この作品は、CPRにSCMとEY018640にNIHの助成金EY005102によって賄われていた

1。金魚、マウスおよびウサギの無傷の神経網膜の準備<ol><li>一定の周囲（背景）照明の下で説明されているものを含め、次の手順のすべて、&quot;2）カットの読み込みを、&quot;実行。このプロトコルの目的のために、手続きは（つまりは非常に暗い（つまり、&quot;暗所視&quot;）の条件で≤0.0001ルクス）をナイトビジョン赤外線ゴーグルを使用して一定の暗さにように行わ記述されているが、一定の周囲の照明の他の高強度レベルに注意してくださいギャップ結合のトレーサーのカップリングの周囲の照明の他のレベルの効果を決定する代わりに使用することができます。 </li><li>手術の前に少なくとも1時間のための実験動物（金魚、マウスまたはウサギを）暗順応。 </li><li>前述の7に記載、深くtricaineメタン（MS222;（炭酸水素ナトリウムを含む）バッファリング水槽の水の150 mg / L）をにそれらを置くことによって金魚を麻酔し、深くケタミン（100 mgとマウスを麻酔/ kgを、IP）とrompun（10 mg / kgを、IP）。深くウレタンでウサギを麻酔（負荷投与量：2.0 g / kgの、IP）とも地元の眼窩内の麻酔を（2％キシロカイン）を使用して、前述の8を説明。動物の管理と使用を含むすべての実験手順は、連邦政府のガイドラインに従って実施されるべきであると地元の大学の動物のケアと使用委員会によって審査され承認される。 （注：実験では魚、マウスやウサギの世話及び使用に伴うすべての実験手順は、NIHのガイドラインに沿って行われたとオハイオ州立大学動物実験および使用委員会によって審査され承認された、ここで説明。） </li><li>魚、マウスやウサギの場合は、摘出後に、各眼球の前方部分を削除してください。その後、ろ紙の目の後部の下になるように、眼の後部の上にろ紙片を置き、ろ紙と目を反転させる。その後、細かい使用して鉗子は、そっとろ紙に接続されている神経網膜、から、お互いに接続されている色素上皮/脈絡膜/強膜を、はげることによって眼の後部から無傷の神経網膜を細かく分析。これが行われているように、微細なバネ付きはさみを使用して視神経を切断。神経網膜、指向光受容体サイドアップは、現在、ろ紙に取り付けられており、目の残りの部分から分離する必要があります。 </li></ol> 2。カットローディング<ol><li>ある一定の周囲（背景）イルミネーション（非常に暗い（つまり、&quot;暗所視&quot;）の条件の下など）の下で30分間、6ウェルプレート（〜5 mLの/ウェル）の有無に関係なく酸素化リンガー溶液（ 表1）の水没は、網膜被験薬。パラフィルムで6ウェルプレートを封止することによって重炭酸塩ベース（5％CO 2 / 95％O 2）酸素リンゲル22℃での魚の網膜を維持し、36で、マウスとウサギ網膜を維持℃、5％CO 2 /のCを95％O <suB&gt; 2インキュベーター。被験薬が使用されている場合、それは固定するまで、後続のすべてのステップの間に存在する必要があります</li><li>網膜を切開する直前に、リンゲル溶液でneurobiotin（0.5％）、ビオチン化分子を、溶解してトレーサー液を（通常は100μL）を用意。 0.5パーセントは、ローダミンデキストランが（高い（&gt; 10,000）MW）ソリューションに追加される可能性があることに注意してください。その高分子量のために、ローダミンデキストランは、ギャップ結合とカットによって損傷されているラベルだけのセルを越えることはありません。 図に示す。 3、これは彼らが負傷されているので、ギャップ結合を介して拡散によりトレーサーを蓄積してきたものから、neurobiotin蓄積して細胞を区別する便利な方法です。 </li><li>ガラス（またはプラスチック）ペトリ皿にneurobiotinソリューションを配置する、、過剰リンガーを削除neurobiotinソリューションで、かみそりの刃を（または他の鋭利な刃）ディップとするペーパータオルの上に網膜が添付されている濾紙を、、タップ市販nは、網膜と濾紙でラジアルカットを行います。優先の場合、スペーサはそのカットが網膜を介して行われていることではなく、濾紙を使用することができます。カットは、網膜表面に垂直に配向してください。再びneurobiotinのソリューションで、かみそりの刃を浸して網膜をもう一度カット。網膜ごとに4カット（ 図1参照 ）にこの設定を繰り返します。マウスや他の小さな網膜を通してかみそりの削減を行うときに解剖顕微鏡を使用してください。 </li><li> 図に示す。被験薬の有無にかかわらず1、新鮮なリンゲル培地で再び水没網膜を、、（5mLのリンゲル/ウェル）ウェル6プレートを使用して。ローディングと拡散を可能にするために15分間網膜をインキュベートする。 </li><li>被験薬の有無に関係なく新鮮なリンゲル培地で5分間ずつ3回洗浄する。 </li><li>室温で1時間、0.1 Mリン酸緩衝液（PBS、pH7.4）中4％パラホルムアルデヒドで網膜を修正。 </li><li>一晩4 0.1 M PBSで洗浄℃に</li><li>翌日、反応させるワットi番目の百分の二0.1M PBSでストレプトアビジン-アレクサ488（最終濃度10μg/ mLの）+ 0.3％トリトンX - 100、および4℃で一晩おく℃に</li><li>室温で10分0.1M PBSで各3回洗浄し</li><li> PBS中で、微細なブラシを使用して、次にろ紙から網膜をデタッチし、スライドの上に、網膜、指向光受容側の上に置きます。 </li><li>優しくVectashieldマウンティング培地（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）でマウントされます。 </li><li>の範囲で、別の実験条件（照明条件などの試験薬）の効果を比較できるように、すべての実験条件で同じ倍率、解像度と設定で共焦点顕微鏡（例えばツァイス510 META）をスキャンするレーザーを使用して撮影をするギャップジャンクショントレーサー結合した（ 図2A - C及び図4A - C）。単一のイメージが標識された細胞のすべてが含まれることもありますが、それはあなたが興味のある領域のz -スタックを収集し、単一にそれを折りたたむことをお勧めしますイメージ。 </li></ol> 3。 ImageJを用いてトレーサー結合の定量化<ol><li> LSMの画像ブラウザで、画像を開いて、TIF - 16ビットの圧縮されないファイルとしてエクスポート]をクリックして画像を保存します。スケールバーは、このTIF画像に含まれるべきです。 </li><li> NIH ImageJのソフトウェアを使用して、ホールマウント網膜の低倍率像からのAlexa - 488標識neurobiotinの蛍光強度を測定する。 ImageJのソフトウェアを使用してTIFファイルを開き、[スケールバーに対応する直線を引く。スケールを設定し、長さの既知の距離と単位を入力し、解析を行うに移動し、[OK]をクリックします。今すぐ測定結果は、ミリメートルキャリブレーション単位で表示することができます。 </li><li>長方形選択ツールを使用して、関心の領域を選択します。蛍光のピークは、選択枠の左側に配置する必要があります。右の境界付近には蛍光シグナルがないことを確認してください。されていない場合は、アクティブな画像（IMAGE、頭を矢印）を回転させる。 </li><li>クリックして分析し、PROFILEをプロットします。あなたは左から右に指数関数的減衰を持つカーブが表示されるはずです。 </li><li>ポップアップウィンドウでCOPYをクリックし、EXCELに貼り付けます。これではカット（左列）とカット（右列）からの距離の関数として蛍光強度から距離を示す二つの列を参照してください。 </li><li>相対蛍光強度を得るために最大蛍光値によって各生の蛍光値を割ります。 </li><li> [コピー]は、2つのカット（X）と相対蛍光強度（Y）からの距離に対応する列、およびOriginソフトウェアに貼り付ける。 </li><li>指数減衰形になっている＃1関数（。図2D及び図4D）、とのはめあい。 Y = Y 0 + Y 最大 * EXP（- X /λ） Yは相対蛍光強度である場合、Y oはバックグラウンドの蛍光であり、Y maxは最大相対蛍光であり、λはspです。エース（長さ）定数、xはカットからの距離です。 </li><li> t検定またはANOVAを（ 図2E及び図4E）を使用して、異なる実験条件で空間定数（λ）の値を比較します。定量化の代替技術が他人13,14によって記述されていることに注意してください。 </li></ol> 4。代表的な結果カットロードによって決定されるカップリング光受容体細胞トレーサーの代表的な例は、 図2及び図3（魚）と図4（ウサギ）で表示されます。共焦点画像は、比較のために、同じ設定を使用して撮影した（ 図2A - C及び図4A - C）と蛍光強度がカットからの距離の関数としてプロットし、上記の3.8号に示すように指数関数でフィッティングした（ 図2D及び図4D）。各条件のためのスペースの定数値ギャップ結合トレーサーの結合の程度がカットローディングテクニックを使用して定量することができること示す、2Eと4E図に示されています。さらに、結果は高い再現性です。ギャップ結合トレーサーの結合の程度を定量化する手段として、カットローディングテクニックの使用はまた、蛍光強度はすべてのケースでカットからの距離の関数として指数関数的に減少することを見つけることによって検証されること（また、 図を参照してください。7,8の検討neurobiotinは、他の網膜のサイトからレザーカットではなく、経由して光受容体に入ったことを示すここで2Dと4D）、。また、光受容体細胞トレーサーのカップリングで質的に類似昼/夜の違いは、シングルコーンにトレーサーの注射と金魚とカットローディング7で観察光受容体の結合の程度を測定するのが比較的正確な手段として、カットローディングを立証する。 カット- Loading技術はまた、網膜で電気シナプスの他のタイプを調査するために使用することができます。例えば、 図 5は、そのウサギ型（ 図5A）およびB型（ 図5B）水平細胞を示して暗順応条件下でneurobiotinの以下のカットローディングと拡散を結合相同トレーサーを示す。 <table border="1"><tbody><tr><td> 化合 </td><td> 魚 </td><td> マウス </td><td> ウサギ </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td>飽和NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2の </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td>し、MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td>グルタミン</td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2で </td><td> 0.7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> 表1：金魚、マウスおよびウサギ網膜のためのリンガーのソリューションの構成。濃度は、mm単位で表示されます。リンガーのソリューションは、5％CO 2 / 95％O 2でバブリングし、22 ° C（魚）または36 ° C（哺乳類）に維持されています。 &quot; - &quot;：この種のためのリンガーに含まれていない。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> 図1：。カットローディング手順を示すフローチャート。分離O後fは無傷の神経網膜は、いくつかの半径方向のカットは、最初に0.5％neurobiotin溶液に浸漬したブレードによってなされた。網膜は、トレーサーのローディングと拡散インキュベートし、0.1Mリン酸緩衝液（PB）の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定する前に洗浄した。トレーサーカップリングはAlexa - 488ストレプトアビジンコンジュゲートを使用して検討した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> 図2：金魚の光受容体トレーサー結合における昼夜の違いは、カットローディング手法によって明らかにされます。光受容体細胞のギャップジャンクションneurobiotinトレーサーの結合は、制御の条件（）で夜間（B）でとペロンの日の次のアプリケーション（10μM）、選択的ドーパミンD 2受容体拮抗剤（C）ではなく、一日で広範囲だ。カット（ACの矢印で示した部分）からの距離の関数としてD）正規化された相対蛍光強度。 E）スペース定数valはDと他の実験（n = 4）のデータから得られたUES。 *** P &lt;0.001。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> 図3。neurobiotinとローダミンデキストランの両方のソリューションでカットのロードを以下の夜間暗順応金魚の網膜の光受容体細胞層に蛍光を示す代表的な例。その高分子量（&gt; 10,000 MW）、カットの近くにのみ標識された細胞によるオープンギャップ結合チャネルを介して拡散しないローダミンデキストラン（赤で表示）、。対照的に、ギャップ結合を介して拡散neurobiotin（緑で表示）とは、遠くのカットから視細胞で見ることができます。カットの位置は、各パネルの矢印で示されます。スケールバー：200μmの。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> 図4。昼夜異なるウサギの網膜で結合光受容体トレーサーのリファレンスがカットローディング手法によって明らかにされます。光受容体細胞のギャップジャンクショ​​ンneurobiotinトレーサーの結合は、制御の条件（）で一日ではないスピペロン（10μM）（C）のアプリケーションは、次の夜（B）で、日中の豊富なだったが、。 ACで、カットの近くにウサギの光受容体の3次元再構成の垂直のビューが表示されます。カットからの距離の関数としてD）正規化された相対蛍光強度。 E）Dと他の実験（n = 3）のデータから得られた空間の定数値は、。 *** P &lt;0.001。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> 図5。カットローディングは、暗順応ウサギ水平細胞はトレーサーが結合されていることを明らかにする。型（）とB型の両方（B）暗順応ウサギの網膜の水平細胞は、相同neurobiotinトレーサーの結合を示した。

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	<li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain.">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li><li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain.">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li><li>Vaney, D. 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K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway.">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li><li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP.">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li><li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. 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Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで説明するカットローディング方式は、異なる照明条件下での昼と夜の異なる時期に網膜ニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を決定するために有用と簡単なテクニックです。この手法の利点は、昼と夜の間に照明の様々な条件の下で無傷の網膜組織の神経細胞間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を定量化するために、小径のsomaの複数形を持つ結合ニューロンのためにそうする機能が含まれています。 2つのカテゴリに無傷の組織の秋にギャップジャンクショ​​ンの研究では手法の限界。最初に、オープンギャップ結合を介してトレーサーの拡散がのために観察することが比較的困難な場合があります）の小径やオープンチャネルと結合し細胞内区画1,14,15のb）の相対的なボリュームに関連付けられている電荷。それは、小セルから結合セルの大きいセルまたはグループ、カンプのトレーサー拡散です大きいセルから小さいセルにトレーサーの拡散にared、トレーサー希釈のために検出するのは難しいかもしれません。第二に、いくつかの生理的条件下では、無傷の組織におけるギャップ結合を介してトレーサーの拡散の程度は正確に比較的大きなトレーサーの浸透性に比べて、小型電気通電イオンの伝導度の違いによるギャップ結合コンダクタンスの強さを反映していない場合があります分子1,14,15。一般的には、トレーサー結合の証拠が強く機能し、オープンギャップ結合チャネルの存在を示唆しているが、一部の生理的条件下では、トレーサーの拡散は、電気生理学的記録が機能し、開いたギャップ結合の存在を示唆していても発生しないことがありますか観察される。 それは、カットローディング技術はまた、中枢神経sysの他の地域からの無傷の組織内のニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を調査するために使用できる可能性が高いと思わTEM。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> Tricaineメタンスルホネート（MS222） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A5040 </td><td>バッファリングされた水槽の水の150 mg / Lで</td></tr><tr><td>ウレタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> U2500 </td><td>を2g / kgloading用量</td></tr><tr><td>デュアルチューブナイトビジョンゴーグル</td><td>夜光学米国</td><td> D - 221 </td><td></td></tr><tr><td>ろ紙、グレード4号</td><td>ワットマン紙</td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td>ファイン鉗子、11センチデュモン5号、Biologie、 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295〜10 </td></tr><tr><td>ファインはさみ、ばね式、8ミリブレード、ストレート</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15025〜10 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td>ベクトル</td><td> SP - 1120 </td><td> 0.5パーセント</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン結合アレクサ488 </td><td>インビトロジェン</td><td> S11223 </td><td>二パーセント</td></tr><tr><td>デキストランローダミン（高い（&gt; 10,000）MW） </td><td>インビトロジェン</td><td> D1817 </td><td> 0.5パーセント</td></tr><tr><td> Vectashieldマウンティング培地</td><td>ベクトル</td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td>ツァイス510 METAレーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM - 5画像ブラウザ3,2,0,115 </td><td>カールツァイス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJのソフトウェア</td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLabの（株） </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

化学シナプス伝達に加えて、ギャップ結合によって接続されているニューロンは、電気シナプス伝達を介して急速に通信することができます。証拠を増やすと、ギャップ結合だけではなく、電流の流れとの相互接続または結合細胞間の同期活動を許可することを示しているが、結合セル間の強度や電気通信の有効性は、かなりの程度の1,2に変調することができます。さらに、多くのギャップ結合チャネルの大内径（〜1.2 nm）はギャップ結合が、代謝的および化学的コミュニケーションを仲介することができるように、細胞内シグナル伝達分子と相互接続されたセルの間の小さな代謝物の拡散にも電流が流れていないだけを許可しますが、 。ニューロンと神経伝達物質やその他の要因により、その変調の間のギャップ結合コミュニケーションの強さは、同時に電気的に結合細胞から記録することによって、tを決定することにより調べることができる単一細胞へのイオン導入注入後、彼はギャップジャンクショ​​ン透過性であるトレーサー分子の拡散の程度、ではなく、膜透過性、。しかし、これらの手順はそのまま神経組織の小さなsomaの複数形を持つニューロンに対して実行することは極めて困難になる可能性があります。 five網膜ニューロンタイプの各々が電気的ギャップジャンクション3,4によって接続されているため、電気シナプスと電気通信の変調に関する多くの研究は、脊椎動物の網膜で行われている。増加する証拠は、光刺激における網膜と変化の概日（24時間）クロックが3-8結合ギャップ結合を調節することが示されている。例えば、最近の作品は、網膜の概日時計は、ドーパミンD2受容体の活性化を増加させることにより、日中ロッドと錐体視細胞間の結合ギャップ結合を減少させる、そして劇的にD2受容体の活性化を減らすことにより、夜間のロッドコーンカップを増加させることが実証されています<suP&gt; 7,8。しかし、だけでなく、無傷の神経網膜組織の小さなsomaの複数形を持つニューロンに対して実行することは極めて困難なこれらの研究がありますが、それは十分にギャップ結合の光誘起変化を避けるために、単一の網膜神経細胞の電気生理学的研究の間に照明条件を制御することが困難な場合がありますコンダクタンス。 ここで、我々は、異なる照明条件下での昼と夜の異なる時期に網膜ニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を決定する簡単な方法を提示する。このカットローディング技術は、オープンギャップ結合チャネルを介して色素ローディングと拡散に基づいて9月12日ロードレイプの変更、です。スクレイプのロードは、培養細胞ではなく、そのような無傷の網膜のような厚いスライスでうまく動作します。カットローディング技術がそのまま魚と哺乳類の網膜7、8,13の光受容体の結合を研究するために使用されている、と間の結合を研究するために使用することができますここで説明するように他の網膜神経細胞、。

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

網膜ニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を決定するのは簡単で便利な方法が記載されている。このテクニックは1つが異なる照明条件下で、昼夜の別の回で無傷の網膜の神経細胞間の電気シナプスの機能を調べることができます。

カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K ビュー.  Ohio State University College of Medicine. 網膜ニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を決定するのは簡単で便利な方法が記載されている。このテクニックは1つが異なる照明条件下で、昼夜の別の回で無傷の網膜の神経細胞間の電気シナプスの機能を調べることができます。

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Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

神経科学

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

疾患の病因を研究するツールとしてのニューロンへの抗体のトランスフェクション

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

構造磁気共鳴イメージングを用いたヒト小脳灰白質形態測定検査のための標準化されたパイプライン

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...