Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Organisation von astrozytischen Netzwerken in Gehirnstrukturen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine unvoreingenommene Methode zur Zählung von Beschriftungszellen und zur Dokumentation ihrer anatomischen Organisation innerhalb einer definierten Struktur vorschlägt. Öffnen Sie ImageJFIJI, wählen Sie die gewünschte Datei aus, und klicken Sie im Importoptionenfenster des Bioformats auf OK.
Um einen Z-Stack neu zu definieren, der nur die optischen Slices enthält, die für den endgültigen Z-Stack benötigt werden, wählen Sie zuerst STK- und Z-Projekt aus, und klicken Sie dann auf den Stapelknopf in der Werkzeugleiste. Wählen Sie die maximale Intensität in der Projektionstypeinstellung aus. Speichern Sie die Datei, und benennen Sie sie als Stapeldatei.
Wenn die Bildgebungsdatei mehrere Kanäle enthält, verwenden Sie Bildfarbe und geteilte Kanäle, um nur den Kanal mit dem Bild des astrozytischen Netzwerks anzuzeigen. Überprüfen Sie die Pixeleinstellungen des Bildes, indem Sie Bild, Eigenschaften und Pixel mit einer Bilddimension auswählen. Verwenden Sie dann das Hintergrundwerkzeug, indem Sie den Prozess öffnen und den Hintergrund subtrahieren, um die Hintergrund-Biozytinbeschriftung zu entfernen.
Verwenden Sie die Vorschaufunktion, um den Rollenkugelradius festzulegen, der in der Regel auf 50 Pixel festgelegt ist. Wenn nach dem Hintergrundschritt eine weitere Rauschunterdrückung erforderlich ist, wählen Sie Prozess, Rauschen und Entfernen von Ausreißern aus. Wählen Sie hell in der Einstellung für die Ausreißer aus, und verwenden Sie die Vorschaufunktion, um den Radius und den Schwellenwert festzulegen.
Seien Sie vorsichtig mit dem Ausreißer-Tool entfernen, da es die Daten verwischen kann, wie hier gezeigt. Passen Sie den Schwellenwert mit Bild, Anpassen, Schwellenwert. Wählen Sie den Standard- und B- und W-Modus aus.
Klicken Sie auf Bewerben. Konvertieren Sie das Bild in ein binäres Bild mit dem binären Prozesswerkzeug, indem Sie Prozess, Binärdatei auswählen und binär machen. Speichern Sie die Datei als tiff-Datei, und benennen Sie sie als Binärdatei.
Um Zellen zu zählen, legen Sie zuerst den Messtyp fest, indem Sie auf Analysieren klicken und die Messung festlegen. Wählen Sie dann die Zentroide-Option aus. Stellen Sie sicher, dass die Binärdatei auf dem Bildschirm geöffnet ist.
Öffnen Sie erneut das Analysemenü, und wählen Sie dieses Mal Partikel analysieren aus. Wählen Sie als Nächstes Show und Umrisse aus. Dadurch wird eine neue Datei generiert, die das Ergebnis der Erkennung anzeigt.
Optimieren Sie die Parameter, um die Erkennung zu verfeinern. Um nur Zellen zu erkennen, verwenden Sie einen Größenwert zwischen 30 und 6000 und eine Zirkularität zwischen null und eins, wobei man einen perfekten Kreis und null eine zufällige Form definiert. Führen Sie die Erkennung aus, indem Sie auf OK klicken. Es werden zwei Tabellen angezeigt, eine Tabelle mit dem Titel Zusammenfassung, die die Anzahl der erkannten Zellen enthält, und eine Tabelle mit dem Titel Ergebnisse, die die X- und Y-Koordinaten jeder Zelle bereitstellt.
Kopieren Sie die Werte, und fügen Sie sie in eine Tabellenkalkulationsanwendung ein. Speichern Sie diese Tabelle unter der Namenserkennungstabelle. Eine Datei mit einem Diagramm erkannter Zellen wird ebenfalls angezeigt.
Speichern Sie diese Datei als Tiff-Datei unter der Namenserkennungsdatei. Wenn eine Gruppe von zwei oder mehr beschrifteten Zellen als einzelne Zelle mit dem Werkzeug "Analysepartikel" erkannt wird, verwenden Sie das Wassereinzugsgebiet-Werkzeug auf dem binären Bild, indem Sie Prozess, Binär- und Wasserscheide auswählen, bevor Sie das Werkzeug Analysepartikel anwenden. Um die Oberfläche der Netzwerke zu messen, verwenden Sie die Erkennungsdatei in ImageJ.
Klicken Sie mit der linken Maustaste, um das Polygonauswahlwerkzeug in der Symbolleiste auszuwählen. Klicken Sie erneut mit der linken Maustaste, um mit der Verfolgung eines Bereichs von Interesse (ROI) zu beginnen, der alle Zellen in der externen Peripherie des Netzwerks verbindet. Rechtsklick, um das Polygon zu schließen.
Öffnen Sie das festgelegte Messfenster, und wählen Sie die Bereichsoption aus. Öffnen Sie dann den ROI-Manager, und fügen Sie das verfolgte Polygon im ROI-Manager hinzu, indem Sie auf Hinzufügen klicken. Führen Sie die Messung aus, indem Sie im ROI-Manager auf Die Messgröße klicken.
Die Flächenmessung wird in einer Tabelle angezeigt und in Pixel ausgedrückt. Vergessen Sie nicht, diesen Wert mit einem Umrechnungsfaktor für das Mikroskop zu konvertieren, das verwendet wird, um den Wert in quadratischen Mikrometern zu erhalten. Öffnen Sie die Stapeldatei in ImageJFIJI, und identifizieren Sie die gepatchte Zelle mit ihrer stärkeren Beschriftungsintensität.
Öffnen Sie dann die Dateierkennungstabelle in einer Tabellenkalkulationsanwendung, und suchen Sie die Nummer, die der gepatchten Zelle zugeordnet ist, und die entsprechenden Koordinaten. Wenn sie nicht in der Lage ist, die gepatchte Zelle genau zu bestimmen, verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um den Bereich zu umgeben, in dem die Ablagerung von Biocytin dichter ist, und beziehen Sie sich auf diese Position als die der gepatchten Zelle. Verwenden Sie den ROI-Manager wie bisher, um einen ROI am Standort der gepatchten Zelle zu zeichnen und dem ROI-Manager hinzuzufügen.
Legen Sie als Nächstes die Messung fest, und wählen Sie die Zentroideoption aus. Klicken Sie im RIO-Manager auf Maß, um die Koordinaten des Schwerpunkts des verfolgten Bereichs zu erhalten. Verwenden Sie diese Koordinaten als Bezugspunkt für dieses spezifische Netzwerk.
Verwenden Sie diese Formel, um die Koordinaten jeder Zelle in Bezug auf die geflickte Astrozyten zu berechnen. Die Angabe der Koordinaten jeder Zelle in Bezug auf die geflickte Astrozyten ist ein wichtiger Schritt, um Vektor aus den geflickten Astrozyten zu berechnen. Verwenden Sie diese Formel, um die Koordinaten des Hauptvektors der bevorzugten Ausrichtung zu berechnen.
Der Hauptvektor der bevorzugten Ausrichtung des Netzwerks ist die Summe aller zuvor berechneten Vektoren für jede Zelle, die im Netzwerk enthalten ist. Teilen Sie die Länge des Hauptvektors durch die Anzahl der Zellen im Netzwerk, abzüglich einer, um die gepatchte Zelle auszuschließen, um die Werte zu normalisieren und Vergleiche zwischen Netzwerken zu ermöglichen. Um die Position jedes Netzwerks im Nakel von Interesse zu bestimmen, öffnen Sie zuerst das vier x-Bild mit einem Vektorbildeditor.
Multiplizieren Sie die Bemaßungen im Bemaßungsfenster mit fünf, um die Größe des Bildes von vier x zu erhöhen. Hier wurde das Bild mit 800 mal 800 Pixeln abgetastet, so dass die Sampling-Auflösung auf 4000 x 4000 Pixel geändert wird. Exportieren Sie die Datei im tiff-Format, und benennen Sie sie mit der Größe von vier x.
Richten Sie die obere linke Ecke des geänderten vier x-Bildes mit der unteren linken Ecke des Adobe Illustrator-Dokuments aus. Die Software stellt Koordinaten von einem unteren linken Ecke Referenzpunkt. Öffnen Sie das 20 x-Bild des Netzwerks.
Verwenden Sie die Binärdatei oder Erkennungsdatei, da sie einfacher auszurichten sind. Spielen Sie dann mit dem Deckkraftwerkzeug auf der Binärdatei des 20 x-Bildes, um es an dem in der Größe von vier x-Bildern geänderten Bild auszurichten. Wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist, wählen Sie das Pipettenwerkzeug aus und halten Sie es so, dass das Messwerkzeug angezeigt wird, und wählen Sie es in der linken Symbolleiste aus.
Klicken Sie mit dem Messwerkzeug auf die obere linke Ecke des 20 x-Bildes, um die Koordinaten des 20 x Referenzpunktes auf das geänderte vier x-Bild zu erhalten. Diese 20 x referenziellen Koordinaten sind nützlich, um die Position jedes Netzwerks auf einer schematischen Zeichnung des Kerns auszudrücken. Um die Daten zusammenzufassen, wird die Normalisierung des Kerns als Rechteck verwendet.
Verwenden Sie dazu das Polygonwerkzeug, um den Kern im in der Größe von vier x geänderten Bildern zu umgeben. Öffnen Sie dann den ROI-Manager, und fügen Sie den gezeichneten ROI hinzu. Verwenden Sie Bild mit transparenten Lichtern, wenn die Ränder des Kerns nicht sichtbar sind, in diesem Fall denken Sie daran, die Größe zuerst zu ändern.
Wählen Sie bei der festgelegten Messung die Option "Umgrenzte Rechteck" aus, um das kleinste Rechteck innerhalb des gezeichneten Kerns zu berechnen. Klicken Sie schließlich auf Messen, und führen Sie dann die Schritte im geschriebenen Protokoll aus, um die koordinaten der beschrifteten Zellen in einem normalisierten Kern auszudrücken, der durch das umgebende Rechteck dargestellt wird. Ein einziger Astrozyten im dorsalen Teil des trigeminusten Sensorischen Kerns, beschriftet mit SR101, wurde für die Vollzellaufnahme bestimmt und mit 0,2% Biozytin gefüllt.
Elektrische Stimulation des fünften Trakts erhöhte die Biozytin-Etikettierung im dorsalen Teil des trigeminusten sensorischen Hauptkerns, was eine Erhöhung der Anzahl der gekoppelten Zellen darstellt. Astrozytäre Netzwerke bleiben im dorsalen Teil des trigeminusten Sensorischen Kerns und ihrer Hauptorientierung eingeengt. Diese Technik wurde entwickelt, um astrozytische Netzwerke innerhalb einer definierten Struktur zu positionieren, kann aber verwendet werden, um die Position der Population der beschrifteten Zelle in jeder Struktur auszudrücken.
