Wir möchten BK August von der University of Wisconsin-Madison Electron Microscope Facility für die Elektronenmikroskopie danken. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01-DA026067 und P30-HD03352 (bis JSM) unterstützt.

1. Die Vorbereitungen 1-4 <ol><li> Bereiten Sie 500 mL Gradienten-Medium (GM)-Puffer durch Mischen von 50 mL einer 2,5 M Saccharose Gülle, 2,5 mL einer 1M Tris-HCl, pH 7,5 Lager, und 0,1 ml einer 0,5 m EDTA, pH 8,0 Lager mit Milli- Q-Wasser, um die Lautstärke. Filter sterilisieren die Lösung, Aliquot und speichern eingefroren. </li><li> Bereiten Sie eine 1000x Lager von Tetrodotoxin (TTX), indem Sie eine 1 mM Lösung in Milli-Q-H 2 O. Aliquots der TTX kann bei -20 ° C gelagert werden </li><li> Bereiten 10x Stimulation Buffer, indem eine Lösung von 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, und 800 mM NaCl in Milli-Q-Wasser. Lager kann bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Pre-cool-Zentrifugen auf 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von isosmotischen Percoll (SIP) durch Zugabe von 9 Volumina Percoll (18 ml) zu 1 Volumen von 2,5 M Saccharose (2 mL) in Milli-Q-Wasser und gut mischen. </li><li> Bereiten Sie die 3, 10, 15, und 23% Steigung Schichten, indem die jeweiligen Mengen von SIP auf GM-Puffer und Mischen jeder: </li></ol><img alt="Tabelle 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" /><ol start="7"><li> Gießen Gradientenschichten durch Pipettieren 2 ml jeder der 23, 15, 10, und 3% isosmotischen Percoll-Lösungen in den Beckman Zentrifugenröhrchen mit Kappen mit einem P1000 Gilson Pipetman. Die Schnittstelle zwischen den Schichten sollten klar erkennbar ohne Vermischung der Schichten. Bewahren Sie die Gradienten bei 4 ° C für mindestens 20 min vor dem Gebrauch. Die Gradienten können bis zu 24 Stunden gelagert werden, obwohl am gleichen Tag verwenden wird empfohlen. [Unerfahrene Laborpersonal kann bereitet Gradienten, indem blauen Farbstoff der isomotic Percoll-Lösungen für die Visualisierung der Schicht Schnittstellen der Praxis.] </li></ol> 2. Maus Dissektion 1 <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle Maus Tierhaltung und Euthanasie Verfahren im Einklang mit NIH und der Universität Richtlinien durchgeführt werden. Euthanize Welpen (Alter P13 bis P21) durch Kohlendioxid Ersticken oder durch ein Verfahren genehmigt der in der Tier-Protokoll. </li><li> Pin mit der Maus ein Dissektion Bord und besprühen Sie die Rückseite des Halses und des Kopfes mit Ethanol. Mit einer scharfen Schere durch das Rückenmark an der Basis des Schädels schneiden, entfernen Sie die Haut von der Oberseite des Schädels, schneiden Sie den Schädel seitlich zwischen dem Scheitelbein und der interparietalen Knochen oder zwischen dem Großhirn und dem Cortex Regionen. Dann schneiden Sie den Schädel von der Basis an der Nase (entlang der sagittalen Naht), entfernen Sie vorsichtig den weichen Scheitelbein, indem jeder Hemisphäre auf die Seite und entfernen Sie die Rinde mit einem Spatel. Legen Sie den Spatel in das Gehirn über das Kleinhirn und dann schaufelt aus dem Cortex und legen Sie sie in eiskaltem GM-Puffer. Gehen Sie sofort auf die Homogenisierung Schritt. Lassen Sie sich nicht den Kortex sitzen in eiskaltem Puffer für sehr lange, da dies sich negativ auf die Bildung von SNS. </li></ol> 3. Vorbereitung von Homogenat und SNS 1-4 <ol><li> Spülen Sie den Kortex in eiskaltem GM-Puffer und übertragen zwei Kortex, ein Glas Dounce Homogenisator mit 5 ml kaltem GM-Puffer. </li><li> Vorsichtig homogenisiert den Kortex mit 5-10 Schläge des losen Pistill (Stößel &quot;A&quot;), um 5-10 Schläge der engen Pistill (Stößel &quot;B&quot;) folgten. Strokes sollte schnell, aber langsam genug, um nicht Luftblasen verursachen. Ein Bild von dem Homogenat nach der Homogenisierung ist in Schema 1. Die Anzahl der Schläge variiert abhängig von der individuellen Homogenisator und begleitende Stößel. Wenn Sie fertig sind die Gradienten sollte eine starke SN Band geben, wenn nicht, stellen Sie die Anzahl der Schläge. </li><li> Übertragen Sie die Homogenat in ein 15 ml konische und Zentrifuge bei 1000xg für 10 min bei 4 ° C in einem Ausschwingrotor (Allegra 6KR Zentrifuge) zum Pellet Zelltrümmer und Zellkerne. Ein Bild des gesponnenen Homogenat wird in Schema 1. </li><li> Layer 2 mL des Überstandes pro Percoll-Saccharose-Gradienten, Kappe der Rohre und Zentrifuge bei 32.500 xg für 5 min bei 4 ° C in einem Festwinkelrotor (Beckman J2-21 Zentrifuge, JA-17 Rotor) mit entsprechenden Adaptern ( Siehe Reagenzien und Tabelle). </li><li> Pipette ab und entsorgen Sie die Lösung über dem SN-Band mit einem Glas Pasteur Pipette. Pipette aus der SN-Band auf der 15/23%-Schnittstelle, um einen konischen und speichere sie auf Eis zu übertragen. Jede Steigung oder eine Rinde produziert 0,9-1,1 mL SN. </li><li> Passen Sie die Salzkonzentration des SNS durch Zugabe von einem Zehntel Volumen von 10x Stimulation Puffer, fügen 1000x CaCl 2 zu einer Endkonzentration von 12 nM, und fügen Sie 1 mM TTX Lager, um eine endgültige Konzentration von 1 nM, um unspezifische Erregung zu unterdrücken. (Zusatz von CaCl 2 ist optional, wenn sie mit nachgeschalteten SN-Anwendungen stören). </li><li> Bestimmen der Proteinkonzentration der SNS mit dem Micro BCA Protein Assay Kit. (The Bradford-Protein-Assay ist nicht, weil der Schluß von der Percoll empfohlen.) </li><li> SNs können direkt und schnell für Protein-Übersetzungen verwendet werdenTION Studien. Für andere Anwendungen SN Lysat kann bereinigt werden oder konzentriert mit dem Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Wenn Maus Cortex homogenisiert wurde und diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten (Schema 1), 6 Bands oder Fraktionen getrennt gesehen wurden (Abbildung 1). Es war zuvor für Ratten gezeigt Großhirnrinde 3,5, dass die Bestandteile der hochmolekularen Bands Membran und Myelin gebrochen wurden und dass die pelletierte Material enthaltenen Mitochondrien oder Organellen (Tabelle 1). Die 23% / 15%-Schnittstelle (Band 5) enthalten die angereicherten SNS. Die Bande bei 23% / 15%-Schnittstelle, mit intakten SNs, wurde entfernt und durch Elektronenmikroskopie (EM) wie zuvor beschrieben untersucht. 2,6 EM das Vorhandensein von intakten synaptischen Vesikeln und die Erhaltung der präsynaptischen und postsynaptischen Elementen (Abbildung gezeigt 2). Isolierung von prä-und postsynaptischen Kompartimente für die Prüfung Signal-und Proteinsynthese, die in beiden Kammern tritt wichtig. 7-13 Die Percoll-Saccharose-Gradienten ist eine grobe Reinigung, so dass wir kleinere Zellen, Kern-und Organell Kontamination sah in der SN-Fraktion, aber die Gesamt-Trennung war gut. Wenn mittels Western Blot untersucht, enthielt die Percoll Fraktionen die erwarteten Protein-Marker mit einer Erhöhung der synaptischen Reinheit in der SN-Band (Abbildung 3, Tabelle 2). Synaptic und neuronalen Marker wurden in den angereicherten SN-Band (Band 5) beibehalten, aber die Fülle von anderen Markern deutlich reduziert werden. Insbesondere wurden die Anwesenheit von GFAP, ein Marker für Astrozyten und neoplastischen Zellen glialen Ursprungs, und Lamin-B1, eine nukleare Marker, vernachlässigbar, während strukturelle und synaptischen Marker wurden beibehalten oder ausgebaut. Darüber hinaus gab es Aufbewahrung von Markern für Organellen, wie Mitochondrien und Golgi, die eine Rolle spielen bei der Proteinsynthese. Typische Ausbeuten für die SN-Band wurden 250-500 ng Protein pro Mikroliter, wie BCA Protein Assay bestimmt. Die Aktivität des SNS wurde von der Menge des de novo Protein-Synthese ermittelt derzeit, wie überwacht werden [35S]-Met Aufnahme (Abbildung 4). 2 Basal translationale Aktivitäten betrug 1,56 fache erhöht, wenn SNs mit 50 uM glutamate/10 uM Glycin stimuliert wurden (Glu) oder 5.12 fache an, wenn mit der Pin1-Hemmer Juglon aktiviert. Pin1-Inhibition ist bekannt, dass eine erhöhte Proteinsynthese. 2 Resultat zu bestätigen, dass die Zunahme von [35S]-Met Einarbeitung durch de novo Proteinsynthese war, haben wir 40 uM Anisomycin, ein Protein-Synthese-Hemmer, und sah eine deutliche Abnahme der Inkorporation in Anwesenheit und Abwesenheit von Glu, wenn die Basis-Ebenen verglichen. Auch bei der Zugabe von 2% Triton-X 100, die die Integrität des SNS stört, wurde basal Übersetzung um 75% gesunken. 2 Darüber hinaus bei der Prüfung der Bänder (B4-B6), dass die meisten synaptischen Marker Bereicherung zeigten, die SNS oder Band 5 war die größte Aktivität für de novo Protein-Synthese (Abbildung 5). So der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten schnell einen hoch aktiven und bereichert SN Band, die verwendet werden, um Protein-Übersetzung Studie werden können. Die diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Gradienten Verfahren ist vorteilhafter als andere Methoden, weil mechanische Schäden, die durch härteren Bedingungen verursacht wird. Wenn die Filtration Methode, bei der kortikalen Homogenat gelöscht verglichen wird durch eine Reihe von Filtern, die Abnahme der Größe, Form 3,14-15 die Percoll-Methode mehr SNs mit größerer Aktivität vergangen. Wie in Abbildung 6, wenn ein Aliquot SNs durch die Filtration Methode hergestellt über einen Percoll-Saccharose-Gradienten gibt es weit weniger SNs am 15/23%-Schnittstelle und eine größere Menge von gebrochenen Membranen verabschiedet wurde gesehen. Wenn de novo Proteinsynthese über S35-met Aufnahme gemessen wurde, waren die SNS durch die Filtration Methode hergestellt weit weniger aktiv ist (Abbildung 7). Zur Maximierung der translationalen Aktivität verwenden wir Mäuse, die im Alter zwischen P14 und P18 sind. SN können aus adulten Mäusen hergestellt werden, aber wir beobachten signifikant erhöht translationalen Aktivität mit SN von jungen Mäusen (Abbildung 8) vorbereitet. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" /> Tabelle 1. Bestandteile der Bands aus der diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Fraktionierungen von homogenisiert Maus Kortex. 3,5 <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" /> Tabelle 2. Zusammenfassung der westlichen Bolzen Analyse der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Band Bestandteile. Relative Proteinkonzentrationen für jeden der Band Fraktionen isoliert mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurden mittels Western Blot bestimmt. No-Proteins vorhanden (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), oder&gt; 0,8 (+++) fach größer als Protein im Überstand (S, zentrifugiert Kortex Homogenat), Vertreter der n = 3. <img alt="Schema 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" /> Schema 1: Schematische Darstellung einer SN Vorbereitung mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Maus Gehirn Kortex wurden seziert, homogenisiert und zentrifugiert bei geringer Geschwindigkeit auf nicht-homogenisierte Gewebe, Zellen, ganze Organellen wie Kerne und Membranen zu entfernen.. Die diskontinuierliche Gradienten sollten klar definierte Schichten. Das Bild Einschub zeigt ein Beispiel für die Schichten, die gefärbt sind blau lediglich zu illustrativen Zwecken, um die Schichten zu visualisieren. Der Überstand wird auf der Spitze eines diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten geschichtet und zentrifugiert bei mittlerer Geschwindigkeit. Die SN-Band wird dann aus der Steigung abgerufen und ist einsatzbereit. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" /> Abbildung 1. Homogenat Fraktionierung auf einen diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten. Maus Cortex wurde homogenisiert und auf einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten, die zu 6 Bands oder Fraktionen. Das gereinigte, aktive SNs (*) wurden in Band 5 gefunden. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" /> Abbildung 2. SN Präparate geben eine heterogene Mischung von SNS, die präsynaptischen und postsynaptischen Elemente behalten. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines SN-Präparation aus C57BL / 6 Mäuse (Alter P13 bis P21) wie zuvor beschrieben hergestellt und zeigt SNs wurde mit erhaltener präsynaptischen und postsynaptischen Elementen durchgeführt. 2 , 6 Rote Pfeile weisen auf post-synaptischen Dichten. Maßstabsbalken ist 1 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" /> Abbildung 3. Western-Blot-Analyse von SN Präparate zeigten, dass synaptischen und neuronalen Marker im gereinigten SNs wurden beibehalten (Band 5), aber die Fülle von anderen Markern deutlich reduziert werden. Immunoblots der Überstand (S, zentrifugiert kortikalen Homogenat) und Bands 1-6 von einer diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurden für β-Actin (Struktur-, Be-Kontrolle), GFAP (Astrozyten), GP73 (Golgi), HSC70 (zytoplasmatische und nukleare), Lamin-B1 (Kernenergie), Prohibitin (Mitochondrien), PSD95 sondiert (postsynaptischen Dichte ), SNAP25 (synaptic), Synaptophysin (synaptic) und β3-Tubulin (Neuronen-spezifische). Die Banden wurden mit einem Sturm 860 Phosphorimager, Vertreter der n = 3. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" /> Abbildung 4. SNs sind aktiv und zeigen de novo Proteinsynthese über [35S]-Met Statuten. SNs wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann die SNS wurden unbehandelt oder vorbehandelt für 15 min mit 40 uM Anisomycin oder 1 uM Juglon bei 37 ° C durch Zugabe von [35S]-Met folgte, 20 ul Express Pro-Label-S35 Einfache Tag Mix, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" /> Abbildung 5. Band 5 aus der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten enthielt die höchsten Ebenen der de novo Proteinsynthese. Bands 4, 5 und 6 und der Überstand (S, zentrifugiert kortikalen Homogenat) wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann [35S]-Met, Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag wurde hinzugefügt, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" /> Abbildung 6. SNs aus einer Filtration Verfahren hergestellten enthalten mehr gebrochen Membranen und weniger ganze SNs als SNs aus der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Verfahren hergestellt. SNs wurden, indem homogenisiert Kortex durch eine Reihe von Filtern mit abnehmender Porengröße wie zuvor beschrieben vorbereitet. 3,14-15 Ein Aliquot der SNS durch die Filtration Methode hergestellt über einen diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurde zentrifugiert und im Vergleich zu einer äquivalenten Menge Material unter Verwendung des diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" /> Abbildung 7. SNs aus einer Filtration Verfahren hergestellten enthalten weniger de novo Protein-Synthese-Aktivität als SNs her vorbereitetm der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode. SNs wurden, indem homogenisiert Kortex durch eine Reihe von Filtern mit abnehmender Porengröße wie zuvor beschrieben, 3,14-15 und durch den diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten Methoden hergestellt. SNs von beiden Präparate wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann [35S]-Met, Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag wurde hinzugefügt, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" /> Abbildung 8. SNs von jüngeren Mäusen (P14) haben eine größere translatorische Tätigkeit als ältere Mäuse (P85). SNs aus verschiedenen alten Mäusen unter Verwendung des diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode, voräquilibriert bei 37 ° C für 10 min wurden hergestellt, behandelt oder unbehandelt in der mit Glu Gegenwart von [35S]-Met (Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag) für 30 min, schockgefroren und später mit dem Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit gereinigt. Die SNS wurden dann auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel laufen, getrocknet und abgebildet auf einem Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. SNs von P14 Mäusen wurden mindestens 3-fach aktiver als P85 Mäusen.

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	<li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein.">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li><li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis.">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li><li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction:+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions.">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li><li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes.">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li><li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex:+cyclic+adenosine+3':5'-monophosphate-generating+systems,+receptors,+and+enzymes.">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li><li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level.">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li><li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+translation:+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow.">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic,+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis.">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li><li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation.">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translational+control+in+dendrites+and+its+role+in+long-term+synaptic+plasticity.">Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity.</a> J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).</li><li>Li, K. -. W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+rat+brain+postsynaptic+density:+implications+of+the+diverse+protein+functional+groups+for+the+integration+of+synaptic+physiology.">Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology.</a> J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).</li><li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry.">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li><li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer's+amyloid+&#x03B2;42+from+isolated+intact+nerve+terminals.">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid &#x03B2;42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li><li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes.">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li><li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing,+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium.">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li><li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neuronal+excitability,+synaptic+plasticity,+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice.">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li><li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels.">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li><li>Sallert, M., Malkki, H., Segerstr&#228;lea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development.">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li><li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo.">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li><li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses.">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li><li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus.">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li><li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis.">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex.">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li><li>Haj&#243;s, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity.">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li><li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptosome+Proteomics.">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li><li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized:+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes.">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li><li>Pertoft, H., Laurent, T. C., Catsimpoolas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopycnic+separation+of+cells+and+cell+organelles+by+centrifugation+and+modified+colloidal+silica+gradients.">Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients.</a> Methods of Cell Separation. , 25-65 (1977).</li><li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+&amp;gamma;-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster.">High affinity uptake of L-glutamate and &amp;gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li><li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints.">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li><li>Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+composition,+kit+and+method.">Cell separation composition, kit and method.</a> US patent. , (1997).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Gradienten Vorbereitung hierin beschriebenen ist eine schnelle, zuverlässige Methode, um aktiv SNS, die in einer Vielzahl von synaptischen Übertragung Experimente verwendet werden können isolieren. Dieser Gradient-Methode, die auf der Methode von Dunkley et al., 3,4 entwickelten, ist eine subzelluläre Fraktionierung Gehirn Verfahren, das sowohl prä-und postsynaptischen Membran-derived Bläschen, die miteinander verbunden sind, isoliert. Ohne weitere Reinigung die...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Micro BCA Protein Assay Kit </td><td> Durchstechen </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fischer </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2-Gas </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Fischer </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fischer </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fischer </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit </td><td> Durchstechen </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fischer </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Fischer </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxin </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Ausstattung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Dissection-Tools </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce Homogenisator, 7 mL (kommt mit zwei Glas-Stößel mit der Aufschrift &quot;A&quot; und &quot;B&quot;) </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR Centrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3,8 Rotor, Ausschwingrotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 Zentrifuge </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman Röhrchen mit Kappen </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Weiß ummauerten Adapter </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Blau ummauerten Adapter </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, Festwinkelrotor </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle der Antikörper für Western Blots verwendet: <table border="1"><tbody><tr><th> Name der Antikörper </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Wirtsarten </th><th> Verdünnungsfaktor </th></tr><tr><td> β-Aktin </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> Maus </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65343 </td><td> Maus </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-134509 </td><td> Kaninchen </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-7298 </td><td> Maus </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-6261 </td><td> Ziege </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28259 </td><td> Kaninchen </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> Maus </td><td> 5 ug / ul </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666-100 </td><td> Kaninchen </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> Maus </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-Tubulin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80016 </td><td> Maus </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

preparation of synaptoneurosomes from mouse cortex using a discontinuous percoll-sucrose density gradient

Synaptoneurosomen (SNS) sind nach der Homogenisierung und Fraktionierung von Maus Hirnrinde erhalten. Sie sind Vesikel oder isolierte Terminals, die ausbrechen aus Axonterminalen wenn die kortikale Gewebe wird homogenisiert und verschließen. Die SNS behält prä-und postsynaptischen Eigenschaften, wodurch sie sinnvoll in das Studium der synaptischen Übertragung. Sie behalten die molekulare Maschinerie in neuronalen Signalübertragung verwendet und sind in der Lage die Aufnahme, Speicherung und Freisetzung von Neurotransmittern. Die Herstellung und Isolierung von aktiven SNs kann problematisch mit Medien wie Ficoll, die zytotoxisch können und müssen verlängert Zentrifugation aufgrund der hohen Dichte und Filtration und Zentrifugation Methoden, die in geringer Aktivität durch eine mechanische Beschädigung der SNS können die Folge sein. Allerdings ist die Verwendung von diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten an SNS isolieren eine schnelle Methode, um gute Ausbeuten an translationsaktiven SNs produzieren. Die Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode ist schnell und sanft wie es isotonischen Bedingungen beschäftigt, hat weniger und kürzere Zentrifugation Spins und vermeidet Zentrifugationsschritte, dass Pellet SNs und mechanische Schäden verursachen.

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Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Eine Methode, um translationsaktiven, intakte Synaptoneurosomen (SNS) von der Maus Hirnrinde vorbereiten beschrieben. Das Verfahren nutzt eine diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Dies ermöglicht die schnelle Erstellung von aktiven SNS.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.2K Aufrufe.  University of Wisconsin. Eine Methode, um translationsaktiven, intakte Synaptoneurosomen (SNS) von der Maus Hirnrinde vorbereiten beschrieben. Das Verfahren nutzt eine diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Dies ermöglicht die schnelle Erstellung von aktiven SNS.

Serie: Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

Die Untersuchung der Funktion von Deep kortikalen und subkortikalen Strukturen Mit Stereotaktische Elektroenzephalographie: Lehren aus der anterioren cingulären Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...