Name: high-resolution optical mapping of the mouse sino-atrial node
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
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Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichung Nr. 80-23) durchgeführt. Alle Methoden und Protokolle in diesen Studien verwendet wurden von der University of Wisconsin Animal Care und Verwenden Protokoll Ausschuss nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren veröffentlicht von NIH (Veröffentlichung Nr 85-23, überarbeitet 1996) genehmigt. Alle Tiere in dieser Studie verwendeten erhielt humane Pflege im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Herzentfernung und Langendorff-Perfusion <ol><li> Vor der Herzisolierung, warm Tyrode-Lösung auf 37 ° C durch ein Wasserbad und einen Wassermantel verwendet wird. </li><li> Anesthetize die Maus mit 5% Isofluran / 95% O 2. </li><li> Stellen Sie sicher, angemessene Höhe der Anästhesie durch den Verlust der Schmerzreflex zu überprüfen. </li><li> Führen Sie Thorakotomie. Öffnen Sie die Brust durch die Verwendung gekrümmter 5,5 &quot;Mayo Schere und 5,5&quot; Kelly hämostatische fürCEPS ein 1 cm an der Vorderseite des Brustkorbs zu schneid machen. <ol><li> Schnell extrahieren das Herz aus der Brust (innerhalb von 30 Sekunden). Verwenden Sie 4 &quot;gekrümmten Iris Zange das Lungengewebe zu greifen und die Lunge, Thymus und Herz ausgeschnitten zusammen mit dem Herzbeutel mit 4.3&quot; Iris Schere. Nicht direkt das Herz zu greifen. </li><li> Waschen Sie es in oxygeniertem (95% O 2/5% CO 2), konstanter Temperatur (36,8 ± 0,4 ° C) modifizierte Tyrode-Lösung. Verwenden Sie die folgende Lösungszusammensetzung (in mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 20,0 NaHCO 3 und 11,1 Glukose (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Während in der gleichen Lösung getaucht, identifizieren die Lunge, Thymus und Fettgewebe. sezieren sie vorsichtig aus dem Herzen. Verwenden gebogen 3 &quot;Vannas-Tübingen Schere und 4.3&quot; # 5 Pinzette. </li><li> Dann die Aorta identifizieren und kanülieren es auf einem maßgeschneiderten 21 G Kanüle. Verwenden Sie zwei gekrümmten 4.3 &quot;# 5B Kraftps. </li><li> gleichzeitig perfundieren nach Kanülierung (durch die Kanüle mit einer Strömungsgeschwindigkeit von ~ 5 ml / min, das auf der Grundlage der Aortendruck eingestellt werden sollte, siehe unten) und superfuse (in dem Bad bei einer Strömungsgeschwindigkeit von ~ 50 ml / min) das Herz mit erwärmtem und Tyrode-Lösung während des gesamten Experiments filtriert. Übergeben Sie die Perfusionslösung durch eine in-line 11 &amp; mgr; m Nylonfilter zur Verstopfung der koronaren Zirkulation verhindern. </li><li> Verwendung eines Druckwandlers (oder ein Manometer) verbunden ist über ein 3-Wege-Hahn Luer Lock mit dem Perfusionsleitung, überwachen den Aortendruck und halten es zwischen 60 und 80 mmHg. Passen Sie Ihre Geschwindigkeit Perfusion bei Bedarf die Aortendrucks in diesem Bereich zu halten. </li></ol> 2. Optische Kartierung des SAN aus dem Langendorff-perfundierten ganzes Herz <ol><li> Instrumentierung <ol><li> Legen Sie das Herz horizontal und stecken die Herzspitze an den silikonbeschichteten Boden der Kammer mit 0,1 mm Durchmesser Stifte prevent Strom-induzierte Bewegung während des Experiments. 12 </li><li> Legen Sie eine kleine (0,012 &quot;ID x .005&quot;) Silikonschlauch in den linken Ventrikel (LV) über die Lungenvenen, die linken Vorhofs (LA) und die Mitralklappe (MV). Befestigen Sie das Rohr durch ein Seidenfaden (4-0) mit dem klingender Bindegewebe. </li><li> Positionieren Sie das Herz mit seiner hinteren Seite nach oben (Abbildung 1A, linkes Feld). </li><li> Pin der Kante des RA Anhängsel (RAA) mit dem Silizium Boden der Kammer unter Verwendung von 0,1 mm Durchmesser minutien Pins. Stellen Sie das Niveau, um die hintere Fläche des RA flach zu machen und ermöglichen es der Kamera Fokusebene befinden. Dies wird optischen Messungen aus der maximalen Fläche des Atriums ermöglichen. </li><li> Noose superior (SVC) und inferior (IVC) Hohlvene durch einen Seidenfaden (4-0), strecken und stecken Sie das andere Ende des Fadens auf dem Boden einer silikonbeschichteten Kammer (siehe 3A). Stellen Sie sicher, dass die Nähte nicht blockieren dieoptische Sehfeld. </li><li> Legen Sie die maßgeschneiderte Stimulationselektrode, die auf dem Rand des RAA. Elektroden herzustellen, zu verwenden Silizium 0,25 mm Durchmesser Silberdrähte mit 0,5 mm Abstand zwischen den Elektroden und frei von Silizium für eine Länge von 1 mm an der Stimulations Ende beschichtet. Dann werden zwei EKG-12 mm-Nadel legen (29-Gauge) monopolaren Elektroden in der Nähe der Basis des rechten und linken Ventrikels. Platzieren Sie den Boden EKG-Elektrode in der Nähe der Spitze der Ventrikel. </li></ol></li><li> Die Färbung <ol><li> Da beide Fluoreszenzfarbstoffe und elektromechanische Entkupplungsgleise blebbistatin lichtempfindlich sind, führen alle Verfahren unten in einem dunklen Raum beschrieben. Erste spannungsempfindlichen Farbstoff RH-237 oder Di-4-ANNEPS als Stammlösung, 1,25 mg / ml in Dimethylsulfoxid (2,5 mM) herzustellen, aliquoten es (30 &amp; mgr; l pro Stück) und speichern Sie die Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Verdünnen 5-10 ul Farbstoff-Stammlösung in 1 ml erwärmt (37 ° C) Tyrode-Lösung und dann spritzen sie in die Koronarperfusion Linieüber einen Zeitraum von 5-7 min ein Inline-Luer-Injektionsanschluss verwenden. </li><li> Bereiten Sie blebbistatin als Stammlösung (2 mg / ml in Dimethylsulfoxid, 6,8 mM) im Voraus und lagern bei 4 ° C. </li><li> Nach 20 min Stabilisierung, 0,5 ml erwärmter (37 ° C) blebbistatin im Perfusat und 0,1 ml blebbistatin in 1 ml erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung verdünnt. Dann spritzen in die Koronarperfusion Linie über einen Zeitraum von 5-7 min unter Verwendung eines in-line Luer Injektionsöffnung. </li></ol></li></ol> 3. Optische Kartierung des SAN aus dem isolierten Atrial Vorbereitung <ol><li> Instrumentierung <ol><li> Für die isolierten Vorhof Vorbereitung, zu isolieren und das Herz kanülieren wie in den Schritten 1.1-1.5 für Ganz Herz Vorbereitung oben beschrieben. </li><li> Präparieren Sie die Ventrikel weg von der vorderen Seite. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 1 für weitere Einzelheiten. </li><li> Öffnen Sie die RA durch Schneiden durch die tricuspid vaLVE (TV) entlang der TV-SVC-Achse. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 2 für weitere Einzelheiten. </li><li> Schneiden Sie den medialen Teil des Crista terminalis die RAA zu öffnen. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 3. </li><li> Öffnen Sie die vordere atriale freie Wand durch einen Schnitt von der Mittellinie des vorigen Schnitt # 3 an den Rand des rechten unteren Ecke des RAA Durchführung, glätten und stecken die atriale freie Wand auf dem Boden eines silikonbeschichteten Kammer. Siehe die Richtung , die durch den hohlen Pfeil in 1A gezeigt ist , schneiden # 4. Bewahren Sie einen Rand von ventrikulären Gewebe für Pinning die Vorbereitung Schäden an den Vorhöfen zu verhindern. </li><li> In ähnlicher Weise offen LA durch entlang der MV-oberen Ecke des LA Anhängsel (LAA) durch den MV zu schneiden. </li><li> Zum Öffnen des LAA, aus der Mitte des geöffneten LAA geschnitten, durch die vordere atriale freie Wand, bis in der Nähe eines mittleren Rand des LAA. </li><li> Öffnen Sie die vordere atriale freie Wand aloin die gleiche Richtung ng, dann abflachen und an der Unterseite eines Sylgard beschichtet Kammer fixieren. </li><li> entfernen teilweise die interatrial septalen Gewebe. Dadurch wird eine Streuung des optischen Signals von Gewebe zu reduzieren, die nicht im Fokus ist. Daher sind sowohl die LA und RA sowie die SAN und atrioventrikuläre Übergang (AVJ) zugänglich sind , in dieser Zubereitung (1B). </li><li> Heben die Endzubereitung von etwa 0,5 mm von der Unterseite des Silizium-beschichteten Kammer auf, um zu ermöglichen Superfusions sowohl epikardialen und endokardialen Oberflächen. </li><li> Superfuse die Herstellung mit erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung bei einer konstanten Rate von ~ 12 ml / min für eine gezielte Strömung in der Nähe der SVC und ~ 30 ml / min für ein Bad Superfusions. </li><li> Legen Sie die maßgeschneiderte Stimulations Ag / AgCl 2 Elektrode (0,25 mm Durchmesser) am Rande des seziert RAA. Dann werden zwei EKG-12 mm-Nadel legen (29G) Elektroden (monopolare) in der Nähe des RAA und LAA sind. Legen Sie den Boden EKG wählenritt in der Nähe des AVJ. </li></ol></li><li> Die Färbung <ol><li> Durchführen einer direkten Anwendung der spannungsempfindlichen Farbstoff (RH-237 oder di-4-ANNEPS). Hierzu 1-2 ul der Farbstoffstammlösung in 1 mm erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung verdünnt und lösen sich langsam die verdünnte Farbstoff auf der Oberfläche der Zubereitung durch eine 1 mm Pipette. </li><li> Alternativ führen atrial Färbung mit dem spannungsempfindlichen Farbstoff durch eine koronare Perfusion des Langendorff perfundierten Herzen ähnlich der oben für die Vollherz Zubereitung beschrieben (Schritte 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Nach der Koronarperfusion Färbung, isolieren die atriale Zubereitung wie beschrieben. Führen Färbung zusätzliche Oberfläche, wenn eine zufriedenstellende Fluoreszenzniveau zu erreichen benötigt. Schnellvorhof Isolation bleichen den Farbstoff nicht und wirkt sich nicht auf die Qualität der Färbung. </li></ol></li><li> Immobilisieren der Präparation mit dem elektromechanischen Entkoppler, blebbistatin. Verdünnen Sie 3-5 ul blebbistatin Stammlösung im wärmten (37 ° C) Tyrode-Lösung und lassen Sie langsam die verdünnte blebbistatin auf der Oberfläche der Zubereitung und der umgebenden Lösung. Da blebbistatin wurde Licht lichtempfindlich, 13,14 Vermeiden Sie lange Aussetzung während der Herstellung und Färbung gezeigt werden. </li><li> Führen Sie zusätzliche blebbistatin Anwendung so viel wie nötig Kontraktion zu unterdrücken. Normalerweise können bis zu 3 zusätzliche Anwendungen (3-5 &amp; mgr; l pro jede Anwendung) kann die Bewegungsartefakt ausreichend, um genau zu rekonstruieren, SAN und Vorhofaktivierung zu unterdrücken. </li><li> Fügen Sie weitere 0,5 ml erwärmt blebbistatin im Perfusat. Während dieser Prozedur unterbrechen die Superfusions für 30 sec die Farbstoff / blebbistatin zu färben das Vorhofgewebe zu ermöglichen. </li></ol></li></ol> 4. Optische Mapping einrichten HINWEIS:. Eine detaillierte Beschreibung des optischen Abbildungssystems wird an anderer Stelle 12 vorgesehen ist <ol><li> Verwenden Sie eine Kamera mit einem Temporal Auflösung von 2000 Bildern / s oder höher, und eine Reihe von Kondensorlinsen räumlichen Auflösung von 100 &amp; mgr; m / Pixel oder höher zu erreichen. Dies ist erforderlich, SAN-Aktivierung und Vermehrung intranodal zu rekonstruieren. </li><li> Um Bewegungsartefakte aus der vibrierenden Lösung, fix ein kleines Deckglas auf der Oberfläche der Lösung über das Herz / isolierte atriale Vorbereitung reduzieren. </li><li> Verwenden Sie Anregungslicht (520 ± 45 nm Wellenlänge), die durch einen Konstantstrom, Low-Noise-Halogenlampe. Richten Sie die gefilterten Lichtstrahl auf die Herstellung durch ein flexibles gegabelten Lichtleiter verwendet wird. </li><li> Filtern Sie die emittierte Fluoreszenz durch ein Langpassfilter (&gt; 715 nm). Sammeln, zu digitalisieren und das erworbene Fluoreszenzsignal auf einem Computer mit Software, die von der Kamera-Herstellers zu speichern. </li></ol> 5. Datenverarbeitung Hinweis: Das optische Abbildungsdaten gesammelt und als eine Reihe von Matrizen von Fluoreszenzintensität bei verschiedenen Zeitpunkten gespeichert. Jedes Pixel represengen ein Maß für die Fluoreszenzintensität von einer bestimmten Stelle auf der Gewebepräparation zu einem bestimmten Zeitpunkt gesammelt. Die Hintergrundfluoreszenz wird automatisch pro Pixel entfernt zur besseren Visualisierung von Fluoreszenzänderungen durch Membranspannungsänderungen erzeugt zu ermöglichen und umgekehrt mit Aktionspotentiale (APs) von Mikroelektroden-Systeme gemessen entsprechen. Informationen über die verschiedenen Schritte bei der Verarbeitung von optischen Bilddaten, einschließlich Bildsegmentierung, räumliche Filterung, zeitliche Filterung und Basisliniendrift Entfernung, in der Schwerpunktprüfung zur Verfügung gestellt. 15 <ol><li> Manuell oder durch den speziellen Algorithmus (beispielsweise eine Schwellwertbildung oder Kantendetektion) 15 Gewebegrenzen , um zu bestimmen, Erstellen einer binären Maske von 1 (eingeschlossen Pixel) und 0 (ausgeschlossen Pixel) und die Maske in der Sequenz zu jedem Rahmen. Dieser Prozess erzeugt ein binäres Bild, das Bereiche von Interesse für die weitere Verarbeitung hervorhebt. </li><li> Zur Verbesserung der Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Optschen Daten, filtern die Signale innerhalb der ausgewählten Bereiche von Interesse. Hierzu verwenden räumliche (dh Mittelung von benachbarten fluoreszierenden Bildpunkte , wie durch einen gewünschten Faltungs bin oder kernel definiert, beispielsweise 3 x 3 oder, für verrauschte Daten, 5 x 5) und / oder zeitliche Filterung (beispielsweise Butterworth, Chebyshev - Typ 1, Chebyshev - Typ 2, Elliptic etc.) (Abbildung 2). Halten Sie die Möglichkeit, gefiltert induzierten Artefakte im Auge, wenn die Daten zu interpretieren. Weitere Informationen finden Sie Bewertung. 15 </li><li> Entfernen Drift der Basislinie in optischen Aufnahmen bei Bedarf (durch Hochpassfilterung oder Polynomanpassung zum ursprünglichen Signal verwendet wird) und dann normalisiert jedes Pixelsignal von 0 (minimaler Fluoreszenz) bis 1 (maximale Fluoreszenz). </li><li> Wählen eines Zeitfensters, das die Aktivierungszeiten aller Pixel für einen einzelnen AP Ausbreitungs umfasst. Zuordnen jedes Pixel seine Aktivierungszeit als die Zeit der maximalen Aufwärtshub Derivat (dF / dt max, wobei F fluorescen istce Intensität). Unter Verwendung aller Pixelaktivierungszeiten, rekonstruieren die isochronen Aktivierungskarte. Jedes isochron zeigt somit die Pixel zur gleichen Zeit aktiviert. </li><li> Um die AP Dauer (APD) Verbreitungskarte rekonstruieren, für jedes Pixel die Dauer zwischen der Aktivierungszeit und der Zeit auf einer bestimmten Ebene der Repolarisation berechnen (beispielsweise bei 80% der Repolarisation, APD 80). Mit allen APD Pixelwerte, rekonstruieren die APD Verteilung isochronen Karte. Jedes isochron zeigt somit die Pixel mit der gleichen APD. </li><li> Um die Leitungsgeschwindigkeit für AP Ausbreitung berechnen, passen eine Oberfläche der Vorbereitung auf die Aktivierungszeit-Daten berechnet in 5.4. Verwenden Sie hierzu Polynomfläche Anprobe oder lokale Glättungskerns Oberfläche und dann Geschwindigkeit lokale Leitungsvektoren aus dem Gradienten der angepassten Oberfläche berechnen. </li><li> Um die Repolarisation Karte zu erstellen, so dass jedes Pixel seine Repolarisation Zeit zuweisen, wie das Maximum der zweiten Ableitung definiert (d 2 F / dt2) des optischen Signals am Ende des OAP, oder die Zeit von 90% Repolarisation. </li></ol>

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Hier präsentierten wir zwei Arten von Maus SAN Vorbereitungen: 1) intakte SAN in der Langendorff-perfundierten ganzen Herzen, und 2) SAN in der isolierten, geöffnet Vorhof Vorbereitung. Diese beiden Arten der Vorbereitung dienen unterschiedlichen experimentellen Zwecken. In der Langendorff perfundierten ganze Herz Herstellung wird das intakte atrial Struktur erhalten , welche es ermöglicht , komplexe atrialen Arrhythmien wie Vorhofflimmern sowie Wechselwirkungen zwischen dem SAN und Atrium während einspringenden Tac...

Novel scientific breakthroughs that lead to leaps in the understanding of human physiology are often preceded by technological advances. Fluorescent optical mapping, for example, enables investigation of multiple physiological parameters in both cells and tissues.1,2 It significantly improved our understanding of how the anatomical structure is associated with electrophysiological functions and dysfunctions. In the heart, the natural pacemaker and conduction systems such as the sinoatrial node (SAN) and the atrioventricular junction consist of nodal myocytes that are insulated by the surrounding atrial myocytes.3-5 Such organization creates complex three-dimensional structures with specialized electrical properties. Both structural and functional remodeling of these pacemaker structures has been recognized to form significant electrophysiological heterogeneities.6,7 Understanding the mechanism underlying how such heterogeneities result in SAN dysfunctions and atrial arrhythmogenesis will dramatically benefit the clinical treatment of these diseases. It requires a technique to visualize the propagation of electrical signals at the tissue level, such as optical mapping. 
Recently, accumulating evidence has proven the advance of optical mapping in studies of atrial electrophysiology and pathology.2 However, novel and rigorous studies are dependent on the accurate interpretation of experimental data, whose validity and stability rely on careful experiment protocols. Genetically modified mice are extensively used for research as animal models of human diseases including sick sinus syndrome, pacemaker abnormalities and atrial arrhythmias.6,8-11 Thus, a combination of fluorescent optical mapping with transgenic mouse models provides a powerful tool to study cardiac electrical abnormalities associated with various pathologies. In this paper, we present a protocol for high-resolution optical mapping of the mouse SAN and atrium. Specifically, we discuss and compare different dye loading approaches, time effects on dye bleaching and heart rate stability during the experiment.

<table><tbody><tr><td>water jacket</td><td>Radnoti</td><td>1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures</td><td></td></tr><tr><td>water bath / circulator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>pressure amplifier</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Nylon Net Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>Pressure transducer</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Superfusion pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tubingen scissors&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Mayo scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hemostatic forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>Iris forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)&amp;nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>in-line Luer injection port</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOS camera&amp;nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>halogen lamp</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution optical mapping of the mouse sino-atrial node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Optische Kartierung des Intact SAN aus dem Langendorff-Herz perfundiert Ein typisches Beispiel für eine RA Aktivierungskonturkarte für spontane Sinusrhythmus rekonstruiert wird in Figur 3 für eine Langendorff perfundierten Herzen der Maus gezeigt. Die frühe Aktivierungspunkt innerhalb des intercaval Region in der Nähe des SVC befindet , wo die SAN ist anatomisch definiert. 3,16 Zwei RA Aktivierung Umrißkarten bei 1,0 und 0,5 ms Ab...

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High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die optische Abbildung der elektrischen Aktivität aus dem rechten Vorhof Maus und vor allem die sinuatrialer Knoten, mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung.

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

high-resolution-optical-mapping-of-the-mouse-sino-atrial-node

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health.  Hier präsentieren wir ein Protokoll für die optische Abbildung der elektrischen Aktivität aus dem rechten Vorhof Maus und vor allem die sinuatrialer Knoten, mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung. 

Serie: High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Forschung

Biotechnik

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

High-Resolution Endocardial und Epikardiale Optical Mapping in ein Schaf Modell Stretch-Induced Vorhofflimmern

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

Medizin

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologie

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Lichtblattmikroskopie und Gewebereinigung für eine umfassende kardiale Bildgebung

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Author Spotlight: Maßgeschneiderte Light-Sheet-Bildgebung zur Untersuchung von Myokardstrukturen in Nagetierherzen

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Whole-Mount Immunfluoreszenz-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Rekonstruktion des sinus- und atrioventrikulären Knotens in der Maus

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

High-Resolution Endocardial und Epikardiale Optical Mapping in ein Schaf Modell Stretch-Induced Vorhofflimmern

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Whole-Mount Immunfluoreszenz-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Rekonstruktion des sinus- und atrioventrikulären Knotens in der Maus

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen