Diese Arbeit wurde von NEURON-ERANET entdecken (BMBF 01EW1003) an CK und JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) finanziert, um CKVB wird durch einen Zuschuss der Forschungskommission der Medizinischen Fakultät der Universität Düsseldorf unterstützt.

Ein. Vorbereitung der Aggresomen Spenderzellen: Transfektion von monomerem Red Fluorescent Protein (mRFP) oder Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-markierten menschlichen Full Length (FL) DISC1 <ol><li> Seed 1,5 x 10 6/10 cm Schale humanen Neuroblastom NLF (NLF; Kinderkrankenhaus von Philadelphia, Philadelphia, PA) Zellen in zehn 10 cm Gerichte und über Nacht wachsen. NLF Zellen werden in RPMI-1640-Medium mit 10% FBS kultiviert, Penicillin / Strepomycin, L-Glutamin. Am nächsten Tag sollten die Zellen bei 70-80% Konfluenz sein. </li><li> Transient zu transfizieren jede 10 cm Schüssel mit 15 ug Plasmid-DNA und Metafectene Transfektionsreagenz (Biontex, Martinsried, Deutschland). In kurzen, für eine 10 cm Schale wurden 15 ug Plasmid-DNA und 30 ul Metafectene bis 750 ul Opti-MEM zugegeben, gemischt und bei RT für 20 min. 5 Gerichte wurden mit pcDNA3.1 mRFP / eGFP-markierten menschlichen (FL) DISC1 und 5 Gerichte mit eGFP-Plasmid allein transfiziert. </li></ol> 2. AggresomenReinigung aus transfizierter Donorzellen Die hier beschriebene Protokoll ist eine Kombination eines Verfahrens, um Lewy-Bodies aus Gehirngewebe 13 und einem Protokoll, um große Aggregate und Aggresomen 14 isolieren reinigen. Da bereits bestehender Verfahren auf die Verwendung von Reinigungsmitteln, die Isolierung von Detergens-freien Protein für die Anwendung bei der Zell-Assays basieren Invasivität ist kritisch. <ol><li> 48 h nach der Transfektion, zur Überwachung der Expression des eGFP und mRFP/eGFP-DISC1 und bestätigen die Bildung von Aggresomen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop (Abbildung 1). </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS pH 7,4, kratzen mit 400 ul PBS jeder, fügen 1X Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN) und stören die Zellen unter Verwendung eines Precellys24 Homogenisator (Bertin Technologien, Frankreich). Kurz, 1 ml Zellsuspension auf eine 2 ml Lyse überführen und 10 Keramikkugeln. Lyse der Zellen mit 3 x 60 sec Impulse. Die mechanische Kraft des Prozesses kannErhöhung der Temperatur in der Probe oberhalb 37 ° C, so ist darauf zu achten, um die Probe auf Eis nach dem Lyseverfahren Chill werden. </li><li> Kühlen Sie die Zellen auf Eis und mit 10 mM MgCl 2, 40 U / ml DNase A und inkubieren für 60 min bei 37 ° C </li><li> Planen Lösungen von 80%, 50%, 20% Sucrose (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml). </li><li> Vorbereiten des Saccharosegradienten in einem 15 ml Falcon-Röhrchen, beginnend mit 2 ml 80% Saccharose, gefolgt von 50% und 20%. Gießen Sie die Steigung langsam und vorsichtig sein, nicht bereits gegossen Schichten stören. Schicht das verdaut Lysat auf der Oberseite des Gradienten und Zentrifuge für 15 min bei 1000 xg bei 4 ° C. </li><li> Sorgfältig sammeln Zwischenphase zwischen der 50-80% Saccharose-Schicht mit einer Pipette und gemischt mit 5 Volumina PBS pH 7,4. Zentrifuge für 15 min bei 1000 × g bei 4 ° C. Wiederholen Waschen zwei weitere Male. In dieser Zwischenphase sind Aggresomen fluoreszierenden und visualisiert werden kann in einem Mikroskop unter UV-Licht. </li><li> Überstand verwerfen unddas Pellet in 250-500 ul PBS pH 7,4. Dieses Pellet enthält das gereinigte Aggresomen (Abbildung 2). </li></ol> 3. Die Behandlung des Empfängers SH-SY5Y Zellen mit mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen <ol><li> Samen 5 x 10 4 Empfängers SH-SY5Y menschlichen Neuroblastomzellen konstitutiv GFP-DISC1 (598-854) auf sterilen Deckgläschen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. SH-SY5Y-Zellen werden in Medium mit DMEM/F-12 Penicillin / Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) und 10% FBS kultiviert. </li><li> 24 Stunden später, mit 10 ul in jede Vertiefung und inkubieren für 48-72 Std. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3 x mit PBS pH 7,4 und stillen extrazellulären Fluoreszenz mit 0,04% Trypanblau für 5 min. </li><li> Befestigen Sie die Zellen mit 4% PFA in PBS pH 7,4 für 10 min auf Eis, einmal gründlich mit sterilem H 2 O und montieren Sie die Deckgläser auf Glasplättchen mit ProLong Gold mit DAPI Montage-Medium (Invitrogen, USA). </li><li> Bestätigen Sie die Aufnahme /Invasion von exogen applizierten Aggresomen durch Kolokalisation mit rekrutiert Proteine ​​Empfänger-Zellen in Z-Stapel-Bildern ausgedrückt. </li></ol> Dennoch könnte Aufnahme / Invasion von exogenen Proteins nicht wesentlich parallel mit einer Rekrutierung von Wirtszellprotein detektiert werden. In unserem Beispiel mRFP-markierten DISC1 Aggresomen Rekruten lösliche GFP-markierten DISC1 (598-854)-Protein von der Wirtszelle (siehe Abbildung 3) ausgedrückt. Die Bilder wurden auf einem Zeiss LSM 510 konfokalen-oder Zeiss Axiovision Apotome2 Lupe genommen. 4. Erzeugung von rekombinanten DISC1 (598-785) In einer früheren Veröffentlichung analysierten wir die Fähigkeit verschiedener DISC1 Proteinfragmente Selbständige interagieren bezogen auf das Vorhandensein von Selbstassoziation Domänen. Unter allen Proteinfragmenten getestet menschlichen DISC1 (598-785) zeigten die stärksten Multimerisierung Anschaffungsneigung 4 (Abbildung 4). Daher wurde die menschliche DISC1 (598-785) in pET15b kloniert (NoVagen, Madison, Wisconsin) mit einem N-terminalen 6-Histidin-Tag, ausgedrückt in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA), und unter denaturierenden Bedingungen in 8 mol / l Harnstoff als 4 beschrieben gereinigt. Kurz gesagt, wird das Protokoll unten beschrieben. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli wurden in 2 x 500 ml 2YT gezüchtet, das 5 mM-Arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml Chloramphenicol bis zu einer OD 600: 0,6-0,8 und DISC1 (598-785) die Expression induziert mit 1 mM IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) für 4 h bei 37 ° C exprimiert wird, wurde die Expression durch Ernten der Bakterien durch Zentrifugation beendet. </li><li> Das Bakterienpellet wurde in 50 ml TE-Puffer (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) und 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml Lysozym, 20 mM MgCl 2 und 400 ml resuspendiert U/50 DNase I. Um vollständige Lyse zu gewährleisten, wurde die Reaktion für 30 min bei RT unter vorsichtigem Rühren inkubiert. </li><li> Hinzufügen 10 mM β-Mercaptogruppeoethanol (ME) und 500 mM NaCl und Inkubation für weitere 30 min. </li><li> Spindown bakteriellen Einschlusskörperchen bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Pellet in 50 ml Extraktionspuffer, enthaltend 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff und 10 mM β-ME und entfernen Verunreinigungen durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen das Ni-NTA-Agarose-Matrix mit Extraktionspuffer. Inkubieren der resuspendierten, vorgereinigtes Proteinextrakt mit Ni-NTA-Matrix für 2 h bei RT. </li><li> Waschen das Ni-NTA-Matrix mit Extraktionspuffer, enthaltend 12 mM Imidazol. </li><li> Eluieren des Proteins langsam mit 15 ml Elutionspuffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA und 10 mM β-ME. </li><li> Dialysieren das Protein schrittweise auf PBS pH 7,4 mit 10 mM β-ME. </li></ol> Aus 1 L bakteriellen Startkultur ist es möglich, Isolat bis zu 50 mg rekombinanter DISC1 (598-785) protEin. α-Synuclein Rückfaltung Für Experimente mit α-Synuclein, 500 ug des rekombinanten Proteins (Sigma-Aldrich, USA) wurde in PBS in einer Konzentration von 1 mg / ml gelöst. Um Oligomere zu erhalten, Rückfaltung wurde über Nacht bei 37 ° C, wie in einer früheren Veröffentlichung 10 beschrieben. 5. Kennzeichnung von rekombinanten DISC1 (598-785) mit DyLight594 <ol><li> Vor der anschließenden Labelling-Verfahren, DISC1 (598-785)-Protein ist das von β-ME befreit werden. Daher wird das Protein 3 mal in PBS pH 7,4 dialysiert bei einer Verdünnung von 1:2.000. </li><li> Label 1 mg DISC1 (598-785) mit DyLight 594 Maleimid (Thermo Scientific, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, löst 1 mg / ml Protein in PBS pH 7.4 und 5 mM TCEP hinzuzufügen, um freie Thiolgruppen zu erholen. Fügen Sie 20 ul der DMF gelösten Farbstoff der Reaktion und inkubieren für 2 h bei RT. </li><li> Dialysieren das Protein 3 x PBS pH7,4 in einem Verhältnis von 1:2000 für 2 Stunden jeweils. </li></ol> Zur weiteren Steigerung der Reinheit des markierten Proteins einen His 6-Tag basierte Affinitätsreinigung auf eine Ni-NTA-Säule durchgeführt wird. <ol start="4"><li> Waschen 1 ml Ni-NTA-Matrix (Qiagen, Deutschland) mit 10 ml PBS pH 7,4. </li><li> Anwenden des markierten, dialysierte Protein an der Säule und ließ es über die Säule langsam laufen. </li><li> Waschen des Proteins mit 3 x 20 ml PBS pH 7,4 </li><li> Eluieren des Proteins mit PBS pH 7,4, 500 mM Imidazol tropfenweise während der Überwachung des farbigen Band auf der Ni-NTA-Säule, das Eluat Volumen zu reduzieren. </li><li> Dialysieren des Eluats 3 x bis 10 mM NaPi pH 7,4 bei einer Verdünnung von 1:2000 für 2 Stunden jeweils. </li><li> Verwenden Sie eine sterile 0,45 um Spritzenfilter das Eluat, Aliquot in 5 x 100 ul Proben und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff zu filtern. 1 pg / ml in je 100 ul Aliquot - Die Gesamtmenge des Proteins sollte 0,5 sein. </li></ol> optional konzentration Schritt <ol start="10"><li> Für stereotaktische rat Injektionen, wurde das Protein 10-fach in einer Speed-Vac (Eppendorf Concentrator 5301) konzentriert. Der letzte Puffer Bedingung war 100 mM NaPi. </li></ol> α-Synuclein Labeling Die Markierung und Reinigung (Ni-NTA-Säule) des rekombinanten α-Synuclein wurde parallel zur DISC1 (598-785) durchgeführt. Die gesamte Ausgangsmaterial war 500 ug statt 1 mg DISC1 (598-785). 6. Die Behandlung des Empfängers SH-SY5Y Zellen mit markierten rekombinanten DISC1 (598-785) Protein <ol><li> Saatgut 5x10 4 Empfängers SH-SY5Y menschlichen Neuroblastomzellen konstitutiv GFP-DISC1 (598-854) auf sterilen Deckgläschen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Hinzufügen markiertes Protein zu dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von 5-10 ug / ml und 48 bis 72 Stunden inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3 x mit PBS pH 7,4 und stillen Extraktionellular Fluoreszenz mit 0,04% Trypanblau für 5 min. </li><li> Befestigen Sie die Zellen mit 4% PFA in PBS pH 7,4 für 10 min auf Eis, einmal gründlich mit sterilem H 2 O und montieren Sie die Deckgläser auf Glasplättchen mit ProLong Gold mit DAPI Montage-Medium (Invitrogen, USA). </li><li> Bestätigen Sie die Aufnahme / Invasion von exogen applizierten rekombinanten Proteins durch Kolokalisation mit rekrutiert Proteine ​​Empfänger-Zellen in Z-Stapel-Aufnahmen von Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie generiert ausgedrückt. Noch, Rekrutierung von endogenem Protein nicht könnten wesentlichen parallel Invasion Wirtszellprotein detektiert werden können Z-Stapel noch bestätigen die invasive Natur des Proteins. </li></ol> In unserem Beispiel rec. DISC1 (598-785) * zumindest teilweise löslich Rekruten DISC1 (598-854)-Protein durch die Wirtszelle (siehe 5A) ausgedrückt GFP-markierten. Für die rekombinante α-Synuclein Invasion, aber keine Einstellungen angezeigt wird (Abbildung 5B). Bilder aufgenommen wurdenauf einem Zeiss LSM 510 konfokalen-oder ein Zeiss Axiovision Apotome2 Mikroskop. Die Injektion der konzentrierten (ca. 4 ul von 2,5 ug / ul), beschriftet DISC1 (598-785) * in die mPFC Ergebnisse bei der Verbreitung des Proteins an der Einstichstelle, die auch nach Perfusion des Tieres mit erfasst werden kann 4% PFA in PBS pH 7,4 mit einem Rhodamin Filtersatz. In unserem Beispiel DISC1 (598-785) eingerichtet ist, durch eine bestimmte Anzahl von Neuronen entnommen und kann mit Z-Stapel bildgebenden (Abbildung 6) überwacht werden. Im Allgemeinen haben die Injektion von anderen Proteinen dann diejenigen welche hier nicht unbedingt auf Zell-Invasion führen. Die Invasion Ereignis ist im wesentlichen abhängig von der Art des Proteins, ist trotzdem eine saubere Reinigung eine Voraussetzung für eine weitere Analyse. 7. Repräsentative Ergebnisse Aggresomen bestehend aus rekombinantem FL DISC1-eGFP gereinigte vom NLF Zellen eingedrungen Empfänger SH-SY5Y cells bei niedrigen Wirkungsgrad (ca. 0,3% 5) durch Kolokalisation mit der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 3). Wie bereits berichtet, äußerte DISC1 (598-785) und gereinigt aus E. coli gebildet Multimere 4 waren gleich Zell-invasiven bei einem Wirkungsgrad von ca. 20% 5 (5A) ähnlich dem von α-Synuclein, die parallel als positive Kontrolle (5B) verwendet wurde. Markierten rekombinanten DISC1 (598-785) exprimiert und aus E. coli war auch Zell-invasive Neuronen in vivo, wenn das multimere Protein wurde stereotaktisch in den medialen präfrontalen Kortex einer Ratte (Abbildung 6; Pum, Bader, Huston, Korth, unveröffentlicht) injiziert. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. NLF Neuroblastomzellen transient exprimierenden FP-DISC1 (rot). Rot fluoreszierende Aggresomen kann VerschlechterungCTED innerhalb der Zellen. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Gereinigtes DISC1 Aggresomen nach der Reinigung in einem Sucrosegradienten mRFP-tagged. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Fluorescent Bild überfallen Aggresomen. mRFP-markierten flDISC1 Aggresomen wurden gereinigt und mit SH-SY5Y Neuroblastomzellen inkubiert überexprimierenden lösliche GFP-markierten DISC1 (598-854). Eine Aufnahme von markiertem Aggresomen wird durch Z-Stapel Bildgebung an einem Laser-Scan-Mikroskops (Zeiss LSM 510) überwacht. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. SEC-Profil rec. DISC1 (598-785), das den C704 S704 und die single nucleotide polymorphisms (SNPs). Beide Varianten weisen eine Unterbrechung von geordneten Oligomerisierung und die Bildung von hochmolekularen multIMers (roter Pfeil). Dieses Bild ist von der Veröffentlichung Leliveld et al., Biochemistry 2009 geändert. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Fluorescent Z-Stapel Bild invasive DyLight-markierten rekombinanten DISC1 (598-785). SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellen, löslichen GFP-DISC1 (598-854) wurden inkubiert mit markierten, rekombinanten Proteins in einer Konzentration von 5 pg / ml. (A) Red Aggregate zeigt die Invasion der rec. DISC1 (598-785)-Protein und gelben Punkte zeigen eine Rekrutierung von löslichem GFP-DISC1 (598-854) in Aggregaten. (B) Rekombinante α-Synuclein (rot) dringt die Zellen ohne Rekrutierung mit einer Frequenz von etwa 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Immunfluoreszenz Bilddas injizierte markierten rekombinanten DISC1 (598-785)-Protein. Z-Stapel Bildgebung bestätigt das Vorhandensein von rec. DISC1 (598-785)-Protein von Ratten kortikalen Neuronen mit einem Antikörper gegen neuronale Kerne (NeuN, grün) angefärbt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In dieser Studie beschreiben wir die Reinigung von mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen aus einer transfizierten Neuroblastom-Zelllinie, die Vorbereitung und Kennzeichnung eines rekombinanten DISC1 Proteinspezies und deren Anwendung in der Zell-Invasion Versuche des Empfängers Zellen in vitro und in vivo. Die Reinigung des nativen mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen wurde aus Protokollen entwickelt, Lewy-Körper-ähnliche Strukturen und größere Aggregate 13, 14 isolieren, aber modifiziert, um die Verwendung von Detergenzien zu vermeiden und die Gefahr von falsch-positiven Zell-Invasion, die auftreten könnten minimieren durch Detergens-erleichterte Membranpenetration. Eine mögliche zukünftige Verbesserung könnte der in eine weitere Erhöhung der Reinheit der Aggresomen durch Beschallung vollständig getrennten restlichen Membranen und Zytoskelett von den Aggresomen sein. Durch Erhöhung Gesamtreinheit, die Anzahl der gesamten Invasion Ereignisse, die für große Aggresomen ma aufgezeichneteny 5 erhöht werden. Ob die eingeschränkte Definition der von uns vorgeschlagenen 3-Phasen-Saccharose ausreichend für Aggresomen andere Protein-Spezies ist muss geprüft werden, in diesem Sinne das Protokoll hier skizzierten sollte als Ausgangspunkt für individuelle Optimierung berücksichtigt werden. Die gereinigten Aggresomen erwies sich als sehr robust in unseren Händen, zusätzliche Waschschritte (ohne Reinigungsmittel), um Spuren von Saccharose nicht signifikant reduzieren die Gesamtausbeute zu beseitigen. In einer früheren Veröffentlichung wir beschrieben, dass Oligomeraufbau des DISC1 abhängig deutliche Multimerisierungsdomänen in der C-Terminus 4 (Abbildung 4). Wir entschieden uns für dieses Fragment für die rekombinante lösliche Expression in E. coli und anschließender und Ni-NTA-Reinigung. Seine Multimerisierung überwachen und ihre Invasivität Zelle mit einer Zelle beschrieben invasive Protein wie α-Synuclein vergleichen, etikettiert wir DISC1 (598-785) mit dem Fluoreszenzfarbstoff DyLight594 und verglichen ihreZell-Invasivität mit der gleichen Bezeichnung α-Synuclein. Das Zell-Invasivität des rekombinanten DISC1 Fragment wurde dramatisch im Vergleich zu der von nativem, in voller Länge DISC1 Aggresomen, wahrscheinlich aufgrund seiner geringeren Größe und viel höhere Reinheit erhöht. Wieder scheint Reinheit eine entscheidende Rolle bei der Zell-Invasivität zu spielen. In unserem Beispiel die invasiven Aggresomen rekrutiert lösliche Protein-Homolog des Ziel-Zelllinie, die rekombinant in einer löslichen, dh Zell-dispergierter Form exprimiert wurde. Die Expression eines fluoreszierenden Proteins (zB GFP oder RFP) in den Empfänger-Zelllinie ist ein Vorteil, da sie die Co-Lokalisation von invasiven Aggresomen und rekombinanten Proteine ​​innerhalb der Empfängerzelle Grenzwert über-Z-Stapel Bildgebung ermöglicht. Cell-invasive DISC1 Aggresomen und multimeren Fragmenten exprimiert und aus E. coli konnte ein bestimmendes Merkmal eines Proteins Konformationsänderungen Erkrankungen im Zusammenhang mit DISC1, DI werdenSC1opathies 15. Fehlersuche: Low Aggresomen Ausbeute nach Saccharosegradienten Reinigung: Die Saccharose-Gradienten in diesem Protokoll eingeführt funktioniert gut mit eGFP/mRFP-DISC1 (FL) Aggresomen. Aggresomen aus anderen Proteinen könnte der variable Dimensionen daher die Saccharose-Konzentrationen sollten durch andere Benutzer optimiert werden. Ungenügende Reinigung von rekombinanten Proteins: Irgendwelche bakteriellen Kontaminanten in dem Reinigungsverfahren des rekombinanten Proteins wird auch in späteren Schritten des Protokolls zu kennzeichnen. Um Verschmutzungen zu vermeiden, laufen die das Protein auf einem SDS-PAGE und bestätigen, dass das rekombinante Protein mindestens 95% rein ist durch Färbung mit Coomassie-Blau. Um höchste Qualität und Ausbeute zu gewährleisten, muss das Protokoll für jedes einzelne Protein optimiert werden. Low Kennzeichnung efzienz von rekombinanten Proteinen: Etwaige Verunreinigungen, die freien SH-Gruppen enthalten verringert effiziente Markierung des Proteins. Daher ist extensive Dialyse und Ni-NTA-basiertes Reinigungsverfahren erforderlich.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagent Namen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Medium hängt von der Wirtszelllinie. Die optimale Empfänger Zelllinie sollte vom Anwender bestimmt werden. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Medium hängt von der Empfänger-Zelllinie. Die optimale Empfänger Zelllinie sollte vom Anwender bestimmt werden. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Andere Transfektionsreagenzien könnte genauso gut funktionieren, aber nicht mit unserem Protokoll getestet. </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Die Experimente mit Ni_NTA Agarose von Qiagen durchgeführt wurden, sollten andere Lieferanten als gut zu funktionieren. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Es besteht keine Notwendigkeit für RNase freier DNase im Prozess der Aggresomen Aufreinigung. </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serum-freiem Medium funktioniert auch </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Zuschlag für SH-SY5Y und NLF Medium </td></tr><tr><td> Nicht wesentlichen-Amino-Säuren (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Zuschlag für SH-SY5Y Medium </td></tr><tr><td> Trypanblau 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Toxic Reagenz </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46608 </td><td> Cystein reduziert Reaktivfarbstoffs zu stabilen Thioetherbindungen bilden. Auch in anderen Farben erhältlich. </td></tr><tr><td> ProLong Gold mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Diese antifade flüssigen Deckfluessigkeit gab hervorragende Ergebnisse in unseren Händen. </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Lösen Sie 1 Tisch in 500 ul H 2 O für 100X Lösung. </td></tr><tr><td> Synthetische a-Synuclein </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Falten wie im Text beschrieben. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle spezifischen Reagenzien. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Wir haben keine anderen mechanischen Homogenität geprüftnizers andere als diese. Andere Mittel frei Homogenisierung Methode könnte auch funktionieren, aber nicht für dieses Protokoll getestet. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrator (Speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Nur notwendig, wenn Protein zu konzentrieren. </td></tr><tr><td> LSM 510 und Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Siehe Hersteller Katalog </td><td> Beide Mikroskope beherbergen die Fähigkeit, Z-Stapel Bildgebung durchzuführen. Dies ist eine Voraussetzung für solide und ernsthafte Evaluierung der Invasion Veranstaltungen. </td></tr><tr><td> Zellkultur Kunststoff </td><td> Nunc </td><td> 10 cm Schalen # 172.958, 24-well Platten # 142.475 </td><td> Die Verwendung von unterschiedlichen Kunststoffmaterial beeinflussen könnten die Wechselwirkung von rekombinanten Proteinen oder Aggresomen und die Kunststoffoberflächen. Wir haben keine anderen Materialien als den hier beschriebenen getestet. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle der spezifischen Material und Ausrüstung. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl </td><td> Buffer Namen </td><td> Inhalt </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Ein. </td><td> Bakterielle Wachstumsmedium </td><td> 16 g / l Bacto Trypton, 10 g / l Bacto Hefeextrakt, 5 g / l NaCl, 5 mM-Arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml Chloramphenicol </td><td> Bakterien wachsen auf OD 600: 0.6-0.8 induzieren die Expression mit 1 mM IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bakterielle Resuspensionspuffer </td><td> 50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml Lysozym, 20 mM MgCl 2 und 400 ml DNase I U/50 </td><td> Resupend Bakterienpellet von 1 L overnight Kultur in 50 ml Resuspensionspuffer. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein Extraktionspuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff und 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA-Säule Waschpuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff und 10 mM b-ME, 12 mM Imidazol </td><td> Geändert Extraktionspuffer mit 12 mM Imidazol zugegeben. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA-Säule Elutionspuffer </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA und 10 mM b-ME </td><td> Der Elutionspuffer enthält 10 mM b-ME, die später wird dialysiert. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,44 g / l Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2 PO 4, pH 7,4 einzustellen </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Labeling-Puffer </td><td> PBS, das 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabelle von Rezepten. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Proteinaggregation wird als allgemeines Kennzeichen von chronischen, degenerativen Gehirn Verhältnissen, beispielsweise bei den neurodegenerativen Erkrankungen Morbus Alzheimer (Aß, tau) gesehen, Parkinson-Krankheit (α-Synuclein), Huntington-Krankheit (Polyglutamin, Huntingtin), und andere. Proteinaggregation angenommen wird, entstehen durch gestörte proteostasis, dh das Ungleichgewicht zwischen dem Entstehen und Abbau von falsch gefalteten Proteinen. Zu beachten ist, sind die gleichen Proteine ​​gefunden aggregiert sporadische Formen dieser Krankheiten, die Mutante in seltenen Varianten von familiären Formen sind. Schizophrenie ist eine chronische, fortschreitende Gehirn Bedingung, dass in vielen Fällen geht einher mit einer dauerhaften und irreversiblen kognitives Defizit. In einem Kandidatengen Ansatz untersuchten wir, ob Störungstag-in-Schizophrenie 1 (DISC1), ein Gen in einer schottischen Familie mit Anbindung an chronischen psychischen Erkrankung 1, 2 geklont, als unlösliche Aggregate im brai gefunden werden konnten der sporadischen Fälle von Schizophrenie 3. Mit dem SMRI CC, identifizierten wir in etwa 20% der Fälle mit CMD aber nicht normalen Kontrollen oder Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen Sarkosyl unlösliche DISC1 Immunreaktivität nach biochemischer Fraktionierung. Nachfolgende Studien in vitro zeigten, dass die Aggregation Neigung DISC1 durch krankheits-assoziierte Polymorphismus S704C 4 beeinflusst wurde, und dass DISC1 Aggresomen in vitro generiert wurden Zell-invasive 5, ähnlich dem, was war für Aß 6 gezeigt, tau 7-9, α -Synuclein 10, Polyglutamin 11 oder SOD1 Aggregate 12. Diese Ergebnisse schlagen vor veranlasste uns, dass mindestens eine Untermenge von Fällen mit CMD solche mit aggregierten Proteins DISC1 könnte konformationelle Erkrankungen. Hier beschreiben wir, wie wir DISC1 Aggresomen in Säugetierzellen zu erzeugen, reinigen sie auf einem Saccharose-Gradienten und nutzen sie für Zell-Invasivität studies. Ebenso beschreiben wir, wie wir eine ausschließlich multimeren C-terminalen DISC1 Fragment, Label generiert und reinigen es für die Zelle Invasivität Studien. Mit den rekombinanten Multimere DISC1 erreichen wir ähnliche Zell Invasivität wie bei einer ähnlich bezeichneten synthetischen α-Synuclein-Fragment. Wir zeigen, daß dieses Fragment sich in vivo aufgenommen wenn stereotaktisch in das Gehirn des Empfängers Tiere injiziert.

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Die Erzeugung, Reinigung und Zellinvasion von intrazellulären, zytoplasmatischen voller Länge DISC1 Protein Aggresomen aus Zellkulturen und einer markierten, multimere rekombinante DISC1 Proteinfragment in<em&gt; E. coli</em&gt; Beschrieben. Zelle Invasivität für Empfängerzellen in Zellkultur und für Neuronen gezeigt<em&gt; In vivo</em&gt; Nach stereotaktischen Hirn-Impfung.

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Aufrufe.  Medical School Düsseldorf, Germany. Die Erzeugung, Reinigung und Zellinvasion von intrazellulären, zytoplasmatischen voller Länge DISC1 Protein Aggresomen aus Zellkulturen und einer markierten, multimere rekombinante DISC1 Proteinfragment in E. coli Beschrieben. Zelle Invasivität für Empfängerzellen in Zellkultur und für Neuronen gezeigt In vivo Nach stereotaktischen Hirn-Impfung.

Serie: Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...