Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder EY005102 para SCM e EY018640 para CPR

1. Intacta retina neural preparações para goldfish, camundongos e coelhos <ol><li> Realizar todas as etapas a seguir, incluindo aqueles descritos em &quot;2) Corte-loading&quot;, sob constante iluminação ambiente (background). Por favor, note que, para efeitos deste protocolo, os procedimentos são descritos como a realizada na escuridão constante (isto é, com muito escuro (ou seja, &quot;escotópica&quot;) condições ≤ 0,0001 lux) usando óculos de visão noturna infravermelha, mas outros níveis de maior intensidade de iluminação ambiente constante pode ser usado em vez de determinar o efeito de outros níveis de iluminação ambiente em gap de acoplamento junção marcador. </li><li> Dark-se adaptar o animal experimental (mouse goldfish, ou coelho) por pelo menos 1 hora antes da cirurgia. </li><li> Conforme descrito anteriormente 7, profundamente anestesiar peixinho colocando-os em tricaina metanosulfanato (MS222, 150 mg / L de água tamponada (bicarbonato de sódio contendo) do tanque de peixes), e profundamente anestesiar ratos com cetamina (100 mg/ Kg, ip) e Rompun (10 mg / kg, ip). Profundamente anestesiar coelhos com uretana (dose de ataque: 2,0 g / kg, ip) e também usar anestesia intraorbital local (2% xilocaína), como descrito anteriormente 8. Todos os procedimentos experimentais envolvendo o cuidado e uso de animais deve ser realizada de acordo com as diretrizes federais e ser revisado e aprovado pelo cuidado animal local da universidade e comitês uso. (Nota:. Nos experimentos aqui descritos, todos os procedimentos experimentais envolvendo o cuidado e uso de peixes, camundongos e coelhos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH e foram revistos e aprovados pela Ohio State University Animal Care Institucional e Comitê de Uso) </li><li> Para peixes, camundongos e coelhos, após enucleação, remova a parte anterior de cada globo ocular. Em seguida, coloque um pedaço de papel de filtro em cima da porção posterior do olho e inverter o papel de filtro e do olho, de modo que o papel de filtro fica embaixo da porção posterior do olho. Em seguida, usando bemforceps dissecar a retina neural intacta da parte posterior do olho suavemente descascar o epitélio pigmentar / coróide / esclera, que são ligados uns aos outros, a partir da retina neural, que é ligado ao papel de filtro. Como isso é feito, cortou o nervo óptico usando multa de mola tesoura. A retina neural, até fotorreceptoras lado-oriented, agora deve ser anexado ao papel de filtro e separado do resto do olho. </li></ol> 2. Cut-loading <ol><li> Submergir o retinas em solução Ringer oxigenados (Tabela 1) em uma placa de 6 poços (~ 5 mL / poço) por 30 min sob constante ambiente (background) iluminação (por exemplo, sob muito escuro (ou seja, &quot;escotópica&quot;) condições) com ou sem uma droga teste. Manter retinas de peixes em oxigenada (5% CO 2 / 95% O 2) de bicarbonato baseado em Ringer a 22 ° C por selar a placa de 6 poços com parafilme e manter retinas do rato e coelho em 36 ° C em 5% de CO 2 / 95% O <sub&gt; 2 incubadora. Quando uma droga teste é usado, ele deve estar presente durante todas as etapas subseqüentes, até a fixação </li><li> Prepare a solução marcador (tipicamente 100 mL) pela dissolução neurobiotin (0,5%), uma molécula de biotina, em solução de Ringer imediatamente antes do corte através da retina. Note-se que 0,5% rodamina dextran (alta (&gt; 10.000) MW) pode ser adicionado à solução. Devido ao seu alto peso molecular, rodamina dextran não atravessa junções e as células apenas rótulos que foram danificadas pelo corte. Como mostrado na figura. 3, esta é uma maneira útil para distinguir as células que se acumularam neurobiotin por terem sido feridos, daqueles que acumularam o marcador por difusão através de junções. </li><li> Coloque a solução neurobiotin em um vidro (ou plástico) placa de Petri, toque no papel filtro, para que a retina está ligado, em um papel toalha para remover excesso de Ringer, mergulhe uma lâmina de barbear (ou lâmina afiada outros) na solução e neurobiotin on fazer um corte radial através da retina e papel de filtro. Se preferir, espaçadores podem ser usadas para que o corte é feito através da retina, mas não o papel de filtro. O corte deve ser orientadas perpendicularmente à superfície da retina. Mergulhe a lâmina de barbear na solução neurobiotin novamente e cortar a retina uma segunda vez. Repita este até 4 cortes por retina (ver Fig. 1.). Use um microscópio de dissecação ao fazer cortes de navalha pelo mouse e outros pequenos retinas. </li><li> Como mostrado na figura. 1 submergir, a retina de novo em meio Ringer frescas, com ou sem drogas teste, usando uma placa de 6 poços (5 mL de Ringer / poço). Incubar a retina de 15 min para permitir a carga e difusão. </li><li> Lavar três vezes por 5 min cada um com média Ringer frescas, com ou sem drogas teste. </li><li> Fixar a retina com paraformaldeído a 4% em 0,1 M fosfato tampão (PBS, pH 7,4) por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Lave com 0,1 M PBS overnight a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, reagir wom 2% estreptavidina-Alexa 488 (concentração final 10 mg / mL) em 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, e manter durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar três vezes por 10 min cada um com 0,1 M PBS a RT </li><li> Em PBS, descolar a retina do papel de filtro e, em seguida, usando um pincel fino, coloque a retina, até fotorreceptoras lado-oriented, em um slide. </li><li> Suavemente montar com Vectashield meio de montagem (Vector Laboratories, Burlingame, CA). </li><li> Tirar fotos com um microscópio confocal de varredura a laser (por exemplo, Zeiss 510 META) na mesma ampliação, resolução e configurações para cada condição experimental, de modo que você pode comparar os efeitos de diferentes condições experimentais (teste de drogas, por exemplo, condições de iluminação) sobre a extensão da gap junção traçador de acoplamento (Fig. 2A-C e Figo. 4A-C). Embora uma única imagem pode conter todas as células marcadas, é recomendado que você coletar um z-stack da área de interesse e recolhê-la em um únicoda imagem. </li></ol> 3. Quantificação do traçador acoplamento com ImageJ <ol><li> No navegador de imagem LSM, abra a imagem, clique em Exportar e salvar a imagem como um pouco TIF-16 NÃO arquivo compactado. Barra de escala devem ser incluídos nesta imagem TIF. </li><li> NIH utilizando software ImageJ, medir a intensidade de fluorescência de Alexa-488-rotulados neurobiotin de ampliação de imagens de baixa todo-mount retinas. Abra o arquivo TIF utilizando o software ImageJ e desenhe uma linha reta correspondente à barra de escala. Ir para ANALISAR, SET SCALE e digite a distância conhecida e unidade de comprimento, em seguida, clique em OK. Agora os resultados da medição podem ser apresentados em unidades calibradas, como milímetros. </li><li> Selecione a área de interesse usando a ferramenta de seleção retangular. O pico de fluorescência deve ser posicionada na borda esquerda de sua seleção. Certifique-se que não há nenhum sinal de fluorescência perto da borda direita. Se não, rodar a imagem ativa (IMAGE, então ROTATE). </li><li> CliqueAnalisar e PLOT PERFIL. Você deverá ver uma curva com um decaimento exponencial da esquerda para a direita. </li><li> Clique em Copiar na janela pop-up e cole no EXCEL. Agora você vê duas colunas mostrando a distância do corte (coluna da esquerda) e da intensidade de fluorescência em função da distância a partir do corte (coluna da direita). </li><li> Divida cada valor bruto de fluorescência pelo valor máximo de fluorescência para obter a intensidade relativa de fluorescência. </li><li> Copiar duas colunas correspondentes à distância entre o corte (X) ea intensidade de fluorescência relativa (Y), e depois colá-los no software Origin. </li><li> Fit com o decaimento exponencial função # 1 (Fig. 2D e Fig. 4D.), Que está na forma: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) onde Y é a intensidade relativa de fluorescência, o Y é a fluorescência de fundo, Y max é o máximo relativo de fluorescência, λ é o space (comprimento) constante, e x é a distância entre o corte. </li><li> Compare o espaço constante (λ) valores em diferentes condições experimentais utilizando o t-test ou ANOVA (Fig. 2E e Figo. 4E). Note-se que técnicas alternativas de quantificação têm sido descritos por outros 13,14. </li></ol> 4. Resultados representante Exemplos representativos de células fotorreceptoras traçador de acoplamento, conforme determinado pelo corte de carga são apresentados nas Figuras 2 e 3 (peixes) e Figura 4 (coelho). Confocal imagens foram tiradas usando as mesmas configurações para comparação (Fig. 2A-C e Figo. 4A-C) ea intensidade de fluorescência foi plotado como uma função da distância a partir do corte e equipados pela função exponencial mostrada na No. 3,8 acima (Fig. 2D e Figo. 4D). Valores de espaço constante para cada condiçãosão mostrados nas Figuras 2E e 4E, ilustrando que a extensão do gap de acoplamento junção traçador pode ser quantificada usando a técnica de corte de carga. Além disso, os resultados são altamente reprodutível. Utilização da técnica de corte-carregamento como um meio de quantificar o grau de abertura de acoplamento junção traçador também é validado pela constatação de que a intensidade de fluorescência diminui exponencialmente como uma função da distância entre o corte em todos os casos examinados 7,8 (ver também Figs. 2D e 4D aqui), indicando que entrou no neurobiotin fotorreceptores através do corte de navalha, e não de outros sites da retina. Além disso, a diferença qualitativamente similares dia / noite em fotorreceptoras acoplamento marcador de células observadas em goldfish com injeções de traçador em cones simples e com corte de carga-7 substancia corte de carga, como um meio relativamente precisas de medir a extensão do acoplamento fotorreceptoras. O corte-lOLOCAR técnica também pode ser usado para investigar outros tipos de sinapses elétricas na retina. Por exemplo, a Figura 5 ilustra esse coelho tipo A (Fig. 5A) e tipo B (Fig. 5B) células horizontais exibem homóloga tracer acoplamento seguintes corte de carga ea difusão das neurobiotin sob condições de adaptação ao escuro. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> Peixe </td><td> Mouse </td><td> Coelho </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 3,1 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> - </td><td> 0,1 </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Composição das soluções de Ringer para mouse goldfish e retinas de coelhos. As concentrações são apresentados em mM. Soluções de Ringer são aeradas com 5% de CO 2 / 95% O 2 e mantidos a 22 ° C (peixe) ou 36 ° C (mamíferos). &quot;-&quot;: Não incluídos na campainha para esta espécie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> Figura 1:. Fluxograma mostrando o procedimento de corte de carga. Após o isolamento of intacta retina neural, vários cortes radiais foram feitas por uma lâmina que foi mergulhado em solução neurobiotin 0,5%. A retina foi incubado por tracer carga e difusão, e depois lavadas antes de fixação com paraformaldeído a 4% (PFA) em 0,1 M tampão fosfato (PB). Tracer acoplamento foi examinada usando-estreptavidina conjugados Alexa-488. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> Figura 2. Vigília-diferença no marcador no fotorreceptor acoplamento peixinho é revelada pela técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junção neurobiotin acoplamento traçador foi extensiva à noite (B) e no dia seguinte à aplicação de Espiperona (10 mM), uma seletiva de dopamina D antagonista do receptor 2 (C), mas não no dia, sob condições de controle (A). D) intensidade relativa normalizada fluorescentes como uma função da distância dos cortes (indicado por setas em AC). E) val espaço constanteues obtidos a partir dos dados em experimentos D e outros (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> Figura 3. Um exemplo representativo mostrando fluorescência na camada de células fotorreceptoras de uma retina de adaptação ao escuro da noite seguinte goldfish corte de carga com uma solução de ambos os neurobiotin e dextran rodamina. Rodamina dextran (mostrada em vermelho), que não se difunde através de canais de espaço aberto junção devido ao seu alto peso molecular (&gt; 10.000 MW), apenas células marcadas perto do corte. Em contraste, neurobiotin (mostrado em verde) difundida através de junções e pode ser visto em células fotorreceptoras longe da corte. A localização do corte é indicado pela seta em cada painel. Barra de escala: 200 mM. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> Figura 4. Day noite diferemcia no fotorreceptor tracer acoplamento em retina de coelho é revelada pela técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junção neurobiotin acoplamento traçador foi extensiva à noite (B) e no dia seguinte à aplicação de Espiperona (10 mM) (C), mas não no dia, sob condições de controle (A). Na AC, vistas perpendicular da reconstrução 3D de fotorreceptores coelho perto do corte são mostrados. D) intensidade relativa normalizada fluorescentes como uma função da distância dos cortes. E) valores Espaço constante obtida a partir dos dados em experimentos D e outros (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> Figura 5. Cut-loading revela que de adaptação ao escuro coelho células horizontais são tracer acoplados. Tanto do tipo A-(A) e tipo B (B) em células horizontais de adaptação ao escuro retinas de coelhos expostos homóloga neurobiotin acoplamento marcador.

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Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de corte de carga descrito aqui é uma técnica útil e simples para determinar a extensão da brecha de acoplamento tracer junção entre os neurônios da retina em condições de iluminação diferentes e em momentos diferentes do dia e da noite. Vantagens desta técnica incluem a capacidade de quantificar a extensão do hiato de acoplamento tracer junção entre neurônios no tecido da retina intacta sob uma variedade de condições de iluminação durante o dia e noite, para fazê-lo para os neurônios acoplados que somata de pequeno diâmetro. Limitações da técnica no estudo de junções em queda tecido intacto em duas categorias gerais. Primeiro, tracer difusão através junções abertas pode ser relativamente difícil de observar devido a um) o diâmetro pequeno ou da carga associada com os canais abertos e b) os volumes relativos dos compartimentos celulares acoplados 1,14,15. Isto é, difusão traçador de uma célula pequeno para um celular ou um grupo de células acopladas, compared à difusão de um traçador célula maior para um menor de células, podem ser mais difíceis de detectar devido à diluição do marcador. Segundo, sob algumas condições fisiológicas, a extensão da difusão através tracer junções no tecido intacto pode não refletir a força da condutância juncional gap devido a diferenças na condutância de pequenos corrente elétrica de transporte de íons, em comparação com a permeabilidade do marcador relativamente grande moléculas 1,14,15. Em geral, as evidências de marcador de acoplamento sugere fortemente a presença de funcionamento, os canais de junção aberta lacuna, mas sob algumas condições fisiológicas, a difusão de traçador pode não ocorrer ou ser observado ainda que as gravações eletrofisiológicas sugerem a presença de funcionamento, junções abertas. Parece provável que a técnica de corte de carga também pode ser usado para investigar o grau de abertura de acoplamento tracer junção entre os neurônios no tecido intacto de outras regiões do sistema nervoso centraltem.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Tricaina sulfonato de metano (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L de água tamponada tanque de peixes </td></tr><tr><td> Uretano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 doses g / kgloading </td></tr><tr><td> Tubo duplo Night Vision Goggle </td><td> Noite Optics EUA </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> O filtro de papel, No. Grau 4 </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça fina, Dumont n º 5, Biologie, 11 cm de comprimento </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Tesoura fina, de mola, 8 blade mm, em linha reta </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vetor </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Estreptavidina conjugada Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran rodamina (alta (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield meio de montagem </td><td> Vetor </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 Laser Scanning META microscópio confocal </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Software ImageJ </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8,0 </td><td> OriginLab Corp </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

Além da transmissão sináptica química, os neurônios que são conectados por junções também podem se comunicar rapidamente via transmissão sináptica elétrica. Crescentes evidências indicam que as junções não só permitem o fluxo de corrente elétrica e atividade síncrona entre as células interligadas ou acoplados, mas que a força ou a eficácia da comunicação elétrica entre as células acopladas pode ser modulada para um 1,2 em grande medida. Além disso, o diâmetro interno grande (~ 1,2 nm) de canais de derivação muitos gap permite não apenas o fluxo de corrente elétrica, mas também a difusão de moléculas sinalizadoras intracelulares e metabólitos pequena entre as células interligadas, de modo que junções podem também mediar a comunicação metabólica e química . A força da comunicação juncional gap entre os neurônios e sua modulação por neurotransmissores e outros fatores podem ser estudados em simultâneo eletricamente gravação a partir de células acopladas e determinando ta amplitude de difusão de moléculas de traçador, que são permeáveis ​​junção gap, mas não membrana permeável, após a injeção de iontoforese em células individuais. No entanto, estes procedimentos podem ser extremamente difícil de executar em neurônios com somata pequena no tecido nervoso intacto. Numerosos estudos sobre sinapses elétricas ea modulação da comunicação elétrica foram realizados na retina dos vertebrados, uma vez que cada um dos cinco tipos de neurônios da retina é eletricamente conectados por junções gap 3,4. Crescente evidência mostrou que o relógio (24 horas) circadiano da retina e alterações na estimulação luminosa regular junção gap acoplamento 3-8. Por exemplo, trabalhos recentes têm demonstrado que o relógio circadiano da retina diminui o acoplamento gap junção entre haste e células fotorreceptoras cone durante o dia, aumentando a ativação do receptor de dopamina D2, e aumenta consideravelmente a haste cone de acoplamento durante a noite, reduzindo a ativação do receptor D2 <sup&gt; 7,8. No entanto, não são apenas estes estudos extremamente difícil de executar em neurônios com somata pequena no tecido neural intacta retina, mas pode ser difícil de controlar adequadamente as condições de iluminação durante o estudo eletrofisiológico de neurônios da retina única para evitar a luz induzida por mudanças na junção gap condutância. Aqui, apresentamos um método simples de determinar a extensão da abertura de acoplamento tracer junção entre os neurônios da retina em condições de iluminação diferentes e em momentos diferentes do dia e da noite. Esta técnica de corte-carregamento é uma modificação da carga raspar 12/09, que é baseada na carga do corante e difusão através de canais de junção aberta lacuna. Loading raspar funciona bem em cultura de células, mas não em fatias grossas, tais como retinas intactas. A técnica de corte-carregamento tem sido utilizado para estudar o acoplamento de fotorreceptores em retinas de peixe intacto e mamíferos 7, 8,13, e pode ser usado para estudar o acoplamento entreoutros neurônios da retina, como descrito aqui.

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Um método fácil e conveniente para determinar a extensão do hiato de acoplamento tracer junção entre os neurônios da retina é descrito. Esta técnica permite uma para investigar a função das sinapses elétricas entre os neurônios na retina intacta sob condições de iluminação diferentes e em momentos diferentes do dia e da noite.

Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

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Neuroscience

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Vídeo: Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

Transfecção de anticorpos em neurônios como uma ferramenta para estudar a patogênese da doença

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

A dupla Tracer PET-MRI Protocolo para a medida quantitativa da Regional cérebro substratos energéticos Captação no Rato

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

Um pipeline padronizado para examinar morfometria de matéria cinzenta cerebelar humana usando ressonância magnética estrutural

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...