Diese Arbeit wurde vom NIH EY005102 zu SCM und EY018640 zu CPR finanziert

1. Intact neuronalen Retina-Präparaten für Goldfische, Mäuse und Kaninchen <ol><li> Führen Sie alle folgenden Schritte, einschließlich derer im Abschnitt &quot;2) Cut-loading&quot;, bei konstanten Umgebungsbedingungen (Hintergrund-) Beleuchtung. Bitte beachten Sie, dass für die Zwecke dieses Protokolls, die Verfahren beschrieben werden, wie ausgeführt in konstanter Dunkelheit (dh unter sehr dunklen (dh &quot;skotopischen&quot;) Bedingungen ≤ 0,0001 lux) mit Nachtsicht Infrarot-Brille, sondern auch andere höhere Intensitäten der konstanten Umgebungsbeleuchtung können stattdessen verwendet werden, um die Wirkung von anderen Ebenen der Umgebungsbeleuchtung auf Gap Junction-Tracer-Kopplung zu bestimmen. </li><li> Dark-Anpassung des Versuchstieres (Goldfische, Maus oder Kaninchen) für mindestens 1 Stunde vor der Operation. </li><li> Wie zuvor beschrieben 7, tief betäuben Goldfische, indem man sie in Tricaine Methansulfonat (MS222, 150 mg / l gepuffert (Natrium-Bicarbonat-haltigen) Aquarium Wasser), und tief betäuben Mäuse mit Ketamin (100 mg/ Kg, ip) und Rompun (10 mg / kg, ip). Tief betäuben Kaninchen mit Urethan (Loading dose: 2,0 g / kg, ip) und auch lokale intraorbitale Anästhesie (2% Xylocain), wie zuvor beschrieben 8. Alle Experimente, die die Pflege und Nutzung von Tieren im Einklang mit Bundes-Richtlinien durchgeführt und überprüft und von den örtlichen Universität Tier in Pflege und Gebrauch Ausschüsse genehmigt werden. (Hinweis:. In den Experimenten hier beschrieben, alle experimentellen Verfahren, die die Pflege und Nutzung der Fische, Mäuse und Kaninchen wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien durchgeführt und wurden überprüft und genehmigt von der Ohio State University Institutional Animal Care und Verwenden Committee) </li><li> Für Fische, Mäuse und Kaninchen, nach Enukleation, entfernen Sie den vorderen Teil eines jeden Augapfel. Legen Sie dann ein Stück Filterpapier auf der Oberseite des hinteren Teil des Auges und invertieren die Filterpapier und Auge, so dass das Filterpapier unter dem hinteren Teil des Auges ist. Dann, mit feinenPinzetten sezieren die intakte neuronale Retina aus dem hinteren Teil des Auges durch leichtes Abziehen der Pigmentepithel / Aderhaut / Lederhaut, die miteinander verbunden sind, aus der neuronalen Netzhaut, die das Filterpapier angebracht ist. Als dies geschehen ist, schneiden Sie den Sehnerv mit feinen federbelastete Schere. Die neuronalen Netzhaut, orientiert Photorezeptor-side up, sollte nun auf das Filterpapier befestigt werden und getrennt vom Rest des Auges. </li></ol> 2. Cut-loading <ol><li> Tauchen Sie die Netzhaut in Sauerstoff Ringer-Lösung (Tabelle 1) in einer 6-Well-Platte (~ 5 mL / well) für 30 min bei konstanten Umgebungsbedingungen (Hintergrund-) Beleuchtung (z. B. unter sehr dunklen (dh &quot;skotopischen&quot;) Bedingungen) mit oder ohne ein Test Droge. Behalten Fisch Netzhaut in Sauerstoff (5% CO 2 / 95% O 2) Bicarbonat-basierten Ringer bei 22 ° C durch Abdichten der 6-Well-Platte mit Parafilm und pflegen Maus und Kaninchen Netzhaut bei 36 ° C in einer 5% igen CO 2 / 95% O <sub&gt; 2-Inkubator. Wenn ein Test Medikament verwendet wird, sollte es während alle nachfolgenden Schritte bis zur Fixation präsentieren </li><li> Bereiten Sie die Tracer-Lösung (typischerweise 100 ul) durch Auflösen neurobiotin (0,5%), einem biotinylierten Moleküls, in Ringer-Lösung unmittelbar vor Durchschneiden der Netzhaut. Beachten Sie, dass 0,5% Rhodamin Dextran (hoch (&gt; 10.000) MW) zu der Lösung hinzugefügt werden. Aufgrund seiner hohen Molekulargewicht, wird Rhodamin Dextran nicht überqueren Gap Junctions und nur Etiketten, Zellen, die durch den Schnitt beschädigt wurden. Wie in Abb.. 3, ist dies eine nützliche Methode, um Zellen, die angesammelten neurobiotin haben, weil sie verletzt wurden, von denen, die der Tracer angesammelt haben durch Diffusion durch gap junctions unterscheiden. </li><li> Legen Sie die neurobiotin Lösung auf ein Glas (oder Kunststoff) Petrischale, tippen Sie auf das Filterpapier, zu denen der Netzhaut angebracht ist, auf einem Papiertuch, um überschüssige Ringer entfernen, tauchen Sie ein Rasiermesser (oder andere scharfe Klinge) in der neurobiotin Lösung und dien einen radialen Schnitt durch die Netzhaut und Filterpapier. Falls gewünscht, können Abstandhalter verwendet werden, so dass der Schnitt durch die Retina wird, aber nicht das Filterpapier. Der Schnitt sollte senkrecht zu der Netzhaut. Tauchen Sie die Rasierklinge in der neurobiotin Lösung wieder und schneiden die Netzhaut ein zweites Mal. Wiederholen Sie diese bis zu 4 Schnitte pro Netzhaut (siehe Abb. 1).. Verwenden Sie ein Binokular Bei der Rasierklinge schneidet durch Maus und andere kleine Netzhaut. </li><li> Wie in Abb.. 1, tauchen die Netzhaut wieder in frische Ringer-Medium, mit oder ohne Testsubstanz mit einem 6-Platte gut (5 mL Ringer / well). Inkubieren der Netzhaut für 15 min bis zum Be-und Diffusion zu ermöglichen. </li><li> Dreimal für jeweils 5 min mit frischer Ringer-Medium mit oder ohne Testsubstanz. </li><li> Fix der Netzhaut mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PBS, pH 7,4) für 1 Stunde bei RT. </li><li> Waschen mit 0,1 M PBS über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am folgenden Tag, reagieren wit 2% Streptavidin-Alexa 488 (Endkonzentration 10 ug / ml) in 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, und halten Sie über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,1 M PBS bei RT </li><li> In PBS, lösen die Netzhaut vom Filterpapier und dann mit einem feinen Pinsel, Ort der Netzhaut, orientiert Photorezeptor-Seite nach oben auf eine Folie. </li><li> Behutsam mit Vectashield Eindeckmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) zu montieren. </li><li> Nehmen Sie Bilder mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (zB Zeiss 510 META) bei gleicher Vergrößerung, Auflösung und Einstellungen für jede experimentelle Bedingung, so dass man die Auswirkungen der verschiedenen experimentellen Bedingungen (zB Test-Drogen; Lichtverhältnissen) vergleichen das Ausmaß der Gap Junction-Tracer-Kopplung (Abb. 2a-c und Abb.. 4A-C). Obwohl ein einzelnes Bild all der markierten Zellen enthalten kann, ist es empfehlenswert, dass Sie ein z-Stapel im Bereich der Erhebung von Zinsen und Zusammenbruch in einen einzigenBild. </li></ol> 3. Die Quantifizierung der Tracer-Kopplung mit ImageJ <ol><li> In der LSM Image Browser, öffnen Sie das Bild, klicken Sie auf Exportieren und speichern Sie das Bild als TIF-16 Bit nicht komprimierte Datei. Maßstabsbalken sollte in diesem TIF-Bild aufgenommen werden. </li><li> Mit NIH ImageJ Software, messen Fluoreszenzintensität Alexa-488-markierten neurobiotin von Low-Vergrößerungsbildern ganzer-mount Netzhaut. Öffnen Sie die TIF-Datei mit ImageJ Software und zeichnen Sie dann eine gerade Linie entspricht der Skala bar. Zur Analyse, SET SCALE und geben Sie die bekannte Strecke und die Einheit der Länge, klicken Sie dann auf OK. Jetzt Messergebnisse können in kalibrierten Einheiten wie Millimetern vorgestellt. </li><li> Wählen Sie den Bereich von Interesse, wobei die rechteckige Auswahl-Werkzeug. Der Höhepunkt der Fluoreszenz sollte am linken Rand der Auswahl positioniert werden. Stellen Sie sicher, dass es keine Fluoreszenzsignal in der Nähe des rechten Rand. Wenn nicht, drehen Sie das aktive Bild (Bild, dann drehen). </li><li> KlickenANALYSE und PLOT PROFILE. Sie sollten eine Kurve mit einem exponentiellen Abfall von links nach rechts zu sehen. </li><li> Klicken Sie auf Kopieren in dem Popup-Fenster und fügen Sie ihn in EXCEL. Nun sehen Sie zwei Spalten zeigen die Entfernung aus dem Schnitt (linke Spalte) und die Fluoreszenz-Intensität als Funktion des Abstandes vom Schnitt (rechte Spalte). </li><li> Teilen Sie jeden Rohstoff Fluoreszenz-Wert durch die maximale Fluoreszenz Wert für die relative Fluoreszenzintensität zu erhalten. </li><li> Kopieren Sie zwei Spalten entsprechend dem Abstand von der Schnittkante (X) und die relative Fluoreszenzintensität (Y), und fügen Sie sie in Origin Software. </li><li> Fit mit dem exponentiellen Nr. 1 Funktion (Abb. 2D-und 4D-Bild.), Die in das Formular: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) wobei Y die relative Fluoreszenzintensität ist, Y o die Hintergrundfluoreszenz ist, Y max die maximale relative Fluoreszenz ist, ist λ die space (Länge) konstant, und x ist der Abstand von der Schnittkante. </li><li> Vergleichen Sie den Raum konstant (λ)-Werte bei verschiedenen experimentellen Bedingungen mit dem t-Test oder ANOVA (Abb. 2E und Abb.. 4E). Beachten Sie, dass alternative Techniken der Quantifizierung von anderen 13,14 beschrieben worden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Beispiele für Photorezeptorzelle Tracer Kopplung von cut-Laden bestimmt sind in den Abbildungen 2 und 3 (Fisch) und Abbildung 4 (Kaninchen) vorgestellt. Konfokale Bilder wurden mit den gleichen Einstellungen für den Vergleich (Abb. 2a-c und Abb.. 4A-C) und die Fluoreszenz-Intensität als Funktion des Abstandes von der Schnittfläche aufgetragen und montiert durch die Exponentialfunktion in Ziffer 3.8 oben gezeigt (Abb. 2D und Bild. 4D). Raum konstante Werte für jede Bedingungsind in den Abbildungen 2E und 4E gezeigt, veranschaulicht, dass das Ausmaß der Gap Junction-Tracer-Kopplung quantifiziert werden mit Hilfe der Schnitt-loading-Technik sein. Darüber hinaus werden die Ergebnisse in hohem Maße reproduzierbar. Die Nutzung der Schnitt-loading-Technik als Mittel zur Quantifizierung der Umfang der Gap Junction-Tracer-Kopplung ist auch der Befund, dass die Fluoreszenz-Intensität exponentiell abnimmt als Funktion des Abstandes von der Schnitt in allen Fällen überprüft untersuchten 7,8 (siehe auch Abb.. 2D-und 4D hier), was darauf hinweist, dass neurobiotin die Photorezeptoren trat über die Rasierklinge geschnitten und nicht von anderen retinalen Seiten. Auch die qualitativ ähnliche Tag / Nacht-Unterschied in Photorezeptorzelle Tracer-Kopplung in Goldfische mit Tracer-Injektionen in einzelne Kegel und mit cut-loading 7 beobachtet begründet cut-Laden als ein relativ genaues Mittel zur Bestimmung des Ausmaßes der Photorezeptor-Kopplung. Der Cut-loading Technik kann auch verwendet werden, um andere Arten von elektrischen Synapsen in der Retina zu untersuchen. Zum Beispiel zeigt Abbildung 5, dass Kaninchen A-Typ (Abb. 5A) und B-Typ (Abb. 5B) horizontale Zellen weisen homologe Tracer Kopplung folgenden Schnitt-loading und Verbreitung von neurobiotin unter dunkeladaptierten Bedingungen. <table border="1"><tbody><tr><td> Verbindung </td><td> Fisch </td><td> Maus </td><td> Kaninchen </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 3,1 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> - </td><td> 0,1 </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammensetzung der Ringer-Lösungen für Goldfische, Maus und Kaninchen Netzhaut. Die Konzentrationen sind in mM vorgestellt. Die Ringer-Lösungen werden mit 5% CO 2 / 95% O 2 Blasen und bei 22 ° C (Fisch) oder 36 ° C (Säugetiere). &quot;-&quot;: Nicht in der Ringer für diese Spezies enthalten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> Abbildung 1:. Flussdiagramm, das die cut-Ladevorgang. Nach der Isolierung of der intakten neuronalen Netzhaut wurden mehrere radiale Schnitte durch eine Klinge, die zuerst in 0,5% neurobiotin Lösung getaucht wurde gemacht. Die Netzhaut wurde für Tracer Be-und Diffusions-inkubiert, und dann vor der Fixierung mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) gewaschen. Tracer-Kopplung wurde mittels Streptavidin-konjugierte Alexa-488. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> Abbildung 2. Tag-Nacht-Unterschied in der Photorezeptor-Tracer-Kopplung in Goldfisch ist durch den Schnitt-loading-Technik aufgedeckt. Photorezeptorzelle Gap Junction neurobiotin Tracer-Kopplung wurde in der Nacht (B) und in den Tag umfangreichen folgende Anwendung Spiperon (10 pM), ein selektiver Dopamin-D 2-Rezeptor-Antagonist (C), aber nicht in den Tag unter Kontrollbedingungen (A). D) normalisierte relative Fluoreszenzintensität als Funktion des Abstandes von der Schnitte (durch Pfeile angedeutet in AC). E) Space konstant valWerte aus den Daten in D und anderen Experimenten (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein repräsentatives Beispiel zeigt Fluoreszenz in den Sehzellen Schicht eines dunkeladaptierten Goldfisch Netzhaut in der Nacht nach cut-Laden mit einer Lösung sowohl neurobiotin und Rhodamin Dextran. Rhodamin Dextran (rot dargestellt), die nicht durch offene Gap Junction Kanälen aufgrund seiner hohen Molekulargewicht (&gt; 10.000 MW), nur markierte Zellen in der Nähe der Schnitt ist diffus. Im Gegensatz dazu kann neurobiotin (grün dargestellt) verbreitet über Gap Junctions und in Sehzellen weit von dem Schnitt zu sehen. Die Lage des Schnittes wird durch den Pfeil in jedem Panel angezeigt. Maßstab: 200 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> Abbildung 4. Tag-Nacht-UnterschiedePräsenz in Photorezeptor Tracer-Kopplung in Kaninchen Netzhaut ist durch den Schnitt-loading-Technik aufgedeckt. Photorezeptorzelle Gap Junction neurobiotin Tracer-Kopplung wurde in der Nacht (B) und in den Tag umfangreichen folgende Anwendung Spiperon (10 pM) (C), aber nicht in den Tag unter Kontrollbedingungen (A). In AC, stehen senkrecht Ansichten der 3D-Rekonstruktion von Kaninchen-Photorezeptoren in der Nähe der Schnitt dargestellt. D) normalisierte relative Fluoreszenzintensität als Funktion des Abstandes von der Schnitte. E) Space konstante Werte aus den Daten in D und anderen Experimenten (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> Abbildung 5. Cut-loading zeigt, dass dunkeladaptierten Kaninchen horizontalen Zellen sind Tracer gekoppelt. Beide A-Typs (A) und B-Typ (B) horizontale Zellen in dunkeladaptierten Kaninchen Netzhaut ausgestellt homologen neurobiotin Tracer-Kopplung.

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Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Schnitt-loading hier beschriebene Methode ist ein nützliches und einfach Technik, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht zu bestimmen. Vorteile dieser Technik sind die Fähigkeit, das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Neuronen im intakten Retina unter einer Vielzahl von Beleuchtungs-Bedingungen zu quantifizieren während der Tag und Nacht und zu tun für die gekoppelte Neuronen, die mit kleinem Durchmesser Somata haben. Einschränkungen der Technik in das Studium der Gap Junctions in intaktem Gewebe fallen in zwei allgemeine Kategorien. Erstens kann Tracerdiffusion durch offene Gap Junctions relativ schwierig zu beobachten, durch a) den kleinen Durchmesser oder die Ladung mit den offenen Kanälen und b) die relativen Mengen von gekoppelten zellulären Kompartimenten 1,14,15 verbunden. Das heißt, Tracerdiffusion aus einer kleinen Zelle, um eine größere Zelle oder Gruppe von gekoppelten Zellen, compARED zu Tracerdiffusion aus einer größeren Zelle auf eine kleinere Zelle, kann schwieriger festzustellen, da Tracer Verdünnung. Zweitens, unter bestimmten physiologischen Bedingungen kann das Ausmaß der Tracer-Diffusion durch gap junctions in intaktem Gewebe nicht genau die Stärke der Lücke junctional Leitfähigkeit aufgrund der Unterschiede in der Leitfähigkeit von kleinen elektrischen Strom führenden Ionen, verglichen mit der Durchlässigkeit der relativ großen Tracer Moleküle 1,14,15. In der Regel Hinweise auf Tracer-Kopplung stark darauf hin, das Vorhandensein von funktionierenden, offenen Gap Junction Kanälen, sondern unter bestimmten physiologischen Bedingungen Tracerdiffusion kann nicht auftreten, oder beobachtet werden, obwohl elektrophysiologische Ableitungen der Anwesenheit von funktionierenden, offenen Gap Junctions vorschlagen. Es scheint wahrscheinlich, dass der Schnitt-loading-Technik kann auch verwendet werden, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Neuronen im intakten Gewebe aus anderen Regionen des zentralen Nervensystems zu untersuchentem.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Tricaine Methansulfonat (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / l gepuffert Aquarium Wasser </td></tr><tr><td> Urethane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / kgloading Dosis </td></tr><tr><td> Dual-Rohr Night Vision Goggle </td><td> Nacht Optics USA </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Filter Paper, Grade Nr. 4 </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Feine Pinzetten, Dumont Nr. 5, Biologie, 11 cm lang </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Feine Schere, gefedert, 8 mm Klinge, gerade </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vektor </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Streptavidin-konjugierten Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran Rhodamin (hoch (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield Eindeckmedium </td><td> Vektor </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META Laser Scanning Konfokalmikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8,0 </td><td> OriginLab Corp </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

Neben der chemischen synaptischen Übertragung, können Neuronen, die durch Gap Junctions miteinander verbunden sind auch schnell kommunizieren über elektrische synaptische Übertragung. Zunehmende Hinweise darauf, dass Gap Junctions ermöglichen nicht nur elektrischen Strom fließen und synchrone Aktivität zwischen miteinander verbundenen oder gekoppelten Zellen, sondern dass die Stärke oder die Wirksamkeit der elektrischen Kommunikation zwischen gekoppelten Zellen moduliert werden kann zu einem großen Teil 1,2. Darüber hinaus ermöglicht der große Innendurchmesser (~ 1,2 nm) von vielen Gap Junction Kanälen nicht nur elektrischen Strom fließen, sondern auch die Diffusion von intrazellulären Signalmolekülen und kleinen Metaboliten zwischen miteinander verbundenen Zellen, so dass Gap Junctions kann auch vermitteln, metabolische und chemische Kommunikation . Die Stärke der Lücke junctional Kommunikation zwischen Neuronen und deren Modulation durch Neurotransmitter und andere Faktoren können durch die gleichzeitige Aufnahme von elektrisch gekoppelt Zellen und durch die Bestimmung t untersucht werdenEr Ausmaß der Verbreitung von Tracer-Moleküle, die Gap Junction durchlässig sind, aber nicht durchlässige Membran nach iontophoretischen Injektion in einzelne Zellen. Allerdings können diese Verfahren äußerst schwierig, auf Neuronen mit kleinen Somata in intakten Nervengewebe führen. Zahlreiche Studien über elektrische Synapsen und die Modulation der elektrischen Kommunikation wurden in der Wirbeltier-Netzhaut durchgeführt worden, da jeder der fünf retinalen Neuronen-Typen erfolgt elektrisch über Gap Junctions 3,4 verbunden. Zunehmende Anzeichen hat gezeigt, dass die circadiane (24-Stunden-) Uhr in der Netzhaut und Veränderungen in Lichtstimulation Gap Junction Kopplung 3-8 regulieren. Zum Beispiel, haben neuere Arbeiten gezeigt, dass die Netzhaut circadianen Uhr Gap Junction Kopplung zwischen Stäbchen und Zapfen Sehzellen sinkt im Laufe des Tages durch die Erhöhung Dopamin D2-Rezeptor-Aktivierung und erhöht drastisch Stäbchen-Zapfen-Kopplung in der Nacht durch die Reduzierung D2-Rezeptor-Aktivierung <sup&gt; 7,8. Doch nicht nur diese Studien äußerst schwierig, auf Neuronen mit kleinen Somata in intakten neuronalen Retina führen, aber es kann schwierig sein, zur angemessenen Beherrschung der Lichtverhältnisse während der elektrophysiologischen Untersuchung einzelner retinaler Neurone auf Licht-induzierte Veränderungen in Gap Junction zu vermeiden Leitwert. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht. Dieser Schnitt-loading-Technik ist eine Modifikation des kratzen loading 9-12, die auf Farbstoff Be-und Diffusion durch offene Gap Junction Kanälen basiert. Scrape Laden funktioniert gut in kultivierten Zellen, aber nicht in dicke Scheiben schneiden, wie intakte Netzhaut. Der Schnitt-loading-Technik wurde verwendet, um Photorezeptor-Kopplung in intakten Fisch und Säugetier-Retina 7, 8,13 studieren, und kann verwendet werden, um studieren Kopplung zwischen seinanderen retinalen Neuronen, wie hier beschrieben.

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Eine einfache und bequeme Methode, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen zu bestimmen, ist beschrieben. Diese Technik ermöglicht es, die Funktion der elektrischen Synapsen zwischen Nervenzellen im intakten Netzhaut unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht zu untersuchen.

Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

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Serie: Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Morphometrische Analysen von Netzhautschnitte

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

Antikörper Transfektion in Neuronen als Werkzeug zur Pathogenese der Erkrankung Studieren

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.