이 작품은 심폐소생술에 SCM과 EY018640에 NIH 부여 EY005102에 의해 투자되었다

1. 금붕어, 쥐 및 토끼에 대한 완전한 신경 망막의 준비 <ol><li> 상수 주변 (배경) 조명 아래에서 설명을 포함하여 다음 단계의 모든 &quot;2) 컷 로딩&quot;을 수행합니다. 이 프로토콜의 목적, 절차 (즉, 매우 어두운 (예 : &quot;scotopic&quot;) 조건 하에서 ≤ 0.0001 룩스)를 야간 적외선 고글을 사용하여 지속적인 어둠에서와 같이 수행 설명되어 있지만, 끊임없이 주변 조명의 다른 높은 농도 수준 점에 유의하십시오 간격 접합 추적 커플링에 주변 조명의 다른 수준의 효과를 결정하는 대신 사용할 수 있습니다. </li><li> 어두운 적응 수술하기 전에 적어도 1 시간에 대한 실험 동물 (금붕어, 마우스 또는 토끼). </li><li> 마찬가지로 이전에 7 설명한 깊이 tricaine methanesulfonate (MS222, (나트륨 중탄산염 함유) 버퍼된 수조 물 150 MG / L)에서 그들을 배치하여 금붕어를 마취하고, 깊이 케타민을 (100 MG와 마우스를 마취/ kg, IP)와 rompun (10 MG / kg, IP). 깊이 우레탄과 토끼를 (선량로드 : 2.0 g / kg, IP)을 마취 또한 지역 intraorbital 마취 (2 % Xylocaine)를 사용하는 등 이전에 8 설명했다. 동물의 관리 및 사용과 관련된 모든 실험 절차는 연방 지침에 따라 수행되어야하며 지방 대학 동물 관리 및 사용위원회의 검토와 승인을 수 있습니다. (참고 :. 실험이 여기에 설명된에서 물고기의 보호 및 사용에 관련된 모든 실험 절차, 마우스 및 토끼는 NIH의 지침에 따라 수행되었으며 검토되었으며 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인) </li><li> 생선, 마우스 및 토끼 들어, 핵의 제거 다음, 각 안구의 앞쪽에 부분을 제거합니다. 그런 다음, 필터 종이 눈의 후부 부분 아래가되도록, 눈의 뒷부분 부분 위에 필터 종이를 놓고 필터 종이와 눈을 반전. 그렇다면, 괜찮아요 사용포셉 부드럽게 필터 종이에 붙어있는 신경 망막에서 서로에 연결된 안료 상피 / 맥락막 / 공막엔를 물러나고하여 안구의 후부 부분에서 신경 망막 손상을 해부하다. 이것이 완료되면서, 고급 용수철 가위를 사용하여 시신경을 절단. 신경 망막, 중심 photoreceptor 쪽까지가 현재 필터 종이에 붙어 눈의 나머지 부분에서 분리해야합니다. </li></ol> 2. 잘라내기 - 로딩 <ol><li> 과 일정한 주위 (배경) 조명 (아주 어두운 (예 : &quot;scotopic&quot;) 조건 등)에 따라 30 분 6 잘 플레이트 (~ 5 ML / 음)의 여부에 상관없이 산소 울리는의 솔루션 (표 1) 잠수함은 망막 테스트 약물. parafilm으로 6 잘 판을 밀봉하여 산소의 물고기 망막 (5 % CO 2 / 95% O 2) 중탄산염 기반 울리는가 22의 ° C를 유지하고 5 %의 CO에서 36 ° C에서 마우스와 토끼 망막을 유지 2 / 95% O <suB&gt; 2 인큐베이터. 테스트 약물을 사용하면 고정 때까지 이후의 모든 단계 동안에 존재한다 </li><li> 즉시 망막을 통해 절단하기 전에 울리는의 솔루션에 neurobiotin (0.5 %), biotinylated 분자를 해소하여 추적 솔루션 (일반적으로 100 μL)를 준비합니다. 0.5 %가 rhodamine dextran가 (높은 (&gt; 10,000) MW) 솔루션에 추가할 수 수 있습니다. 높은 분자량으로 인해, rhodamine dextran은 간격 분기점 및 절단에 의해 손상된 경우에만 레이블 세포를 건너하지 않습니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3 이것은 그들이 부상 되었기 때문에 간격 분기점을 통해 확산하여 추적기 축적된 것을 사람에서 neurobiotin 축적이 세포를 구별할 수있는 유용한 방법입니다. </li><li> 유리 (또는 플라스틱) 페트리 접시에 neurobiotin 솔루션을 장소, 초과 벨소리를 제거 neurobiotin 솔루션의 면도날 (또는 다른 날카로운 블레이드) 수영 및 종이 타월에있는 망막이 첨부된입니다 필터 종이, 탭N 망막 및 필터 종이를 통해 방사형 몫을합니다. 원하는 경우, 스페이서는 컷이 망막을 통해 만들어진,하지만 필터 종이되도록 사용할 수 있습니다. 상처는 망막 표면에 수직 방향으로해야합니다. 다시 neurobiotin 솔루션에 면도날을 찍어 및 망막에게 두 번째 시간을 했네요. 망막마다 네 상처 (그림을 참조하십시오. 1)이 최대를 반복합니다. 마우스 및 기타 소형 망막을 통해 면도기 인하시 해부 현미경을 사용합니다. </li><li> 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 잘 6 판 (5 ML 벨소리 / 음)를 사용 또는 테스트 약물없이 1, 잠수함 신선한 벨소리의 중간에 다시 망막,. 로딩 및 확산 수 있도록 15 분에 대한 망막를 품어. </li><li> 5 분마다 신선한 울리는의 매체 또는 테스트 약물없이 세 번 씻으십시오. </li><li> RT에서 1 시간을 위해 0.1 M 인산 버퍼 (PBS, pH를 7.4)에 4 % paraformaldehyde로 망막을 수정. </li><li> 4 박 0.1 M PBS로 씻으 ° C. </li><li> 그 다음날, 반응 with 2% 0.1M PBS에 streptavidin - 알렉사 488 (최종 농도가 10 μg / ML) + 0.3 % 트리톤 X - 100, 4에서 하룻밤 보관 ° C. </li><li> 10 분 각각의 RT에서 0.1M PBS로 세 번 씻어 </li><li> PBS에 좋은 브러쉬를 사용하여 다음 여과지에서 망막을 분리하고, 슬라이드에, 망막, 중심 photoreceptor 쪽 올려 놓습니다. </li><li> 부드럽게 Vectashield 설치 매체 (벡터 연구소, Burlingame, CA)를 탑재합니다. </li><li> 의 범위에서, 당신은 다른 실험 조건 (조명 조건 예를 들어, 테스트 약품)의 효과를 비교할 수 있도록, 모든 실험 조건에 대해 동일한 배율, 해상도 및 설정에 공촛점 현미경 (예 : 자이스 혈구 510 META)을 스캔 레이저로 사진을 찍고 갭 접합 추적기 커플링 (그림 2A - C와 그림. 4A - C). 하나의 이미지가 라벨 세포를 모두 포함할 수 있지만, 그것은 당신이 관심 영역의 Z - 스택을 수집하고 단일로 축소하는 것이 좋습니다이미지. </li></ol> 3. ImageJ를 사용하여 추적 커플링의 부량 <ol><li> LSM 이미지 브라우저에서 이미지를 열고 수출 및 파일을 압축되지 TIF - 16 비트로 사진을 저장합니다. 스케일 바이 TIF 이미지에 포함되어야합니다. </li><li> NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 전체 마운트 망막의 낮은 배율 이미지 알렉사 - 488 - 라벨 neurobiotin의 형광 강도를 측정합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 TIF 파일을 열고 다음 규모 표시줄에 해당하는 직선을 그립니다. , ANALYSE로 이동 규모를 설정하고 유명한 거리와 길이 단위를 입력한 다음 확인을 누릅니다. 지금 측정 결과는 같은 밀리미터로 보정 단위로 표시하실 수 있습니다. </li><li> 사각 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 형광의 피크는 선택의 왼쪽 경계에 위치해야합니다. 오른쪽 국경 근처에는 형광 신호가 없다는 것을 확인하십시오. 그렇지 않으면 활성 이미지 (IMAGE 후, 회전)을 돌린다. </li><li> 를 클릭하십시오ANALYSE와 프로필을 플롯. 당신은 오른쪽으로 왼쪽에서 기하 급수적으로 부패와 커브를 볼 수 있습니다. </li><li> 팝업 윈도우에서 복사를 클릭하고 Excel에 붙여 넣으십시오. 이제 당신은 그 상처에서 거리의 함수로 컷 (왼쪽 열)과 형광 강도 (오른쪽 열)에서 거리를 보여주는 두 개의 열이을 참조하십시오. </li><li> 상대 형광 강도를 얻기 위해 최대 형광 값에 의해 각 원시 형광 값을 나누십시오. </li><li> 다음 컷 (X)와 상대 형광 강도 (Y)의 거리에 해당하고, 복사 두 개의 열이는 원산지 소프트웨어에 그들을 붙여 넣습니다. </li><li> 지수 붕괴 형태에 # 1 함수 (. 그림 2D 및 그림 4D)와 맞추기 : Y = Y 0 + Y 최대 * EXP (- X / λ) Y의 상대 형광 강도가 어디 있는지, Y O가 배경 형광이며, Y 맥스가 최대 상대 형광이며, λ은 SP입니다ACE (길이) 상수, 그리고 X는 컷의 거리입니다. </li><li> T - 테스트 또는 ANOVA를 (그림의 2E와 그림. 4E)를 사용하여 다양한 실험 조건에서 공간을 상수 (λ) 값을 비교합니다. 부량의 대체 기법은 다른 13,14에 의해 설명했습니다합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 컷 - 로딩에 의해 결정된 커플링 photoreceptor 세포 추적의 대표 예는 그림 2와 3 (생선)와 그림 4 (토끼)에서 제공됩니다. 공촛점 이미지 컷에서 거리의 함수로 꾸몄다 이상 번호 3.8에 표시된 지수 함수에 의해 장착되었습니다 비교 (그림 2A - C와 그림. 4A - C) 및 형광 강도에 대해 동일한 설정을 사용하여 찍은 (그림 2D 및 그림. 4D). 각 조건에 대한 공간 상수 값간격 접합 추적 커플링의 범위는 컷 로딩 기법을 사용하여 계량 수 보여주는, 2E 및 4E 통계에 표시됩니다. 또한, 그 결과는 매우 재현할 수 있습니다. 간격 접합 추적 커플링의 범위를 quantifying의 수단으로 컷 로딩 기법의 사용이 또한 형광 강도는 모든 경우에 컷에서 거리의 함수로 기하 급수적으로 감소 면요에 의해 검증 것은 (또한 무화과를 참조하십시오. 7,8 검사를 neurobiotin 다른 망막 사이트에서 레이저 컷이 아닌 통해 photoreceptors를 입력한 나타내는 여기에 2D 및 4D). 또한, photoreceptor 세포 추적 커플링의 질적 유사한 주 / 야 차이점은 하나의 원뿔로 추적 주사와 금붕어와 컷로드 7 관찰 photoreceptor 커플링의 범위를 측정 비교적 정확한 방법으로 절단 로딩 substantiates. 컷 - 난oading 기술은 또한 망막에 전기 시냅스의 다른 유형을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 5는 토끼 A - 타입 (그림의 5A)와 B 타입 (그림의 5B) 수평 세포 추적이 결합 동종 전시회를 보여줍니다 다음 절단 하중과 어두운 조건에서 적응 neurobiotin의 확산. <table border="1"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> 물고기 </td><td> 마우스 </td><td> 토끼 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 일 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 일 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> - </td><td> 일 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.7 </td><td> 이 </td><td> 이 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 금붕어, 마우스 및 토끼 망막에 대한 울리는의 솔루션 구성. 농도는 MM로 표시됩니다. 벨소리의 솔루션 5 % CO 2 / 95% O 2 부풀어 오른 22 ° C (생선) 또는 36 ° C (포유류)에서 유지됩니다. &quot;-&quot;이 종족에 대한 벨소리에 포함되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> 그림 1 :. 컷 로딩 절차를 보여주는 플로우 차트. 절연 O 후F 손상 신경 망막은 여러 가지 방사형 상처가 처음 0.5 % neurobiotin 솔루션있었습니다 칼날에 의해 만들어졌다. 망막은 추적로드 및 확산을위한 incubated 후 0.1M 인산 버퍼 (PB)에 4 % paraformaldehyde (PFA)로 고정하기 전에 세탁했습니다. 추적기 커플링은 알렉사 - 488 streptavidin - 복합 사용하여 조사되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> 그림 2. 금붕어의 photoreceptor 추적 커플링에 주간 야간 차이는 컷 로딩 기술에 의해 드러났습니다. Photoreceptor 셀 갭 접합 neurobiotin 추적 커플링 제어 조건 (A)에 따라 하루에없는 spiperone (10 μm의), 선택적 도파민 D 2 수용체 길항제 (C) 응용 프로그램의 다음과 박 (B)에서, 하루에 광범위한했지만. 상처 (AC에 화살표로 표시)에서 거리의 함수로 D) 표준화 상대 형광 강도. E) 우주 상수 발D 및 기타 실험 (n은 = 4)에있는 데이터에서 얻은 ues. *** P &lt;0.001. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> 그림 3. neurobiotin와 rhodamine dextran 모두 솔루션 절단 하중에 따라 야간에 어두운 적응 금붕어 망막의 photoreceptor 세포 레이어에 형광을 보여주는 대표적인 예라고 할 수 있습니다. 높은 분자량 (&gt; 10,000 MW), 컷 근처에만 표시 세포에 의한 열 간격 접합 채널을 통해 확산되지 않습니다 Rhodamine dextran (빨간색 표시). 반면, 갭 분기점을 통해 확산 neurobiotin (녹색 표시)와이 멀리 컷에서 photoreceptor 세포에서 볼 수 있습니다. 절단의 위치는 각 패널에있는 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 200 μm의. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> 그림 4. 일 밤 다릅니다토끼 망막의 photoreceptor 커플링 추적에 줬어는 컷 로딩 기술에 의해 드러났습니다. Photoreceptor 셀 갭 접합 neurobiotin 추적 커플링 제어 조건 (A)에 따라 하루에없는 spiperone (10 μm의) (C) 응용 프로그램의 다음과 박 (B)에서, 하루에 광범위한했지만. AC에서 컷 근처 토끼 photoreceptors의 3D 재건의 수직의 전경이 표시됩니다. 인하의 거리의 함수로 D) 표준화 상대 형광 강도. E) 우주 상수 값을 D 및 기타 실험 (N = 3)의 데이터에서 얻은. *** P &lt;0.001. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> 그림 5. 잘라내기 - 로딩은 어두운 - 적응 토끼 수평 세포 추적이 결합된다 보여줍니다. A - 타입 (A)과 B 타입 모두 (B) 어두운 적응 토끼 망막의 수평 세포가 동종 neurobiotin 추적 커플링을 전시.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에서 설명한 컷로드 방법은 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에 망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하기 위해 유용하고 간단 방법입니다. 이 기법의 장점은 밤낮 동안 조명 조건의 다양한하에 그대로 망막 조직에서 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 정할 작은 직경 somata을 결합하여 뉴런을 위해 그렇게 할 수있는 능력을 포함합니다. 이 일반적인 범주로 그대로 조직 가을에 갭 분기점의 연구 기법의 한계. 첫째, 개방 간격 분기점을 통해 추적 확산이의) 작은 직경이나 열린 채널과 B) 결합 세포 구획의 상대적 볼륨 1,14,15와 관련된 비용으로 인해 관찰 상대적으로 어려울 수 있습니다. 그것은 작은 세포에서 세포의 결합 큰 셀 또는 그룹 광고에 추적 확산이다큰 세포에서 작은 세포로 추적 확산에 ared, 추적 희석으로 인해 검색하는 것이 더 어려울 수 있습니다. 둘째, 어떤 생리 조건 하에서, 손상 조직의 갭 분기점을 통해 추적 확산의 범위가 정확하게 비교적 큰 추적기의 투자율에 비해 작은 전류 운반 이온의 전도성의 차이로 인해 간격 junctional 전도성의 강도를 반영하지 않을 수 있습니다 분자 1,14,15. 일반적으로 추적 커플링의 증거가 강하게 작동하는 오픈 간격 접합 채널의 존재를 암시하지만, 몇 가지 생리적 조건 하에서, 추적 확산은 electrophysiological 레코딩가 작동, 오픈 간격 분기점의 존재를 제안해도 발생하지 않거나 관찰 수 있습니다. 이것은 컷 로딩 기술은 또한 중추 신경 치세요의 다른 지역에서 그대로 조직에서 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 조사하는 데 사용할 수있는 가능성이 보인다어디서 비롯되었을지.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Tricaine의 메탄 산염 (MS222) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A5040 </td><td> 150 MG / 버퍼 수조 물의 L </td></tr><tr><td> 우레탄 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> U2500 </td><td> 2g / kgloading 복용량 </td></tr><tr><td> 듀얼 튜브 나이트 비전 가글 </td><td> 야간 광학 미국 </td><td> D - 221 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 종이, 학년 제 4 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> 좋은 집게, 11cm 길이 뒤몽 번호 5, Biologie, </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> 좋은 가위, 용수철, 8mm 블레이드, 직선 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15025-10 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> 벡터 </td><td> SP - 1120 </td><td> 0.5 % </td></tr><tr><td> Streptavidin - 복합 알렉사 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2퍼센트 </td></tr><tr><td> Dextran rhodamine (높은 (&gt; 10,000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0.5 % </td></tr><tr><td> Vectashield 장착 매체 </td><td> 벡터 </td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 검사 자이스 혈구 510 META 레이저 </td><td> 칼 자이스 혈구, 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM - 5 이미지 브라우저 3,2,0,115 </td><td> 칼 자이스 혈구, 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

화학 시냅스 전송뿐만 아니라, 갭 분기점에 의해 연결된 뉴런은 전기 시냅스 전송을 통해 빠른 속도로 통신할 수 있습니다. 증거를 늘리면 간격 분기점뿐만 아니라 전류 흐름과 서로 결합하거나 세포 사이의 동기 활동을 허용함을 나타냅니다지만, 결합 세포 사이의 강도 또는 전기 통신의 효율성 좋은 정도의 1,2에 변조된 수 있습니다. 또한, 많은 간격 연결 채널의 큰 내경 (~ 1.2 nm의)는 간격 분기점은 또한 신진 대사 및 화학 통신을 중재 수 있도록, 세포내 신호 분자와 상호 세포 사이의 작은 metabolites의 보급에도 전류 흐름뿐만 아니라 수 있지만, . 뉴런과 신경 전달 물질 및 기타 요인에 의해 자사의 변조 사이의 간격 junctional 통신의 강도가 동시에 전기 결합 세포에서 기록하여 및 t를 결정하여 연구 수하나의 세포에 주입 iontophoretic 다음 그 간격 접합 투과 아르 추적 분자의 확산 범위 아니지만 막 투과. 그러나 이러한 절차는 그대로 신경 조직의 작은 somata와 뉴런에서 수행하는 매우 어려울 수 있습니다. 다섯 망막 신경 세포 유형의 각각 전기 격차 분기점 3,4로 연결되어 있기 때문에 전기적 시냅스 및 전기 통신의 변조에 대한 많은 연구는 척추 망막에서 실시되었습니다. 증가 증거는 빛의 자극에 망막 및 변경에 circadian (24 시간) 시간은 3-8을 결합 간격 접합을 조절하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 최근 작품은 망막 circadian 시계 D2 수용체 활성을 줄임으로써 증가 도파민 D2 수용체의 활성화에 의해 낮에는로드 및 원뿔 photoreceptor 세포 사이의 간격 접합 커플링을 감소하고, 극적으로 야간로드 - 원뿔형 커플링을 증가시킬 수있다는 것을 보여주었다 <suP&gt; 7,8. 그러나,뿐만 아니라 손상 신경 망막 조직의 작은 somata와 뉴런에서 수행하는 매우 어려운 이러한 연구가 있지만, 그것은 충분히 간격 접합에 빛을 유발 변화를 피하기 위해 단일 ​​망막 뉴런의 electrophysiological 공부하는 동안 조명 조건을 제어하기 어려울 수 컨덕턴스. 여기, 우리는 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에 망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하는 직접적인 방법을 제시한다. 이 컷 - 로딩 기술은 열 간격 접합 채널을 통해 색소로드 및 확산을 기반으로 9-12 다쳤고, 로딩의 수정입니다. 긁어로드는 그대로 망막으로 두꺼운 조각에서 교양 세포에서 잘 작동하지만,하지 않습니다. 컷 - 로딩 기술은 그대로 생선과 포유 동물 망막 7, 8,13에 photoreceptor 커플링을 연구하는 데 사용되었으며, 사이 커플링 공부하는 데 사용할 수 있습니다여기에 설명된 다른 망막 뉴런.

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하는 쉽고 편리한 방법을 설명합니다. 이 기술 하나는 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에있는 그대로 망막에있는 뉴런 사이의 전기 시냅스의 기능을 조사 수 있습니다.

잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토​​를위한 유용한 도구

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K 조회수.  Ohio State University College of Medicine. 망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하는 쉽고 편리한 방법을 설명합니다. 이 기술 하나는 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에있는 그대로 망막에있는 뉴런 사이의 전기 시냅스의 기능을 조사 수 있습니다.

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Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

망막 섹션 Morphometric 분석

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

질병 Pathogenesis를 공부하는 도구로 뉴런에 항체 Transfection

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토​​를위한 유용한 도구

잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토를위한 유용한 도구