Wir danken für die Zusendung EUROSARF Hefe TAP Expressionsplasmide. Wir sind auch dankbar für redaktionelle Hilfe von Ryan Labadens. Diese Arbeit wurde durch ein NIH / NINDS Zuschuss (R01NS070962) auf CW unterstützt

1. Generieren UAS-TAP-markierten Transgene Fliegen <ol><li> Generieren pUAST-TAP-markierten DNA-Konstrukte. <ol><li> Entscheiden Sie, welche Seite (N-oder C-Terminus) der Köder-Protein die TAP-Tag sollte die fusioniert werden sollen, aufgrund der Struktur / Funktion des Proteins. Siehe Diskussion für weitere Details. </li><li> Subklonierung der cDNA-codierenden Region des Gens von Interesse in die multiple Klonierungsstellen (MCS) der pUAST NTAP-oder pUAST CTAP-Vektoren, um N-oder C-terminalen-markierten UAS-TAP-Transgene zu erzeugen sind. Siehe Abbildung 1 für detaillierte Karten und nutzbar Restriktionsstellen und Leserahmen. </li></ol></li><li> Generieren UAS-TAP-markierten transgenen Fliegen. <ol><li> Generieren transgenen Fliegen nach Standardprotokollen mit P-Element-vermittelte Insertion 11. Eine Reihe von Einspritzleistungen sind im Handel erhältlich. </li><li> Überqueren neuronalen GAL4 Treiber (BG380-GAL4) zu jedem einzelnen transgenen Linie und bestimmen die Proteinexpressionsniveausjeder Zeile durch Western-Blot (mit Peroxidase-Anti-Peroxidase-Antikörper) und / oder die Immunfärbung (mit Anti-TAP-Antikörper). In der Regel wird eine transgene Linie mit einer Proteinexpression Wert in der Nähe des endogenen Proteins ist für TAP Verfahren empfohlen. Siehe Diskussion für weitere Details. </li><li> PerformGAL4/UAS-based Rettungsversuche, um die Funktionalität der TAP-markierten Transgene bestätigen, wenn loss-of-function Mutanten der Gene von Interesse sind. Wählen Sie ein Transgen, die die mutierten Phänotypen für die folgenden Experimente wesentlich TAP retten können. </li></ol></li></ol> 2. Bereiten Proben für die TAP-Verfahren <ol><li> Generieren Sie eine Fliege stock, die sowohl eine neuronale GAL4 Treiber (zB BG380-Gal4) und der gewählten TAP-markierten Transgen um Ausbau der Fliege trägt Proben erleichtern. Sammeln Sie die F1 Nachkommen des GAL4-Treiber und dem UAS-Transgen Kreuz in seltenen Fällen, wenn die oben genannte Kombination bewirkt, dass das Überleben und Wachstum Nachteil. &lt;/ Li&gt; <li> Sammeln kleinen Proben und optimieren Lyse Bedingung für die Solubilisierung des TAP-markierten Protein. <ol><li> Stellen eine Reihe von Lysepuffer mit einer Kombination der nichtionischen Detergenzien NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) und Triton X-100 (0,05-0,5%). Siehe Tabelle 1 und Diskussion für weitere Informationen. </li><li> Auf einem CO2-Pad, verwenden Nr. 5 Pinzette aus der TAP-Transgen exprimiert Fliegen sezieren 20 Erwachsenen Köpfe und sammeln sie in einem 1,5-ml-Tube, um jeden Lysepuffer Zustand zu testen. </li><li> Geben Sie 100 ul Lysepuffer Prüfung an das Rohr und homogenisieren die Köpfe durch Streicheln auf und ab mit einer Kunststoff-Stößel, fügen Sie dann weitere 100 ul Testpuffer. </li><li> Drehen Sie den Kopf Lysat bei 21.500 g für 10 min (4 ° C), und trennen Sie den Überstand und Pellet nach Zentrifugation. In 25 ul 2x SDS-Ladepuffer zum Pellet und 10 ul 4x SDS-Ladepuffer zu 30 ul des Überstandes auf. </li><li> Man kocht die beiden Proben für 5 min und zu analysieren nebenSeitige Verwendung von SDS-PAGE und anschließendem Western-Blot mit dem PAP-Antikörper. Bestimmung der Löslichkeit durch das Verhältnis der TAP-Proteinspiegel im Überstand der Pellet-vs. </li></ol></li><li> Bereiten Probe in großem Maßstab <ol><li> Erweitern und sammeln erwachsenen Fliegen. <ol><li> Erweitern Sie den neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene Lager in Flaschen und drehen Sie die Flaschen alle 3 Tage bis kumulative 250 Flaschen werden für die Sammlung verwendet. </li><li> Sammeln 1-3 Tage alten Erwachsenen in 50 ml konische Röhrchen fliegt, legte das Rohr sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren, um die Fliegen. Bewahren Sie die Fliegen in einem -80 ° C Gefrierschrank. Beachten Sie, dass das Volumen der Fliegen muß 2/3 der 50-ml-Röhrchen nicht überschreiten. </li></ol></li><li> Sammeln Fliegenköpfe (führen Sie diesen Schritt auf der Oberseite des pulverförmigen Trockeneis). <ol><li> Nehmen Sie die vorgekühlten Siebe und der Mörser und Stößel aus dem -80 ° C Gefrierschrank und legte sie auf Trockeneis, idealerweise in einem großen Eiskübel. Stapeln beiden USA-Standardtestsiebe mit Nr. 25 auf the oben und Nr. 40 an der Unterseite. </li><li> Nehmen Sie die gefrorenen Fliegen aus und legen Sie sie in flüssigem Stickstoff und halten die Fliegen dort für ca. 10 min. Vortex oder kräftig schütteln, die Rohre, um die Köpfe, Beine und Flügel aus dem Körper zu brechen. </li><li> Gießen Sie die Mischung auf das obere Sieb, und dann schütteln die Siebe kräftig, während die beiden Siebe zusammenhält. Nach dem Sieben werden die Körper auf dem oberen Sieb bleiben, fliegen Köpfe werden auf der Unterseite Sieb zurückgehalten werden, und die Beine, Flügel und andere Verunreinigungen werden dem Trockeneis fallen. Trennen Sie die beiden Siebe und sorgfältig übertragen Sie die Fliege Köpfe der kalten Mörtel. </li></ol></li><li> Homogenisieren Fliegenköpfe <ol><li> Oben auf Trockeneis, mahlen die Köpfe mit dem Mörser und Stößel, um die Pulverpartikel, dann übertragen Sie das Pulver in ein 15-ml-Glas Dounce Tissue Grinder, die auf Eis vorgekühlt wurde. </li><li> Messen Sie die Gewichte der Mühle vor und nach der Kopf-Probe wurde in sie gegossen, und dann berechnen, wie viel der Kopf sample wiegt. Eine Gesamtzahl von 6-15 Gramm Fliegenköpfen für jeden TAP Experiment entsprechend eingestellt, um den Expressionsspiegel des Proteins ausreichen. 15 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer (Lyse-Puffer in Schritt 2.2 optimiert) auf das Pulver und dann Schlag mit dem großen Abstand Stößel, bis es einfach für die Stößel zu gehen auf und ab. Halten Sie das Glas Mühle auf Eis zu allen Zeiten. </li></ol></li><li> Bereiten Sie den Überstand für TAP <ol><li> Übertragen des Homogenats, um eine Hochgeschwindigkeits-Spin-Zentrifugenröhrchen und für 20 Minuten bei ~ 50.000 xg (4 º C). Den Überstand in ein neues Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal. </li><li> Den Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen und führen Sie eine 40 min ~ 250.000 xg Spin um den Überstand weiter zu löschen. Der Überstand ist bereit für die Tandem-Affinitätsreinigung Verfahren nach Ultrazentrifugation. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. TAP Reinigung </p&gt; Die folgenden Abschnitte wurden aus dem Labor Séraphin TAP abgeleitet protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf ) <ol><li> Führen IgG Wulst Affinitätsreinigung <ol><li> Bereiten IgG Sepharose Wulst während die Proben werden zentrifugiert. Waschen 400 ul IgG Wulst 3x in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit 10 ml kaltem Waschpuffer IgG. Für jede Wäsche, rocken das Rohr vorsichtig für 2 min, und dann Spin-Down der Kügelchen bei 1.000 g für weitere 2 min. Am Ende des dritten waschen, entfernen Sie den Puffer und lassen Sie nur die Perlen in die Röhre. </li><li> Die geklärte Überstand (~ 15 ml) vorsichtig in den 15-ml-Tube mit den IgG-Perlen zu übertragen. Die Perlen und Gehirn Lysat Mix Inkubation bei 4 º C auf einem Kolbenpendel für 2 Stunden. </li><li> Richten Sie eine sauber und leer Mikro-Säule mit etwa 15 ml Gesamtvolumen im Kühlraum. Laden Sie die IgG Wulst Mischung durch stetig Gießen Sie die Mischung in der Kolonne; versuchen Sie nicht, abzufangen,Luftblasen in der Säule. Lassen Sie die Perlen in der Spalte und der Puffer absetzen, langsam durch Schwerkraft ablaufen lassen. </li><li> Gründlich die Säule mit 10 ml kaltem Waschpuffer IgG schließlich des Gehirns Lysat durch die Säule ständiger IgG floss. Wiederholen Sie den Wasch 2x. Hinweis: nie den Wulst an der Luft trocknen lassen. </li></ol></li><li> Führen TEV-Spaltung <ol><li> Nach dem dritten Waschen, waschen Sie die Spalte wieder mit 10 ml TEV-Spaltpuffer. Dieser Schritt bereitet die IgG-Perle, die die Köder-Komplex für TEV-Spaltung sequestrates. </li><li> Kurz bevor der letzte Tropfen TEV-Puffer ist im Begriff, heraustropfen, legte eine Kappe am unteren Ende der Säule, um den Fluss zu blockieren, fügen Sie 1,3 ml TEV-Puffer mit 130 Einheiten der TEV-Enzym an der Säule, und dann sicher Kappe die Spitze die Säule. Sicherzustellen, dass die Säule und an beiden Enden verschlossen. </li><li> Drehen Sie die Säule bei 18 º C für 2 Stunden, damit der TEV-Enzym, um das Peptid an der TEV-Website zu spalten und lassen Sie die Proteinkomplex while und hinterließ den Protein A-Domäne des Peptids an IgG Sepharose-Kügelchen gebunden. </li></ol></li><li> Führen Calmodulin Wulst Affinitätsreinigung <ol><li> Bereiten Sie die Calmodulin-Perlen, während die IgG-Perlen werden mit dem TEV Enzym inkubiert. In einem 15 ml Falcon-Röhrchen 3x mit 10 ml kaltem Calmodulin-Bindungspuffer waschen 200 ul Calmodulin-Perlen, jedes Mal. Für jede Wäsche, schaukeln das Rohr für 2 min auf einem Kolbenpendel, und Spin-Down der Kügelchen bei 1.000 g für 2 min. Am Ende des dritten waschen, nehmen Sie alle den Puffer und lassen Sie nur die Perlen in die Röhre. </li><li> Am Ende der TEV-Inkubation (Schritt 3.2.3), kehren die IgG-Säule zurück in den Kühlraum und legen Sie sie gerade nach oben. Lassen Sie die Perlen für 10 Minuten absetzen. </li><li> Entfernen Sie die obere Abdeckung und dann die untere Kappe, und sammeln Sie die 1,3 ml TEV-Spaltprodukt in einem 15 ml Falcon-Röhrchen dann. Lassen Sie den Puffer vollständig ablaufen lassen. Fügen Sie eine zusätzliche 200 ul TEV-Puffer auf die Säule, um das Totvolumen der Säule schieben, sammeln die fNieder in derselben Röhre. </li><li> In 4,5 ml Calmodulin-Bindungspuffer und 4,5 ul 1 M CaCl 2 bis 1,5 ml TEV-Spaltprodukt oben gesammelt. Der CaCl 2 dient dazu, die EDTA in TEV-Puffer titriert. Übertragen Sie die 6 ml Mischung auf das Rohr, das die Calmodulin-Perlen und drehen Sie die Röhrchen bei 4 º C auf einem Kolbenpendel für 1 Stunde. </li><li> Richten Sie einen sauberen und leeren Mikro-Säule mit etwa 10 ml Gesamtvolumen im Kühlraum. Laden Sie das Calmodulin Wulst Mischung auf die Säule und lassen Sie es durch die Schwerkraft entleeren. </li><li> Wenn die gesamte Lösung durch das Siedlungs Spalte Calmodulin floss, waschen Sie die Säule zweimal mit je 10 ml kaltem Calmodulin-Bindungspuffer. Hinweis: vermeiden Sie die Calmodulin-Perlen stören und versuchen, die Oberfläche der Perlen so flach wie möglich während des Wasch halten. </li></ol></li><li> Eluiere das Köder-Komplex aus Calmodulin Spalte. Gleich nach dem Waschen der Säule eluieren Calmodulin mit fünf Fraktionen von 200 ul kalten Calmodulin Elutionspuffer. Für jede Fraktion, vorsichtig mit 200 &amp;mgr; l Elutionspuffer, um die Säule und Sammeln des Eluats mit einem markierten 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen 4x. </li><li> Analyse der Proteinkomplex durch SDS-PAGE <ol><li> Einen kleinen Aliquots von jedem der fünf Fraktionen (etwa 30 ul) hinzugefügt und SDS-Ladepuffer. Kochen Sie die Proben für 5 min und laden Sie die Proben Seite-an-Seite mit Protein molekulare Marker in einem Gradienten (4-15%) SDS-PAGE-Gel. </li><li> Nachdem die Proben vollständig in das Gel aufgelöst, stoppen Sie die Elektrophorese und färben das Gel mit allen G-250-basierte empfindlich kolloidale Coomassie-Färbung Verfahren wie &quot;blue silver&quot;-Färbung 13. Silberfärbung ist optional, aber nicht bevorzugt, da es nicht kompatibel mit der anschließenden Massenspektrometrie-Analyse. Speichern den Rest des Eluats in einem -80 ° C Gefrierschrank für die weitere Analyse, wie der Massenspektrometrie für die Aufdeckung der molekularen Identitäten der gereinigten Proteinkomplex. See Diskussion. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)-Methode bietet eine Dual-Reinigungsprotokoll, das die Isolierung und Anreicherung von Proteinkomplexen durch zwei unabhängige Affinität Reinigungsschritte ermöglicht. Das Design des TAP-Tag nicht zu dem, was in diesem Protokoll Beispiel beschränkt, andere Proteinbindungsdomänen und Motive auch anwendbar, wenn Pufferbedingungen entsprechend angepasst. Ein gutes Beispiel für andere TAP-Tags ist die GS-TAP-Tag, eine Kombination aus einem G-Protein und einem Streptavidin-Bindungsmotiv...

Definieren der molekularen Signalwege und Netzwerke, die einen bestimmten biologischen Prozess zu vermitteln ist eines der obersten Ziele der biomedizinischen Forschung. Fly Genetiker haben massiv auf zukunfts Genetik abhängig, vor allem Modifikator genetischen Bildschirme (beide Enhancer und Suppressor-Screens), um Faktoren, die zusammenarbeiten, parallel, oder stromaufwärts oder stromabwärts eines Gens von Interesse zu identifizieren. , Vorwärts Genetik Bildschirme oft scheitern jedoch zu wesentlichen Gene zu identifizieren, die, wenn mutiert, verursachen Letalität in frühen Entwicklungsstadien, oder Gene mit funktionellen Redundanz und Entschädigung, deren Funktionsverlust nur subtile Defekte, die schwer zu erzielen sind, verursachen. Eine Möglichkeit, diese Schwierigkeit zu überwinden, ist für die direkte Protein-Protein-Interaktionen zu screenen. Seit mehr als einem Jahrzehnt eine wachsende Liste von biochemischen Methoden, einschließlich Hefe-Zwei-Hybrid-, Phagen-Display, chemische Vernetzung, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), usw. wurden verwendet, um Protein zu untersuchen-Protein-Wechselwirkungen. Jeder dieser Ansätze hat ihre eigenen Stärken und Schwächen im Hinblick auf die Empfindlichkeit und Spezifität. Unter ihnen kann der TAP-Verfahren zum Nachweis von physikalischen Wechselwirkung unter nahezu physiologischen Bedingungen bewahrt Spezifität und Konsistenz 2 und schließt die Fähigkeit zum Hochdurchsatz-Analyse 3,4 erstrecken. Die TAP-Methode wurde ursprünglich in der Hefe durch Rigautand Kollegen 1 entwickelt. In diesem Verfahren wird ein Protein von Interesse mit einem TAP-Tag exprimiert. Der TAP-Tag birgt zwei unabhängige Affinität bindende Domänen: eine Protein A-Domäne, die an IgG bindet und eine Calmodulin-Bindungsdomäne. Die beiden Bereiche sind durch eine TEV (Tabak-Etch-Virus)-Spaltstelle getrennt sind. Eine solche Kombination ermöglicht zwei unabhängige Runden der Affinitätsreinigungen ausreichend unspezifische Bindungen zu reduzieren und bereichern spezifischen Bindungen ein. Für diesen Fall ist die TAP-Methode ein sehr leistungsfähiges method in vivo Interaktionen eines bestimmten Proteins zu identifizieren, obwohl Überexpression des exogenen Proteins kann es die sich bei Proteinen, die normalerweise nicht mit den komplexen endogenen Gegen Verbindung zu bringen. Seit seiner Entwicklung hat die TAP-Methode in vielen anderen Systemen, einschließlich Zellkultur-basierten Systemen 5,6 und in vivo Modellsystemen 9.6 angewendet. Hier beschreiben wir die Anpassung der TAP-Methode in Drosophila. Zunächst erzeugen pUAST NTAP-und pUAST CTAP-Vektoren Klonierung und Fusion der TAP-Tag entweder am N-oder C-Terminus des Gens von Interesse zu erleichtern. Die FH-TAP-markierten Transgen wird dann im Nervensystem unter der Kontrolle eines neuronalen GAL4 Treiber 10 ausgedrückt. Als nächstes wird eine große Anzahl von erwachsenen Fliege Köpfe erfasst werden, die hohen Gehalt an Nervenzellen und sind leicht von anderen Körperteilen nach dem Einfrieren auf Größe Differenzen zu trennen. Die erwachsenen Köpfe sind homogenisiert und gelöscht by aufeinanderfolgenden Zentrifugationen und der Überstand wird unter einer unten beschriebenen Prozedur TAP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">U.S.A. standard test sieve No. 25</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-881-18&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">U.S.A. standard test sieve No. 40</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-881-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885300-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG sepharose beads</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td style="width:119px;">17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-column 0.7 cm x 20 cm</td>
			<td style="width:104px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">737-4721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-column 0.5 cm x 15 cm</td>
			<td style="width:104px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">737-4716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calmodulin beads</td>
			<td style="width:104px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">214303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coors Mortar and Pestle</td>
			<td style="width:104px;">CoorsTek</td>
			<td>60311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AcTEV Protease</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:104px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Mix</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying protein-protein interaction in drosophila adult heads by tandem affinity purification (tap)

Genetische Screens durchgeführt unter Verwendung von Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) haben zahlreiche Meilenstein Entdeckungen im Vorfeld der biologischen Wissenschaften gemacht. Jedoch wurde die Verwendung von biochemischen Screening auf die sich die Kenntnis der genetischen Analyse gewonnenen Ziel erst kürzlich entdeckt. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Proteinkomplex zu reinigen, der sich an jedem Protein von Interesse von erwachsenen Fliegenköpfe. Diese Methode nutzt die Drosophila GAL4/UAS System, um eine Köderprotein mit einem Tandem Affinity Purification (TAP)-Tag in fly Neuronen in vivo verschmolzen Ausdruck zu bringen, und dann implementiert zwei Runden der Reinigung mit einem TAP-Verfahren, ähnlich dem ursprünglich fest Hefe ein, um die Interaktion Protein-Komplex zu reinigen. Am Ende dieses Verfahrens wird ein Gemisch aus mehreren Protein-Komplexe erhalten wird, dessen Molekular Identitäten durch Massenspektrometrie bestimmt werden. Validierung der Kandidatenproteine ​​aus der r profitierenesource und einfache Durchführung loss-of-function-Studien in Fliegen. Ähnliche Ansätze können auf andere Flug Gewebe angewendet werden. Wir glauben, dass die Kombination von genetischen Manipulationen und proteomischen Ansatz dieser in der Flugmodellsystem birgt ein enormes Potenzial für die Bekämpfung der grundlegenden Probleme im Bereich der Neurobiologie und darüber hinaus.

Hier zeigen wir unsere Anstrengungen bei der Identifizierung von Highwire-interagierenden Proteinen im Fliegenhirn. Highwire (Hiw) und seine Wirbeltieren und wirbellosen Homologen sind riesig Ubiquitin-Ligasen, die die Entwicklung und Reparatur des Nervensystems 14 zu regeln. Sie teilen sich eine Reihe von hoch konservierten funktionellen Domänen. Allerdings sind ihre molekularen Aktionen nicht ganz klar. Arbeiten im Schnecken getan, Fliegen und Maus führte zu der aktuellen Arbeitsmodell, dass Hiw Funktione...

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Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila ist berühmt für seine leistungsstarken genetischen Manipulation, aber nicht für die Eignung der eingehenden biochemischen Analyse. Hier präsentieren wir eine TAP-basierte Verfahren, um Interaktionspartner eines Proteins von Interesse aus dem Fliegenhirn zu identifizieren. Dieser Vorgang kann möglicherweise zu neue Wege der Forschung führen.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

identifying-protein-protein-interaction-drosophila-adult-heads-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

13.8K Aufrufe.  Louisiana State University Health Sciences Center.  Drosophila ist berühmt für seine leistungsstarken genetischen Manipulation, aber nicht für die Eignung der eingehenden biochemischen Analyse. Hier präsentieren wir eine TAP-basierte Verfahren, um Interaktionspartner eines Proteins von Interesse aus dem Fliegenhirn zu identifizieren. Dieser Vorgang kann möglicherweise zu neue Wege der Forschung führen. 

Serie: Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Forschung

Biologie

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...