Die Arbeit für dieses Projekt wurde durch Mittel der National Institutes of Health R01-NR5339 und den uniformierten Diensten University of the Health Sciences-R061LD unterstützt.

1. Isolierung und Vorbereitung der Pial Arterien <ol><li> Während die Ratte narkotisiert einfügen und sichern einen Katheter in eine Arterie und perfuse mit 1% Evans-Blau in 1X PBS. Pial Schiffe gut Fleck mit dem Evans-Blau-Farbstoff so dass sie leichter zu isolieren. </li><li> Auszug des Gehirns und bei -70 ° C bis zum Gebrauch. Optimalerweise sollten Gehirn nicht länger als 2 Monate gelagert werden. </li><li> Mit einem Binokular entfernen Pia Arteriolen (Durchmesser 35-50 um) von der Oberfläche des Gehirns. Ziehen Sie alle blau gefärbten Arteriolen von dorsal und lateral der Oberfläche der Hirnrinde mit spitzen Pinzette. Entfernen Sie überschüssiges Anhänger kortikalen Gewebe, bevor sie in das Fixativ. </li><li> Fix die geernteten Arteriolen in 2% Paraformaldehyd in kaltem 0,1 M PBS für 30 min. </li><li> Zur Vorbereitung der Arteriolen zum Schneiden pour Einbettmedium über das Einfrieren Disc / Bohrfutter (Set bei -20 ° C). </li><li> Legen Sie Arteriole Abschnitt flach auf dem Chuck einend warten, bis es gefrieren. Fest statt das Schiff oben rechts auf den Kryostaten Eiserzeugerplatte zum Einbetten von Medien mit der Spitze der Arterie zu Ihnen zeigt. Halten Sie es mit einer Pinzette, bis er fest zugefroren ist. </li><li> Legen Sie die Eiserzeugerplatte mit dem Schiff in den Kryostaten Kopf und schnitt 8 um Pia Arteriole Ringen mit dem Kryostaten. </li><li> Montieren Sie die Arteriole Abschnitte auf Chrom-Kalium-Gelatine subbed Dias. </li><li> Bewahren Sie die vorbereiteten Folien in einer Bildschirmpräsentation Box im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 2. ER-α Immunfluoreszenzfärbung Tag 1 <ol><li> Entfernen Sie die Dias aus dem Kühlschrank, bringt jeweils auf Raumtemperatur. </li><li> Zum Waschen der Objektträger pour 1-1.5 ml 0,1 M PBS (genug, um alle Abschnitte behandeln) lassen Sie sich für 10 Minuten, abtropfen lassen und wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal. Jede Kante der Folie hat eine hydrophobe Marker. Folglich bleibt die Flüssigkeit auf der Oberfläche der Folie. Mit jedem Waschen die Flüssigkeit gegossenheraus und mit frischen 0,1 M PBS ersetzt. </li><li> Inkubieren in 1 ml 50 mM Ammoniumchlorid 30 min bei Raumtemperatur auf endogene Fluoreszenz zu reduzieren. </li><li> Waschen Sie die Slides in 0,1 M PBS 3x10 min. wie in 2.2 beschrieben </li><li> Block Dias in 0,1% Triton-X 100 plus 1% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS für 30 min. um unspezifische Bindung zu reduzieren. </li><li> Inkubieren Proben mit dem primären Antikörper (Kaninchen polyklonaler anti-ER-α; 1:500) in PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> Tag 2 <ol start="7"><li> Entfernen Sie die Dias aus dem Kühlschrank, bringt jeweils auf Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Slides in 0,1 M PBS 3x10 min. wie in 2.2 beschrieben </li><li> Inkubieren mit Oregon Green 488 sekundäre Anti-Kaninchen in 1% NGS +0,1% Triton-X100 + PBS für 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur. Von diesem Schritt müssen die nächsten Schritte im Dunkeln durchgeführt werden. </li><li> Waschen Sie die Slides in 0,1 M PBS 3x10 min. wie in 2.2 beschrieben </li><li> Unter einem ventilated Kapuze, Platz 1 Tropfen 4 &#39;, 6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) plus Montage Medien auf die Gefäße und setzen Sie dann ein Deckglas über die Probe. </li><li> Übernehmen klaren Nagellack an den Rändern des Deckglases zu versiegeln. Bewegen Sie den Schieber, bis sie vollständig trocken, was dauert etwa 24 Stunden. </li></ol> 3. Digitales Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Für die Bildgebung ER-α in die Pia-Behälter Scheibe verwenden wir eine Nikon Eclipse 80i digitalen Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtern für 3 Farben (blau, grün und rot) mit einer digitalen Kamera ausgestattet. </li><li> Legen Sie die vorbereiteten Objektträger mit den gefärbten Pia Gefäßsegmente unter dem Mikroskop und stellen Sie die fluoreszenzmarkierten Bereiche von Interesse zu visualisieren. Start am x100 Vergrößerung dann x600 Vergrößerung zu erhöhen. </li><li> Verwenden Sie die Kamera Bilder in DAPI (blau) und FITC (grün) Kanäle für Zellkerne (DAPI) und ER-α (Oregon Green) mit Nikon Erweiterte Tiefe Focus Software Capture mehrfache View konvertierens der Gefäßabschnitte in 2-D-Bilder. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Wir lokalisierten Östrogen-Rezeptor-α in Pia arteriellen Gefäße unter Verwendung von fluoreszierenden Sonden und optimiert unsere Visualisierung des Rezeptors mit digitalen Fluoreszenzmikroskopie. Um die Anwesenheit des Rezeptors, einem polyklonalen Kaninchen-Primärantikörper und einem Oregon Green 488 markierten sekundären Antikörper wurde zur Abbildung der Rezeptoren in pialen Arterien von der Oberfläche des Gehirns isoliert. Auch eine Kernfärbung (DAPI) wurde verwendet, um die Zellkerne zu identifizieren und festzustellen, ob wir Rezeptoren im Zellkern befinden könnten erkennen, da ER-α berichtet worden ist, anwesend zu sein in der Zelle cyotosol und den Zellkern. Darüber hinaus führten wir bestätigende Versuche, um die Spezifität des primären Antikörpers zu validieren und zu verifizieren, die Bindung des sekundären an den primären Antikörper. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/><br/&gt; Abbildung 1. Immunfluoreszenzfärbung für ER-α (grün) und Gegenfärbung mit DAPI (blau) in einem pialen Arterie Ring von weiblichen Rattenhirn isoliert. Abb. 1A zeigt das fusionierte Bilder auf das Vorhandensein von einigen intranukleären Östrogen-Rezeptor-a (Pfeil). Abb. 1B und 1C sind die fokussiertes Bild von ER-α, die eine Kombination von Z-Stapel-Bildern ist. Die Bilder wurden am x600 Vergrößerung aufgenommen und sind vom Schnitt Ring des gleichen Schiffes in verschiedenen Ebenen. Die Pfeile zeigen die Östrogen-Rezeptor-α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Immunfluoreszenzfärbung für Kontrollgruppen in einer pialen Arterie Ring von weiblichen Rattenhirn isoliert. Abb. 2D zeigt das Schiff ohne Primärantikörper. Abb. 2E zeigt das Schiff ohne die Sekundär-Antikörper (Anm. deutliche Autofluoreszenz entlang Endothelzellen auf dieser Seite). Die Bilder wurden am x600 Vergrößerung aufgenommen und sind vom Schnitt Ring des gleichen Schiffes in different Ebenen.

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	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position des Uniformed Services University of the Health Sciences, das Department of Defense, oder die Regierung der Vereinigten Staaten.

Bisher haben wir gezeigt, dass nach transienter globaler Ischämie-Hirn-Trauma der pialen Arterie Fähigkeit, Durchmesser als Reaktion auf beide Vasodilatatoren 7, 8 und 9 zu ändern Vasokonstriktoren deutlich ist in jungen ovariektomierten Ratten deprimiert. Chronische Östrogen Fülle wieder vasomotorische Reaktionen 7-9. Darüber hinaus kehrt verzögert Östrogen-Ersatztherapie die wohltuende Wirkung von Östrogen auf die Pia Arterie vasodilatatorische Kapazität 10 führt uns zur Frage, ob langfristige Östrogen Erschöpfung ER-α Dichte wirkt in der cerebrovasculature. Wir planten, Immunofluoreszenz Markierung mit Western-Blot auf Veränderungen in ER-α Expression als Reaktion auf chronische Erschöpfung Östrogen bewerten kombinierten Einsatz. Da wir einige Schwierigkeiten bei der Visualisierung von diskreten Gruppen von Rezeptoren hatten wir modifiziert die Methode, die wir zeigen hier. Deshalb war unser primäres Ziel in dieser Studie zum ersten Entwicklung eine relativ einfache Methode, um die visuelle Optimierungsierung der Rezeptoren in pialen Arteriolen. In Absprache mit mehreren Berichten 6,11,12 fanden wir es notwendig, Anpassungen für die Art des Gewebes waren wir Sondieren, die Dicke der Probe, die Verteilung von ER-α in das Schiff, als auch der Grad der unspezifischen Bindung zu . Unsere Methode ist sehr effektiv, um das Vorhandensein von ER-α in Pia Schiff Scheiben sichtbar zu machen. Aber wie andere zuvor den erfolgreichen Einsatz dieser Methoden hingewiesen ist stark abhängig von der Spezifität und Konzentration der Antikörper, die subzelluläre Lokalisation der Proteine ​​von Interesse, die Fixierung und blockiert Protokolle und Gewebe Handling 12. Vor Visualisierung unseres Schiffes Vorbereitungen verbrachten wir Zeit zu arbeiten, alle diese Variablen. Wir haben deutlich gemacht, wie wir einige unserer Herangehensweise in diesem Papier einstellen benötigt. Wir wollten optimal visualisieren ER-α in pialen Arteriolen und diese vor einigen Herausforderungen.Erstens ist die durchschnittliche Größe einer Ratte pialen Arterie zwischen 35-50 um was Trennung und Entfernung aus der Hirnoberfläche etwas tricky. Wir fanden, dass Perfusion mit Evans blauen Farbstoff vor der Tötung macht Dissektion der Arterien erleichtern. Evans-Blau kann sich auf Fluoreszenz, aber wir spüren, dass der Vorteil der Verwendung dieser Farbstoff seiner geringen Nachteile überwiegen. In unserem Protokoll die Gefäße werden mehrmals gewaschen. Dies minimiert die verbleibende Farbstoff in die Gefäße und reduziert die möglichen Auswirkungen des Farbstoffes auf Fluoreszenz. Eine weitere Schwierigkeit, die wir hatten, war, dass die Dicke der Pia Gefäßsegmente klare Darstellung der Rezeptoren erschwert. Darüber hinaus konnten wir nicht erhalten, besonders klare Bilder wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass ER-α durch mehrere Zellschichten wurde verstreut. Wir haben versucht, die Arbeit mit Längs-Schiff Scheiben (wie andere), aber aufgrund der kleinen Pia Größe war es schwierig, die Gefäße behandeln und zu verhindern Verdrehen der Schiffe während der Montageauf Folien auch unter dem Mikroskop. Schließlich haben wir erfolgreich unsere Technik mit Hilfe eines Kryostaten und Schneiden des Schiffes quer in bis 8 um dicke Ringe geändert. Die Ringe sind leichter zu handhaben und einige können auf einem Schlitten montiert werden. Einmal haben wir das Schiffe hielten wir es für notwendig, um die Wirksamkeit der erste Blitz Einfrieren des Gewebes dann Fixierung der Gefäße durch Danseshatalb und Mitarbeiter 11 vorgeschlagen zu prüfen. Obwohl wir etwas weniger Hintergrund Immunfluoreszenz finden wir auch festgestellt, dass die Rezeptoren weniger stark machen Visualisierung der Rezeptoren schwieriger gefärbt. Daher bevorzugen wir die ersten, die gesamte Gehirn einfrieren und lagern, bis sie benötigt (in der Regel zwischen 1-2 Monaten). Wir ziehen aus den Gefäßen, wie beschrieben und fixieren die Gefäße vor dem Schneiden mit dem Kryostaten. wie wir demonstrieren hier. Ein notwendiger Schritt ist, die Kontrollen sowohl mit dem primären und dem sekundären Antikörper separat ausgeführtzur Spezifität und Hintergrund Immunfluoreszenz zu bestimmen. Estrogen-Rezeptor-α-Antikörpern kann schwierig sein, mit zu arbeiten. In der Tat haben wir versucht, 3 verschiedene Primärantikörper (1 monoklonalen und 2 polyklonal), bevor wir mit dem Erfolg unserer Rezeptor Färbung zufrieden waren. Als Teil unserer Kontrolle übernehmen wir zunächst die Spezifität des primären Antikörpers durch Unterlassung der Addition des primären Antikörpers nachgewiesen. 2D zeigt das Schiff ohne Primärantikörper. Es gibt keine Flecken und nur ein wenig Hintergrund-Signal. Da der primäre Antikörper polyklonal, gibt es einige diffuse unspezifische Hintergrundfärbung. Zweitens, haben wir den primären Antikörper, nicht aber der sekundäre Antikörper (Abb. 2E). Man sieht eine schöne Marge, die die Autofluoreszenz entlang der endothelialen Grenzen der Gefäße. Dies steht im Einklang mit der Arbeit von Dan und Kollegen 5. Doch weder die kleinen Punkte Immunfluoreszenz, dass ER-α stellen, noch die körniges Aussehen reflecting die Anwesenheit von zahlreichen Rezeptoren kann ohne die Kombination der beiden primären und sekundären Antikörper nachgewiesen werden. Wir haben festgestellt, ein deutliches Muster der Autofluoreszenz entlang der endothelialen Rande der Gefäße. Diese unabhängigen Tests für Antikörper-Spezifität sind wichtig, da sie die Spezifität der Antikörper für die ER-α zu bestätigen und der sekundäre Antikörper bindet an den primären. Zum Schluss, wie andere 4 gezeigt, enthalten 5 Gehirn Blutgefäße zahlreichen ER-α-Subtyp-Rezeptoren. In unseren Händen, die Vorbereitung 8μm Querschnitt Scheiben von isolierten pialen Arterien verbessert Färbung und Visualisierung der Rezeptoren. Traditionelle Methoden der konfokalen Mikroskopie, um die Proben zu untersuchen. Die Fähigkeit, serielle optische Schnitte von dicken Proben Sicht ist ein wichtiger Vorteil der konfokalen Mikroskopie. Allerdings können Kauf einer Ware konfokalen Mikroskop sehr teuer sein. Durch die Verwendung erweiterter Tiefenschärfe (EDF)-Software, fanden wir, dasskonnten unsere Geräte zu senken. Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops mit EDF erhielten wir klare Bilder und sind in der Lage, Pia arteriellen ER-α auf mehreren Ebenen mit Z-Stapel zu visualisieren. Ein wesentlicher Vorteil der EDF-Software ist, dass es Bilderfassung ermöglicht in einer Art und Weise um effektiv eine 3-D Bild von den Bildern. Für Laboratorien, die keinen Zugang zu einem konfokalen Mikroskop oder die Mittel zum Kauf einer digitalen Fluoreszenzmikroskop mit angeeignet Software kann eine praktische und weniger kostspielige Option, je nach den Zielen der Ermittler werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Evans Blue </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek OCT Compound </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Ammoniumchlorid </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER-α polyklonalen Kaninchen-Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon Green 488 Ziege anti-Kaninchen IgG </td><td> Invitrogen </td><td> O-11038 </td></tr><tr><td> Vectashield MontageMedium für Fluoreszenz mit DAPI </td><td> Vector Lab </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

Viele von Östrogen-Effekten auf vaskuläre Reaktivität sind durch die Interaktion mit Östrogen-Rezeptoren 1, 2, 3 vermittelt. Obwohl zwei Untertypen (Östrogen-Rezeptor-α und β) bestehen, hat Östrogen-Rezeptor-α sowohl in den glatten Muskelzellen und Endothelzellen in der Pia-arterielle Segmente unter Verwendung von fluoreszierenden Färbung mit konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie 4 kombiniert identifiziert worden. Darüber hinaus ist ER-α in den Kernen und im Zytoplasma der Ratte basilaris Arterien 5 befindet. Die Rezeptoren sind reichlich vorhanden und fluoreszieren hell, aber klare Darstellung der diskreten Gruppen von Rezeptoren ist schwierig wahrscheinlich auf die Zahlen in vielen Zellschichten Pia Gefäßsegmente entfernt. Darüber hinaus haben viele Berichte mit immunhistochemischen Techniken mit der konfokalen Mikroskopie schlecht detailliert die Anforderungen von entscheidender Bedeutung für Reproduktion Versuche 6 gekoppelt. Unser Ziel für diesen Artikel ist eine einfache Technik zu beschreiben, t zu optimierenHE-Färbung und Visualisierung von ER-α mit Querschnitts-Scheiben pialen Arteriolen erhalten von weiblichen Gehirn von Ratten. Zunächst perfuse Ratten mit Evans blauen Farbstoff leicht identifizieren Oberfläche pialen Arterien, die wir isolieren unter einem Binokular. Die Verwendung eines Kryostaten bis 8 um Querschnitte der Arterien Scheibe ermöglicht es uns, dünne Gefäßabschnitte zu erhalten, so dass unterschiedliche Behälter Flugzeuge mehr übersichtlich visualisiert werden. Quer durch das Schiff, anstatt mit Hilfe eines kleinen Schiffes Segment hat den Vorteil einer einfacheren Betrachtung der Endothel-und glatten Muskelschichten. Darüber hinaus eines digitalen Immunfluoreszenz-Mikroskop mit erweiterter Tiefenschärfe Software erzeugt scharfe Bilder von zehn Minuten vor zwölf verschiedene Schiffstypen Flugzeuge und ist kostengünstiger als die Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop nutzen.

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Imaging of Estrogen Receptor-&amp;#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Verfahren zu demonstrieren Immunfluoreszenz Detektion von Östrogen-Rezeptor-α (ERa) in Ratten Pia arteriellen Scheiben mit einem digitalen Immunfluoreszenz-Mikroskop zu optimieren.

Imaging von Estrogen Receptor-α in Rat Pial Arteriolen mit einem Digital-Immunfluoreszenz-Mikroskop

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

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Serie: Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Forschung

Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Wesentliche Komponenten des Lichtmikroskops

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Einrichten eines Simple Light Noten Mikroskop für<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging von<em&gt; C. elegans</em&gt; Entwicklung

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Mikron-Skala Phänotypisierung Techniken der Mais Leitbündel basierend auf Microcomputed Röntgentomographie

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...