Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen in Bezug auf die Rolle der extrazellulären Vesikel in vivo zu beantworten, indem sie uns eine Quelle von Vesikeln zur Verfügung stellt, die für die lokale Gewebemikroumgebung repräsentativ sind. Studien über extrazelluläre Vesikel im Gewebemilieu können unser Verständnis der physiologischen Rollen von extrazellulären Vesikeln und deren Veränderungen in pathophysiologischen Prozessen in vivo fördern. Eine visuelle Demonstration der Portalvenenkannulation ist hilfreich, da die geringe Größe der Vene es schwierig macht, manipulieren zu können.
Die Demonstration des Verfahrens mit Doktor Kaori Ishiguro wird Irene Yan, eine Forschungstechnologin aus meinem Labor, zeigen. Vor Beginn des Eingriffs sichern Sie die Gliedmaßen einer anästhesierten Maus und verbinden Sie die 23-Spur-Nadel einer geflügelten Blutentnahme, die an das freie Ende eines Stücks Spritzenpumpenschläuche angeschlossen ist. Reinigen Sie die Bauchhaut der Maus mit 70% Ethanol und einem Alkoholpad und verwenden Sie eine Schere, um die Maus vom vorderen Teil der Brust bis zum Beckenknochen zu öffnen, wobei darauf geachtet wird, keine inneren Organe zu beschädigen.
Verwenden Sie einen Baumwolle gekippt Applikator, um sanft den Darm auf die rechte Seite der Bauchhöhle zu bewegen, um die Portalvene und minderwertige Vena cava auszusetzen und mit gekrümmten Zangen einen Faden unter die Portalvene zu legen. Binden Sie einen Knoten lose in die Naht, um für cinching nach der Kanüle vorzubereiten und füllen Sie die Kanüle mit 40 Grad Celsius HBSS, bis die Lösung die Kanülennadelspitze erreicht. Setzen Sie die Kanüle fünf bis zehn Millimeter unter der Ligatur in die Portalvene ein und sichern Sie die Kanüle mit der Naht.
Beginnen Sie die Infusion mit einem Durchfluss von ein bis zwei Millilitern pro Minute. Wenn die Kanüle richtig platziert wurde, beginnt die Leber zu blanchieren. Schneiden Sie die minderwertige Vena cava und lassen Sie die übermäßige Flüssigkeit in der Leber abfließen.
Erhöhen Sie den Durchfluss langsam auf acht Milliliter pro Minute, bis in den nächsten fünf Minuten ganze 50 Milliliter HBSS durch die Leber durchdrungen sind. Kurz bevor die HBSS ausläuft, ändern Sie frisch zubereitete 40 Grad Celsius Kollagenase vier Lösung auf die Perfusate Becher und verwenden Zangen, um vorübergehenden Druck auf die untere Vena cava in fünf Sekunden Intervallen anzuwenden, um die Leber anschwellen zu lassen und bei der Gewebeverdauung und Dissoziation zu helfen. Mit fortschreitender Verdauung wird die Leber anschwellen und weiß werden.
Wenn die nach sanfter Sondierung mit einem wattestgekippten Applikator gedrückt bleibt, stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie die Kanüle. Entfernen Sie die Gallenblase aus der Leber, achten Sie darauf, nicht das Gallenblasengewebe zu reißen, und verwenden Sie saubere Schere und Zangen, um die Leber in eine sterile 10-Zentimeter-Kulturschale von PBS zu ernten. Nach dem sanften Waschen, übertragen Sie die Leber in eine neue 10-Zentimeter-Kulturschale mit frischer Kollagenase vier Lösung und verwenden Sie zwei saubere Zangen, um die Leber zu reißen, während sanft schütteln, um die Zellen aus dem Lebergewebe zu trennen.
Wenn das gesamte Organ fragmentiert ist, verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, um die Gewebeschlämme zu trituieren, bis die unverdauten Leberstücke abgeschüttelt werden. Gießen Sie die resultierende Zelllösung durch ein 70 Mikron Nylon-Netzsieb in ein 50 Milliliter konisches Rohr, waschen Sie die Schale mit HBSS, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Die Wäsche mit der Einzelzellsuspension bündeln und die Hepatozyten durch Zentrifugation entfernen.
Dann den Überstand auf ein neues 50-Milliliter-Rohr übertragen. Um andere Zellen zu entfernen, zentrieren Sie den Überstand, bevor Sie ihn in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr übertragen. Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen mit einer weiteren Zentrifugation und übertragen Sie den Überstand in ein rundes Bodenrohr, um Zellablagerungen und Aggregate zu entfernen.
Übertragen Sie nun den Überstand in ein Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr und setzen Sie das Pellet in etwa 20 Milliliter PBS für eine zweite und letzte Ultrazentrifugation wieder auf. Dann setzen Sie das extrazelluläre Nanovesiklepellet in einem Milliliter PBS für minus 80 Grad Celsius Speicher wieder auf, wenn die Vesikel nicht sofort analysiert werden. Von einer einzigen Mausleber ergibt diese Methode eine extrazelluläre Bläserkonzentration im Gewebe, die von 1,74 bis viermal 10 bis zum zwölften mit einem Mittelwert von 3,46 mal 10 bis zu den zwölften Partikeln pro Milliliter reicht, wie durch Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt.
Die mittlere Größe der isolierten extrazellulären Vesikel des Lebergewebes beträgt 157,7 Nanometer mit einer Modusgröße von 144,5 Nanometern und extrazellulären Vesikelgrößen von 100 bis 600 Nanometern durch Nanopartikel-Tracking-Analyse. Die extrazellulären Vesikel, die mit diesem Ansatz isoliert werden, eignen sich für nachgelagerte Anwendungen, und die weitere Charakterisierung kann morphologische Bewertungen durch Elektromikroskopie oder Analyse ihrer Oberflächenmarker oder Ihres Gehalts umfassen.
