Diese Arbeit wurde durch Grant No finanziert. 0723341 (für KGL) von der National Science Foundation. Wir sind auch dankbar für die Beiträge von den Schapiro Undergraduate Research Fellowship-Programm und die Abteilung für Psychologie an Randolph-Macon Hochschule zur Verfügung gestellt. Schließlich schätzen wir Craig Kinsley kollaborativer Beiträge in diesem Forschungs-und Amanda Rzucidlo Hilfe bei der Vorbereitung der R-MC-Labor für dieses Video Artikel.

1. Identification of Animal Modell <ol><li> Die California Deer Mouse (Peromyscus californicus) ist ein ideales Modell, um väterliche Reaktionen zu erforschen. Wie Sie sehen, Pfleger diese Maus die Welpen ebenso wie die Mütter tun - sie haben sogar kriechen über sie, so dass es wie die Welpen stillen sucht. Das Verhalten der California Mäusen ist es, eine Art derselben Gattung, die gemeinsame Rehe Maus (Peromyscus maniculatus), die wenig Interesse an den Welpen Ausstellungen, oft auf der Flucht oder gar angreifen verglichen. (Siehe Abbildung 1 für die Bilder von diesen Arten der Interaktion mit Welpen.) </li><li> Sobald die Spezies-Modell identifiziert wurde dann die verschiedenen Gruppen müssen noch festgelegt werden. In dieser Studie werden biologische Väter, Jungfrauen ohne Eltern erleben, und Jungfrauen mit beschränkter pup Exposition (Welpe ausgesetzt oder Pflegeeltern Väter) der beiden Arten, so dass beide veranlagt und erwarb väterliche Merkmale beurteilt werden kann, verwendet. In diesem speziellen Studie, die wir auch alle Gruppen, um ein Spielzeug Maus pup, um sicherzustellen, dass die sozialen Interaktionen spezifisch für ein Welpe und nicht um eine repräsentative Antwort auf alles in den Käfig gesetzt wurden ausgesetzt (siehe Abbildung 2). </li><li> Vor der Untersuchung neurobiologische Faktoren ist es wichtig, zu bestätigen, dass die ausgewählten Arten deutliche Unterschiede im Verhalten von Interesse zu zeigen. In dieser Studie sind Männer in einem Käfig mit einem Welpen für fünf Minuten und eine väterliche Verhalten Ethogramm (siehe Tabelle 1 zum Beispiel der Ethogramm) gelegt wird ein Tor Verhaltensweisen wie Latenz verwendet werden, um den Welpen und viel Zeit in Kontakt mit abgebrannten Ansatz den Welpen. Wenn aggressive Reaktionen beobachtet werden, ist der Welpe sofort entfernt. Diese Sitzungen sind oft auf Video aufgezeichnet, so eine sorgfältige Verhaltensanalyse später durchgeführt werden können. </li></ol> 2. Vorbereitung Gehirngewebe <ol><li> Nach einer Standard-Perfusion jeder Maus (Protokoll im Anhang), sind die Köpfe, so dass sie zu zerschneiden in den speziellen Bereich von Interesse (zeige Gehirn) entfernt. </li><li> Eine Standard-Maus Hirnatlas (zeige atlas) dient dazu, die Nucleus paraventricularis im Hypothalamus, einem Gebiet reich an Zellen, die das Neuropeptid von Interesse in dieser Studie zu finden - Vasopressin (AVP). </li><li> Das Gehirn ist dann gesperrt und auf einem Einfrieren Futter, so dass das Gewebe vor dem Schnitt mit dem Mikrotom einfrieren wird. Das Hirn ist im Schnitt in ein Trimm-Modus, bis bestimmte Landmarken identifiziert werden, dann ist die spezifische Gehirn Dicke 30 Mikron in diesem Fall ist für das Gehirn Abschnitte für die Analyse verwendet wird. </li><li> Das Gehirn Abschnitte sind sorgfältig in Well-Platten mit Phosphatpuffer (PBS) gefüllt; (Protokoll für PBS beigefügt; Bitte beachten Sie, dass dies nur ein Beispiel für eine Standard-Immunzytochemie Protokoll). </li></ol> 3. Immunzytochemie <ol><li> Während die verschiedenen Schritte dieses Prozesses (siehe beigefügte Protokoll), ist es wichtig, genaue Pipettieren Fähigkeiten, um genaue Messungen von Chemikalien und anderen Zutaten wichtig sicherzustellen, für diese Technik (zeige Schüler Pipettieren) haben. </li><li> Der erste Schritt in diesem Prozess ist das Waschen der Gehirne, die anstelle der PBS in der Well-Platten drei vor fünf Mal beinhaltet, zwischen jedem Waschgang die Well-Platten sind auf einer Wippe für 10 Minuten gelegt (show Schüler ersetzen PBS und Platzierung Well-Platten auf Rocker) . </li><li> Die Hirnschnitten werden dann an den primären Antikörper-Lösung ausgesetzt und bei 4 ° C über Nacht auf der Wippe (show-Prozess). </li><li> Nach einem weiteren Waschschritt werden die Hirnschnitten zu einem sekundären Antikörper für eine Stunde auf der Wippe bei Raumtemperatur ausgesetzt, dann erneut gewaschen. </li><li> Als nächstes werden die Gehirne sind zu einem Avitin-Biotin-Komplex-Lösung für die Visualisierung der neurochemischen-positive Zellen herzustellen ausgesetzt. </li><li> Für die endgültige Visualisierung Schritt werden die Gehirne DAB ausgesetzt. Dies ist ein gefährliches Produkt und sollte immer mit Vorsicht behandelt werden. Wie hier zu sehen, beginnen die Hirnschnitten zu dunkler vor Ihren Augen (show-Prozess). </li><li> Nach dem DAB Exposition, die Gehirne durch die letzte Reihe von Waschungen zu gehen und sich dann vorsichtig auf subbed Objektträger gebracht und über Nacht trocknen gelassen (zeige die Platzierung einer Hirnschnitt auf einer Folie, siehe Anlage subbed Folien-Protokoll). </li><li> Die Objektträger werden dann durch eine Reihe von destilliertem Wasser und Alkohol wäscht gelöscht, endlich in Citrosolv bevor sie eingedeckt und in einer SlideBox zur sicheren Aufbewahrung (zeigen verschiedene Aspekte dieses Prozesses, siehe Anhang für das Clearing-Verfahren) gespeichert unter Wasser. </li></ol> 4. Neuroquantification <ol><li> Nach dem Objektträger getrocknet sind, können sie mit spezialisierten neuroquantification Software beurteilt werden. Hier Bioquant Software wird verwendet, um den Vasopressin-positive Zellen und Fasern in den Nucleus paraventricularis der Mäusehirne quantifizieren (show-Software auf dem Bildschirm ... und Mikroskop). </li><li> Die spezifischen Bereich von Interesse ist, die anhand des Messmöglichkeitender Software, um das Gesichtsfeld für neuroquantification etablieren. Es ist wichtig, dass eine konsistente visuelle Feldgröße für jedes Tier wird quantifiziert (zeige Schüler tun). </li><li> Hier werden die dunkel gefärbten Vasopressin-immunreaktive Zellkörpern und Fasern sind erkennbar. Weil es schwierig ist, zu zählen oder zu verfolgen dieses Gewebe, verwendet ein spezielles Merkmal dieser Software Licht Schwellenwert für die Gesamtmenge der positiv gefärbten Gewebe innerhalb des angegebenen Bereichs von Interesse zu bestimmen. Dieser Schwellenwert erzählt uns, wie viel von den angegebenen Bereich enthalten Vasopressin-positive Gewebe (zeigen die Daten, Wert auf dem Bildschirm). </li></ol> 5. Behavioral Analysis <ol><li> Wenn mehr als ein Beobachter Scoring wird die Videobänder, ist es wichtig, Interrater-Reliabilität zu etablieren, um sicherzustellen, dass die Beobachter sind Scoring das Verhalten in einer konsistenten Art und Weise. Für die eigentliche Scoring-Sitzung sollte ein Verhaltens-Scoring Blatt bereit, für eine einfache Scoring-Verhalten während der Beobachtung Sitzungen zu ermöglichen (siehe Tabelle 2 zum Beispiel von Scoring-Tabellenkalkulation) werden. </li><li> Für Verhaltensweisen, die nicht schnell episodischen Reaktionen kann ein Mikrosequenzierung Analyse zeigen Feinheiten über den Verlauf der spezifischen Reaktionen. Zum Beispiel, Fellpflege Verhalten besteht aus einer Kette von sehr schnellen Antworten. Obwohl eine Option ist, einfach erfassen das Vorhandensein und die Dauer der Pflege, ist eine andere, die Kette der Ereignisse zu dieser Reaktion zu dokumentieren. Mit dieser Mikrosequenzierung Software Score Beobachter die Anwesenheit eines bestimmten Verhaltens jeder zweite, wie von der Software (show-Software und Video) dazu aufgefordert werden. </li><li> Nach der Datenerhebung werden die Parameter von Interesse bestimmt und die entsprechenden Verhaltensweisen Noten werden analysiert. Beispiele können Gesamtdauer der Zeit in Kontakt mit den Welpen, oder die Anzahl der Störungen in der Pflege-Sequenz (zeige Computer mit Tabellenkalkulation mit Daten für jedes Tier eingegeben) ausgegeben werden. </li><li> Sobald das Verhalten erzielt wird, ist es wichtig zu bestätigen, dass die beiden Arten unterschiedliche Bewältigungsstrategien ausgestellt für das Verhalten von Interesse in der Studie. In diesem Fall ist der California Hirsche Mäusen sollte mehr väterliche Verhalten als die gemeinsame Hirsche Mäusen. Darüber hinaus können verschiedene Verhaltensmaßnahmen mit Gehirn Maßnahmen korreliert werden, um eine fundierte Analyse relevanten Einflüsse zu bekommen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: <ol><li> Zur Validierung des Modells sollten die Daten zeigen deutlich, dass die beiden Arten unterschiedlich ausgeführt im Hinblick auf das Verhalten von Interesse. Hier sehen Sie, dass die P. californicus Männer verbrachten mehr Zeit Pflege und geduckt über die Welpen, zwei Markenzeichen des väterlichen Antworten (siehe Abbildung 4). </li><li> Um festzustellen, ob die neurobiologial Variable von Interesse ist in väterliche Reaktionen wichtig, die Menge an Vasopressin (AVP)-positive Gewebe wurde für mehrere relevante Hirnregionen quantifiziert; wie man sieht, das väterliche P. californicus Tiere hatten mehr immun-positive Gewebe in mehreren dieser Hirnregionen. (Siehe Abbildung 5). </li><li> In einer ähnlichen Studie mit dem Mikrosequenzierung Analyse wurde die Hypothese aufgestellt, dass väterliche California Mäuse würden weniger Angst als ihre Pendants Jungfrau zeigen, dementsprechend, wenn ein Raubtier Geruch ausgesetzt sind, zeigten die Väter weniger Unterbrechungen in der Pflege-Sequenz als die jungfräuliche Tiere (siehe Abbildung 6). </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" /> Abbildung 1: (A) männlich California Mäusen ausstellenden väterliche Reaktionen gegenüber Artgenossen fremd pup. (B) Männliche Hirsche Maus präsentiert einen vorsichtigen Ansatz (Stretch teilnehmen) und die Vermeidung Reaktion in Anwesenheit eines Artgenossen fremd pup. Hinweis: In dieser sozialen Interaktion Einschätzungen, wenn ein Männchen Exponate aggressive Reaktionen auf die Welpen, die Experimentatoren sofort auf den Spitzenplätzen der Käfig mit dem männlichen abzulenken. Zu diesem Zeitpunkt die Sitzung beendet wird und der Welpe wird entfernt, inspiziert für alle Wunden und kehrte nach der Mutter. In unserem Labor, das selten mit P. beobachtet californicus Männchen, sondern ist gelegentlich mit P. beobachtet maniculatus; genaue Beobachtung und sofortiges Eingreifen, aber Schlimmes verhindern das Auftreten von den Tieren. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" /> Abbildung 2: A California Maus Interaktion mit einem Spielzeug-Maus, die meisten versuchten, auf diese Reize zu kauen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" /> Abbildung 3: Experimentelles Design der Studie, es gab ca. 6 Tiere in jeder Gruppe für die einzelnen Arten. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" /> Abbildung 4: Grafik der Immunzytochemie Prozess. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" /> FeigeAbbildung 5 Paternal Reaktionen in der kalifornischen und Rehe Mäusen;. mehr väterliche Antworten (Bräutigam, ducken, schneller Ansatz) wurden in der kalifornischen Mäusen beobachtet. Mehr Stretch besucht (Stress-Reaktion) wurden in der Hirsch-Mäusen beobachtet. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" /> Abbildung 6. Vasopressin-Immunreaktivität in verschiedenen Gehirnarealen von beiden Arten. Die California-Mäusen hatten mehr Färbung in den PVN Zellen und Fasern. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" /> Abbildung 7: Väterliche California Mäuse zeigten weniger Störungen in ihrer Pflege-Sequenzen in der Gegenwart von einem Raubtier Geruch als der Welpe ausgesetzt und Jungfrau Gruppen.

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	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieser Artikel beschreibt drei wesentliche Komponenten als kritisch für die erfolgreiche Ausführung von Behavioral Neuroscience Untersuchungen: (1) eine repräsentative und valide Tiermodell, (2) eine genaue und sensible Immunzytochemie-Protokoll, und (3) die meisten Analyse (Beobachtungs-und statistische ) sowohl der Verhaltens-und Gehirn-Daten. Fehler in einer einzelnen Kategorie wird sicherlich Kompromisse die Ergebnisse der gesamten Studie. Daher nach sorgfältiger Auswahl der geeigneten Tiermodell sollten erhebliche Anstrengungen zur Pilotierung der Verhaltens-und histologische Verfahren, um sicherzustellen, dass das Verhalten zuverlässig wird in der Studie beobachtet werden, durch die erfolgreiche Bearbeitung der Gehirne gefolgt gerichtet werden. Wie bereits erwähnt, ist die Verwendung von vergleichenden Arten neurobiologischen Mechanismen einer bestimmten Reaktion zu identifizieren ein wertvolles methodisches Vorgehen, da diese Technik nicht erforderlich ist Gentechnik oder schmerzhafte chirurgische Eingriffe. So nutzt dieses methodischen Ansatzes weniger bedroht, intakten Tieren. Die Verwendung von natürlichen Schwankungen der Tiere ist jedoch durch den Einbau von Natur-ähnliche Umgebungen gestärkt, auch wenn die Tiere im Labor untergebracht sind. Ferner, wenn Laboruntersuchungen, um das Feld weiter zu validieren die Authentizität der Arten Unterschiede im Verhalten von Interesse erweitert werden kann, wird diesen nächsten Schritt zu empfehlen. Obwohl der vergleichenden Ansatz bietet viele Vorteile, ist eine Einschränkung der korrelativen Natur der Daten, folglich zusätzliche Techniken wie pharmakologische Manipulationen sollten zur weiteren Validierung der Rolle der gezielte neurobiologische Systeme in das Verhalten von Interesse sein. Sobald die Experimentatoren zuversichtlich über die Verhaltens-, histologische und statistische Verfahren zu fühlen, sollte darauf geachtet werden, dass so die Lebensbedingungen der Tiere konstant bleiben für alle Gruppen außer, natürlich, für die experimentelle Manipulation. Änderungen in Variablen wie Licht Zeitpläne, Geräuschpegel, Hausmeister, Luftfeuchtigkeit und Gerüche im Labor hätte erhebliche Auswirkungen auf die Tiere neurobiologische Reaktionen. In diesem Artikel wird das primäre Antikörper wurde für den Nachweis von Vasopressin, sondern auch andere primäre Antikörper kann für eine Vielzahl von verschiedenen neurochemischen von Interesse verwendet werden kann. Wenn der Experimentator mit einem neuen Antikörper arbeitet, ist es wichtig, Titration Studien durchzuführen, um die optimale Verdünnung des neuen Antikörpers zu ermitteln. Viele Male zu viel Antikörper verwendet wird (wie vom Hersteller empfohlen), was im Gewebe, die zu dunkel, um das Signal zu unterscheiden ist, ferner ist die exzessive Benutzung des Antikörpers sehr teuer. Schließlich, wenn mehr als eine statistische Analyse kann verwendet werden, um alternative Ansichten und Interpretationen der Daten aufgefordert werden, sollten sie genutzt werden. In diesem speziellen Studie wurden allgemeine lineare Modelle, Korrelationsstudien und multidimensionale Skalierung Analysen verwendet werden, um die informativste Sichten auf die Daten bieten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Binocular zusammengesetzte Mikroskop </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> BIOQUANT Life Science Software </td><td> BioQuant Bild Analysis Corporation </td><td> Version 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex Console Drive Easy-Load L / S (Perfusion Pump) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Well Zellkultur Cluster (Gewebekultur behandelt; nichtpyrogene Polystyrol; sterile) </td><td> Corning Costar </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> 25x75x1mm Mikropräparate </td><td> Globe Scientific, Inc. </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> 22x50mm No.1 Deckglas </td><td> Globe Scientific, Inc. </td><td> 1414-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nicht sterile 3 ml Graduated Large Bulb Transferpipetten </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Alconox Waschpulver </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9888-1kg </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Natriumdihydrogenphosphat </td><td> Spektrum </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> Natriummonohydrogenphosphat-Dihydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> Triton X </td><td> Spektrum </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> Fischer </td><td> SP15-500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> Chromium Kaliumsulfat </td><td> Sigma </td><td> C-5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol, High Den.Poly Flaschen, 200 proof, 24 x 1 Pint </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Vektor </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-Vasopressin Analyt-spezifischen Reagenz </td><td> Immunostar, Inc. </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylierter Anti-Kaninchen-IgG (H + L) affinitätsgereinigten </td><td> Vektor </td><td> BA-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elite Standard-Vectastain ABC Kit </td><td> Vektor </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> DAB Peroxidase Substrate Kit </td><td> Vektor </td><td> SK-4100 </td><td></td></tr><tr><td> Original unflavored Gelatine (4-count Umschläge) 1-oz-Box </td><td> Knox </td><td></td><td> Kaufen Sie bei lokalen Lebensmittelgeschäft </td></tr><tr><td> 3% Wasserstoffperoxid </td><td> CareOne </td><td></td><td> Kauf auf lokaler Apotheke </td></tr><tr><td> Bleichmittel </td><td> Clorox </td><td></td><td> Kaufen Sie bei lokalen Lebensmittelgeschäft </td></tr></tbody></table>

using a comparative species approach to investigate the neurobiology of paternal responses

Ein Ziel der Behavioral Neuroscience ist die zugrunde liegenden neurobiologischen Faktoren, die bestimmte Verhaltensweisen regeln zu identifizieren. Anhand von Tiermodellen, um dieses Ziel zu erreichen, benötigen viele methodische Strategien invasive Techniken, um die Intensität des Verhaltens von Interesse (zB Läsion Methoden, pharmakologischen Manipulationen, Mikrodialyse Techniken, gentechnisch veränderten Tiermodellen) zu manipulieren. Die Nutzung einer vergleichenden Arten Ansatz ermöglicht es den Forschern, um die Vorteile von natürlich vorkommenden Unterschiede im Ansprechen Strategien bestehenden in eng verwandten Arten zu nehmen. In unserem Labor verwenden wir zwei Arten der Gattung, die in Peromyscus väterliche Reaktionen unterscheiden. Die männlichen Hirsche California Maus (Peromyscus californicus) zeigt die gleiche elterliche Antworten als die weiblichen, während sein Vetter, zeigt die gemeinsame Rehe Maus (Peromyscus maniculatus) so gut wie keine Pflege / elterlichen Reaktionen in Gegenwart von Welpen. Von besonderem Interesse in diesem Artikel ist eine Erforschung der neurobiologischen Faktoren im Zusammenhang mit der affiliative sozialen Reaktionen des väterlichen California Rehe Maus ausgestellt verbunden. Da die Behavioral Neuroscience Ansatz ist vielfältig, werden die folgenden wesentlichen Bestandteile der Studie kurz angesprochen werden: die Identifizierung von geeigneten Arten für diese Art von Forschung, Datenerfassung für Verhaltensanalyse; Vorbereitung und Schneiden der Gehirne; grundlegende Schritte in Immunzytochemie für beteiligt die Quantifizierung der Vasopressin-Immunreaktivität, der Einsatz von Neuroimaging-Software, um das Gehirngewebe zu quantifizieren, die Verwendung eines Mikrosequenzierung Videoanalyse, um das Verhalten der Gäste und schließlich ist die geeignete statistische Analysen, um die am besten informierte Interpretation der Forschungsergebnisse liefern.

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Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

Die vergleichende Arten Ansatz ermöglicht Verhaltensänderungen Neurowissenschaftler verschiedene neurobiologische Faktoren, die mit bestimmten Verhaltensweisen, die als charakteristisch für ein bestimmtes Tier-Modell angesehen assoziiert zu erkunden. Unter Ausnutzung der natürlichen Unterschiede im Verhalten zwischen nahe verwandten Arten, diese Technik nicht erforderlich invasive Techniken, um den Ausdruck des Verhaltens zu manipulieren.

Mit einem vergleichenden Arten Ansatz zur Neurobiologie der väterlichen Responses Untersuchen

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Multielektroden Array Recordings der Vomeronasal Epithel

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Recording Verhaltensreaktionen auf Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Messung des subjektiven Wert des Risky und mehrdeutig Optionen mit Experimental Economics and Functional MRI Methoden

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the &quot;Loser&quot; Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

Ein neuer Ansatz, die Handhabung für ein Studium Aggression Eliminiert und die &quot;Loser&quot; Effect in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel Verhaltenstest Gustatory Antworten einzelner, frei beweglichen Bumble Bees zur Untersuchung (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...