird helfen, den Fluss des Perfusionsmediums durch das System zu verfolgen. Als nächstes desinfizieren Sie den Bauch einer betäubten acht Wochen alten C57 schwarzen 6J weiblichen Maus mit 70% Ethanol. Und schneiden Sie mit einer Schere den Bauch auf, um die Leber, die Pfortader und die Hohlvene inferior freizulegen.
Stoppen Sie dann die Peristaltikpumpe. Nachdem sichergestellt wurde, dass das Pumprohr Perfusionsmedium und kein Wasser enthält. Setzen Sie einen 24-Gauge-Katheter in die untere Hohlvene ein.
Schalten Sie die Pumpe wieder ein und schneiden Sie die Pfortader auf. Während das Perfusionsmedium gepumpt wird, drücken Sie die Pfortader jede Minute, damit die Flüssigkeit jeden Winkel der Leber erreicht. Pumpen Sie etwa drei bis fünf Minuten lang weiter oder bis die ausgespülte Flüssigkeit klar ist.
Als nächstes wechseln Sie das Pumprohr vom Perfusionsmedium zum Kollagenase-Dispasemedium. Und drücken Sie die Pfortader jede Minute, damit die Flüssigkeit jeden Winkel der Leber erreichen kann. Pumpen Sie weiter, bis alle 25 ml des Kollagenase-Dispase-Mediums erschöpft sind.
Als nächstes isolieren Sie die gesamte Leber ohne die Gallenblase. Und legte es in 30 ml Waschmedium in eine Petrischale auf Eis. Mit einer Pinzette die Leber in Stücke reißen, um primäre Hepatozyten in die Lösung freizusetzen.
In diesem Stadium verwandelt sich das Waschmedium in eine trübe Lösung, die freigesetzte primäre Hepatozyten und kleine Leberstücke enthält. Filtern Sie diese trüben Lösung durch ein 70-Mikron-Zellsieb in 20 ml von 1X pro Anruf HBSS in einem 50-ml-Rohr auf Eis. Und mischen Sie die Lösung, indem Sie das Rohr 20 Mal umkehren.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung. Saugen Sie dann in der Gewebekulturhaube den Überstand ab. Und waschen Sie das Pellet mit 30 ml kaltem Waschmedium.
Pelletieren Sie die Zellen erneut mit Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut in 25 ml Kulturmedium. Zählen Sie die Zellen und plattieren Sie sie auf den gewünschten Kulturplatten.
Nach dem Versuchsdesign. Nach der Beschichtung waren isolierte primäre Hepatozyten um eine Stunde fest gebunden und nach 12 Stunden vollständig expandiert. In den isolierten Hepatozyten waren die mRNA-Spiegel von Hepatozytenmarkern wie Transthyretin, CD95, ASGR1 und ASGR2 im Vergleich zur gesamten Leber signifikant erhöht.
Im Gegensatz dazu war die Präsenz von Immunzellen, Sternzellen und Endothelzellen geringer. Wie durch eine starke Abnahme der CD45-, Kollagentyp-1-alpha-1- und Endothelzell-2-Kinase 2-mRNA-Spiegel belegt wird. Dies deutet darauf hin, dass dieses Protokoll die Interferenz durch andere Leberzellen erheblich reduzieren kann.
Nach der Beschichtung nahmen die ASGR1- und ASGR2-Spiegel mit der Zeit ab, bleiben aber bis zum 12-Stunden-Zeitpunkt mit der gesamten Leber vergleichbar. Speziell für ASGR1. Das Expressionsniveau des membrangebundenen CD81 war bis zu 48 Stunden lang konstant.
Im Vergleich dazu nahm die Expression des Toll-like-Rezeptors 4 im Allgemeinen zu und wurde nach 48 Stunden höher als die In-vivo-Spiegel. Insulinsensitivitätstests zeigten, dass Insulin die Phosphorylierung beider AKT bei Serin 473 signifikant förderte. Und Gabelkopfkasten 01 bei Serin 256, in den Hepatozyten.
Anzeige der Empfindlichkeit der primären Hepatozyten gegenüber Insulin. Die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Proteinspiegel stiegen nach der Behandlung mit Glucagon signifikant an. Dies deutet darauf hin, dass der Glukoseproduktionsweg aktiviert wurde.
Diese Aktivierung wurde durch eine erhöhte Glukoseproduktion weiter bestätigt. Und mit anderen Stimulatoren für die Glukoseproduktion wie Forskolin + IBMX. Dieses Protokoll kann sowohl Zeit als auch Energie für Studien mit primären Hepatozyten der Maus sparen.
Nach diesem Protokoll können verwandte Experimente wie der hypothetische Glukosestoffwechsel und pharmazeutische Biomarker-Assays durchgeführt werden.
