Und der Tulane Hypertonie und Nieren Center of Excellence von NIH finanziert P20RR017659-08 (PI: Diese Arbeit wurde vom Board of Regents des Staates Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (WL Murfee PI) unterstützt : L. Gabriel Navar).

1. Chirurgisches Vorgehen Set-Up Hinweise <ol><li> Vor der Operation zu sterilisieren chirurgisches Material und Instrumente. Zubehör für das sterilen chirurgischen Verfahren für jede Ratte verwendet werden, umfassen ein Abdecktuch an sich als eine sterile Oberfläche für die Platzierung der Instrumente gelegt werden, einem Tuch, mit einer vorgeschnittenen Öffnung etwa 0,5 x 1,5 in der in der Mitte über der Ratte platziert werden und Gaze. Die vorgeschnittene Loch auf dem Abdecktuch wird mit dem Einschnitt an der Ratte angeglichen. Instrumente für die Operation erforderlich sind 1 Standard-Schere verwendet werden, um Nahtmaterial geschnitten werden, zwei Zangen und einer feinen Nadel Halter für den Umgang mit und Greifen des Fadens, und ein Skalpell mit einer Klinge. Wir haben die gemeinsame Instrumente durch unser Labor in der Tabelle der spezifischen chirurgischen Materialien und Werkzeuge verwendet werden aufgelistet. Allerdings hängt endgültige Auswahl-Werkzeug auf Experimentator Präferenzen. </li><li> Bereiten Sie die Operation Raum. Stellen Sie ein 100 ml 0,9% iger steriler Saline-Tasche unter einem Heizkissen um sicherzustellen, dass die Salzlösung, die in Kontakt kommt wit dem Mesenterium Gewebe wird auf ca. 37 vorgewärmt ° C. Als Alternative zur Saline, können Sie mit Ringer-Lösung oder einen anderen physiologischen Puffer. Legen Sie sterilisierte chirurgische Instrumente und Zubehör auf einem sterilen Tuch für einen einfachen Zugang während des Verfahrens Exteriorisation. Außerdem benötigen Sie sterile Wattestäbchen Applikatoren und die entsprechenden 3 Arten von Nähten (4-0, 5-0 und 7-0). Stellt sicher, dass Pakete sind so voreingestellt, dass die Materialien eröffnet mit sterile Handhabung zugegriffen werden kann. Schließlich desinfizieren zuvor modifizierten Kunststoff Stufe durch Eintauchen in 100% Ethanol für mindestens 5 Minuten. Die Bühne ist eine 100 mm Petrischale mit einem elliptischen Loch in der Mitte (Abbildung 1) zu schneiden. Ein Dremel-Tool kann verwendet werden, um zunächst zu machen und, falls erforderlich, erweitern Sie das Loch werden. Nachdem das Loch gemacht wird, werden die Ränder des Schnittes Kunststoff glatt mit Schleifpapier unterschiedlicher Körnung. Die Bühne wird dann gewaschen und schließlich entweder inert Modelliermasse (gekauft von einem lokalen Handwerks speichern) oder Silicam Klebstoff auf des Lochs Kante hinzugefügt, um einen erhöhten, glatte Oberfläche bereitzustellen. Vor mit dem Gewebe in Kontakt, wird die Stufe müssen ausreichend mit steriler Kochsalzlösung gespült werden. </li><li> Für dieses Modell der Angiogenese, wir verwenden in der Regel erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (350 ± 25 g). Andere Rattenstämmen und Altersstufen verwendet werden kann. In unserem Labor sind Ratten betäubt durch intramuskuläre Injektion mit Ketamin (80 mg / kg KG), Xylazin (8 mg / kg KG) und Atropin (0,08 mg / kg KG). Nach ca. 5 Minuten, wird die Wirkung der Anästhesie bestätigt und der Ratte Bauchhaut rasiert wird. </li></ol> 2. Rattengekröse Exteriorisation Modell <ol><li> Positionieren Sie den narkotisierten Ratte auf dem Rücken auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten. Aseptische Techniken werden während des chirurgischen Eingriffs verwendet. Trage sterile Handschuhe und erlauben keine Apparaten und Materialien zu nicht-sterilen Oberflächen außer den Rattengeweben kontaktieren. </li><li> Säubern Sie Bauch-Bereich mit wechselnden Tücher USIng die sterile Gaze in 70% igem und Jod getränkt. </li><li> Mit dem Skalpell, einen kleinen (ca. 0,75 Zoll) Längsschnitt entlang der Haut und dann der Linea alba ca. 1 cm unterhalb des Brustbeins. </li><li> Platzieren Sie die vorgeschnittenen Tuch über die abdominale Abschnitt so daß die Öffnung ausgerichtet ist mit dem Einschnitt. </li><li> Durch leichten Druck um den Einschnitt. Dies wird in der Regel in der Exposition des Dünndarms genug, um es leicht identifiziert werden können führen. </li><li> Mit den Wattestäbchen Applikatoren, ziehen Sie vorsichtig einen Abschnitt des Dünndarms und suchen Sie das Ileum. Da das Mesenterium herausgezogen wird, sollte sie vorsichtig gelegt werden, sind im Kunststoff-Stufe (Abbildung 2). </li><li> Identifizieren 6-8 vaskularisierten mesenterialen Fenstern. Ein mesenterica Fenster wird als dünne durchlässige Membran zwischen den Arterien / Venen Paaren Zuführen des Dünndarms (2) definiert. </li><li> Notieren Sie sich die Startzeit der Entäußerung. Verlassen Sie die mesentery Abschnitt exteriorisiert für 20 Minuten. Während der Periode Exteriorisation, verwenden Sie eine sterile Spritze (5 ml), um intermittierend füllet die Saline in der Petrischale, um sicherzustellen, dass das Gewebe eingetaucht bleibt und nicht austrocknet. </li><li> Während der 20-minütigen Einwirkzeit, markieren Sie die zwei zentral gelegenen mesenterialen Fenster mit sterilem Nahtmaterial 7-0. Die Markierungen sollten in dem Fett in der Nähe des Darmes vorgenommen werden. </li><li> Senden Sie das exteriorisierten Region des Mesenteriums in die Bauchhöhle. </li><li> Schließen Sie die Bauchmuskeln mit 5-0 Monofilamentnaht in Muster unterbrochen. </li><li> Schließen Sie die Haut mit 4-0 Monofilamentnaht in Muster unterbrochen. </li><li> Wischen Sie die Fläche mit wechselnden vernäht Tücher über die sterile Gaze in 70% isopropoyl und Jod getränkt. </li><li> Verbreiten Augensalbe Gel auf beiden Augen der Ratte. Der Zweck der Schmierung des Auges ist, um ein Austrocknen der Hornhaut während des chirurgischen Eingriffs und Wiederherstellung zu verhindern. Die Anwendung von Schmiermittel Auge angewendet werden solltevor Beginn des chirurgischen Eingriffs. Falls nötig, tragen Sie Auge Schmiermittel vor Rückgabe der Ratte in den Käfig für die Verwertung. </li></ol> 3. Tissue Ernte und Fixierung <ol><li> Am Tag der Zinsen nach Stimulation, betäuben und einschläfern die Ratte. In unserem Labor sind Ratten über eine intramuskuläre Injektion mit Ketamin (80 mg / kg KG), Xylazin (8 mg / kg KG) und Atropin (0,8 mg / kg KG) und dann über intrakardiale Injektion von beuthanasia eingeschläfert betäubt. Beuthanasia ist ein Pentobarbital-Natrium / Phenytoin Lösung, die für eine schnelle und schmerzlos Euthanasie verwendet werden können. Pro Ratte unserem Labor üblicherweise injiziert 0,1 bis 0,2 ml. </li><li> Öffnen Sie erneut die Bauchhöhle und entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm, und suchen Sie die beiden markierten Fenstern. </li><li> Schneiden Sie jede der exteriorisierten mesenterialen Fenster mit einer Pinzette und Mikro-Schere. Einschließlich einer Grenze von Fett pro Fenster ist von Vorteil für die spätere Verbreitung Gewebe auf Objektträger. SofortTauchen Sie jedes Fenster in PBS. Beim Schneiden, versuchen zu vermeiden, Durchschneiden der Arterien / Venen-Paare innerhalb des Fett-Grenze der Fenster, um potenzielle Blutfüllung der Fenster zu minimieren. Außerdem minimieren Schneiden durch den Darm führt, dass Darminhalt die Fenster Kontakt. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um Gewebe auf positiv geladene Objektträger ausgebreitet. Zwei Gewebe können pro Folie montiert werden. </li><li> Lassen Sie das Gewebe teilweise zu trocknen und mit einem Skalpell entfernen Sie das überschüssige Fett. </li><li> Die Gewebe sind nun bereit, fixiert werden. Typische Befestigungsmethoden verwendet werden. In unserem Labor haben wir häufig zu fixieren Sie die Folien in Methanol (-20 ° C) für 30 min. Erfolgreiche Kennzeichnung hat auch mit nicht fixierten Gewebe durchgeführt. Fixation Methoden könnten auf Ihre bevorzugte Antikörper abhängen. </li></ol> 4. Tissue Immunmarkierung <ol><li> Die Gewebe können in der Regel nun entsprechend den Anweisungen pro Antikörper für die Immunhistochemie gekennzeichnet werden. Da unser Interesse an der Identifizierung der Rollenvaskulärer Perizyten während der Angiogenese, unserem Labor üblicherweise markiert für Endothelzellen und perivaskuläre Zellen 10, 12, 13. Nützliche Markierungen an Endothelzellen entlang der Hierarchie der mikrovaskulären Netzwerken zu identifizieren sind ein anti-PECAM-Antikörper oder BSI-Lektin. Perivaskuläre Zellmarker in diesem Gewebe verwendet werden, umfassen NG2, Desmin, SM-α-Actin, PDFGRβ und Klasse III β-Tubulin. Unten, in Abschnitt 3.3 haben wir Protokolle zur colorimetrischen und fluoreszenten PECAM Immunomarkierung Protokolle aufgelistet. </li><li> Vor der ersten primären Antikörper Inkubation sind Dias Vakuum getrocknet, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Auch werden die Gewebe zunächst mit einem Wachsschreiber erläutert, um unkontrollierten Antikörperlösungen vom Gewebe zu verhindern. Schließlich werden alle Schritte Kennzeichnung von Wasch-Schritte folgen. Für Waschschritte werden gleitet im Inneren Färbeschalen platziert. Die Pufferlösung wird 3-mal während des Waschvorgangs Dauer ausgetauscht. </li><li> Endothelzellen Antikörpermarkierung Verfahren: &lt;p class = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM Kolorimetrische Lableing <ol><li> Inkubationszeit des primären Antikörpers: Drip ca. 100-200 ml primären Antikörper-Lösung (1:200 biotinylierten monoklonalen Maus-Antikörper CD31-Antikörper in Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite, um jedes Gewebe, stellen Sie sicher, das ganze Gewebe ist überzogen mit Antikörper-Lösung. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. </li><li> Sekundäre Antikörper-Inkubation: Drip sekundären Antikörper-Lösung (Vectastain Elite ABC-Lösung von Vector Laboratories, ein Streptavidin-Peroxidase sekundären Antikörper-Lösung) auf der Oberseite des Gewebes. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. </li><li> Inkubieren Gewebe mit Vector Red Nova für 15 Minuten. Dann steigen Gewebe mit Wasser. </li><li> Berg Dias: Dip Slides in 95% Ethanol 10 mal. Objektträger in 100% Ethanol für 2 Minuten. Objektträger in einem anderen 100% Ethanol sosung für 2 Minuten. Dann Objektträger in aufeinander folgenden 100% Xylol-Lösungen für jeweils 2 Minuten. Trocknen lassen und decken Gewebe mit einer dünnen Schicht aus VectaMount und einem Deckglas. </li></ol> PECAM Fluorescent Labeling <ol><li> Inkubationszeit des primären Antikörpers: Drip ca. 100-200 ml primären Antikörper-Lösung (1:200 biotinylierten monoklonalen Maus-Antikörper CD31-Antikörper in Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite, um jedes Gewebe, stellen Sie sicher, das ganze Gewebe ist überzogen mit Antikörper-Lösung. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. </li><li> Sekundäre Antikörper-Inkubation. Drip sekundären Antikörper-Lösung ((1:100 Streptavidin-CY3 in Antikörper-Puffer verdünnt (0,1% Saponin in PBS + 2% BSA)) auf der Oberseite des Gewebes bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. </li><li> Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin für 30 Minuten. </li><li> Berg Dias: Drip 50:50 PBS mit Glycerin auf der Oberseite des Gewebes. Deckenmit Deckglas. Dann verwenden Nagellack, die Lücke zwischen Deckglas und Objektträger zu versiegeln. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Bilder Rattengekröse Gewebe immunhistochemisch für PECAM beschriftet sind in Abbildung 3 dargestellt. PECAM Kennzeichnung identifiziert alle Schiffstypen entlang der Hierarchie der Umbau mikrovaskuläre Netzwerke und können verwendet werden, um angiogenen Metriken zu bestimmten Zeitpunkten nach Stimulation zu quantifizieren. PECAM Kennzeichnung ermöglicht auch die Bestimmung von Arteriolen gegenüber Venolen. Zuführen Arteriolen typischerweise kleinere Durchmesser und länglichen Endothelzell-Morphologie im Vergleich zu paarenden Venolen (Abbildung 4). Kapillaren und Kapillare Sprossen können auf Basis ihrer Gefäßdurchmesser und die relative Position in einem Netzwerk identifiziert werden. Typische Merkmale der Umbau Netzwerke sind eine erhöhte Kapillar sprießen, Gefäßdichte, vaskularisierten Bereich und venulären tortuosITY. Quantifizierung verschiedener Metriken angiogenen identifiziert den zeitlichen Verlauf der das Wachstum des Netzwerks (5). Kapillar sprießen aus bereits bestehenden Gefäßen, Spitzen zwischen Tag 3 und Tag 5 und kehrt in den unstimulierten Niveau von Tag 10. Diese vorübergehenden Anstieg der Keimung wird durch Erhöhung der Gefäßdichte und vaskularisierten Bereich folgten. Als Beweis für die Neugestaltung von größeren Schiffen in diesem Modell ist die Zahl der Arteriolen und Venen Segmenten erhöht sich auch über den Zeitverlauf. In unserem Labor ist dieses Modell verwendet, um zelluläre phänotypische Veränderungen bei bestimmten Zeitpunkt während dieser Umbauprozess 10, 11 zu identifizieren. Zum Beispiel identifiziert Klasse III β-Tubulin-Perizyten entlang angiogenetischen Gefäßen (Abbildung 6). In nicht stimulierten Geweben, ist der Klasse III β-Tubulin-Expression spezifischer Nerven. Im Gegensatz dazu auf dem Höhepunkt der Kapillare sprießen, wird der Klasse III β-Tubulin durch perivaskuläre Zellen exprimiert. Diese Artvon Ergebnis unterstreicht die Verwendung dieser einfachen und robusten angiogenen Modell, um neue Zelltypen im angiogenen Prozess beteiligt sind. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bilder des Kunststoff-Bühne Pre-und Post-Modifikation. Die zuvor modifizierten Stufe ist ein 100 mm Petrischale. Modifikationen umfassen einen elliptischen Schnitt Loch in der Mitte und die anschließende Zugabe von Knetmasse oder Silikonkleber auf das Loch der Rand für die Schaffung einer erhöhten, glatte Oberfläche. Diese Oberfläche bietet eine innere Grenze, die Superfusion der exteriorisierten mesenterialen Fenstern erleichtert. Maßstabsbalken ist 1 cm. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Abbildung 2. Das Bild von exteriorisierten mesenterialen Region. Mesenteriale Fenster sind wie die dünne lichtdurchlässige Membranen zwischen den Arterien / Venen-Paare Fütterung der Dünndarm definiert. Während der ExteriorisationDauer ist die mesenterialen Bereich angelegt und in Kochsalzlösung eingetaucht in einem modifizierten Petrischale. Inerten gelben Modelliermasse bietet eine glatte Oberfläche für das Mesenterium, um durch die vorgestanzten Löcher gezogen werden. Maßstabsbalken ist 1 cm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Bilder mesenterialen mikrovaskuläre Netzwerke von nicht stimulierten Gewebe und Gewebe bei 3 und 10 Tage nach der Entäußerung des Mesenteriums. PECAM Kennzeichnung identifiziert die Hierarchie der mikrovaskulären Netzwerken, einschließlich, Arteriolen (A), Venolen (V) und Kapillaren (C). Beitrag Stimulation, erscheint mikrovaskulären Netzwerken eine Zunahme der Kapillare sprießen (Pfeilspitzen) und Gefäßdichte. Maßstabsbalken ist 100 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Bilder Arteriole / Venole Paare innerhalb erwachsenen Ratte mesenterialen mikrovaskulären Netzwerks. In beiden Abbildungen können Arteriolen (A) von Venolen (V) basierend auf einem kleineren Durchmesser und relativ länglichen Endothelzell-Morphologie unterschieden werden. Scale-Bars sind 20 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vertreter Quantifizierung der Angiogenese-Metriken über den zeitlichen Verlauf der mikrovaskulären Wachstum Beitrag Mesenterium Exteriorisation. A) Vascular Fläche pro Gewebebereich. B) Zahl der kapillaren Sprossen pro vaskulären Bereich. C) Gesamt vaskulären Länge pro vaskulären Bereich. * Steht für signifikanten Unterschied im Vergleich zu nicht stimulierten Gruppe. Statistische Vergleiche wurden mit einem One-Way ANOVA durch Dunn-Test gefolgt. (P &lt;0,05). UN stellt unstimulierten. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Abbildung 6. Vertreter fluoreszierende Bilder von mesenterialen mikrovaskuläre Netzwerke von nicht stimulierten Gewebe und Gewebe bei 3 und 10Tag posten Exteriorisation des Mesenteriums. Immunfluoreszenz PECAM Kennzeichnung (rot) identifiziert Endothelzellen und Klasse III β-Tubulin-Kennzeichnung (grün) identifiziert Nerven (Pfeilspitzen) und perivaskulären Zellen (Pfeile). Perivaskulären Zellen transient hochreguliert Klasse III β-Tubulin während Kapillare sprießen. In unstimulierten mikrovaskulären Netzwerken ist Klasse III β-Tubulin-spezifischen Nerv und keine perivaskulären Zellen zu identifizieren. 3 Tage nach der Stimulation, Klasse III β-Tubulin-positiv markiert perivaskulären Zellen entlang Mikrogefäße. Am Tag 10, beginnt der Klasse III β-Tubulin-Expression auf den unstimulierten Szenario zurückkehren. Scale-Bar ist 50 um. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Abbildung 7. Bilder unterstützen die Machbarkeit der Tracking voretikettiert lokal applizierten Zellen während der mikrovaskulären Netzwerk Wachstum durch das Mesenterium Exteriorisation stimuliert. Die Zellen wurden über Mesenter superfundiertIC-Fenster während des 20-minütigen Zeitraum Exteriorisation. 1 Tag nach der Operation, DiI-markierten Zellen (rot) in der Brennebene Dame mit PECAM positiven Mikrogefäße (grün) beobachtet. A, B) Beispiele für DiI markiertem Knochenmarkszellen aufweist gerundet und Morphologien verlängert. In einigen Fällen (Pfeile)-Zellen wurden zusammen Mikrogefäße verlängert. C) Beispiel eines Clusters von DiI markiertem mesenchymalen Stammzellen in der Nähe der Spitze einer Kapillare sprießen (Pfeil). Scale-Bars sind 50 um (A), und 20 um (B, C).

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Exteriorisation Modell wurde im Jahr 2006 gemeldet und wird von früheren mechanischen Verletzung Rattengekröse Modellen der Angiogenese 7.4 angepasst und führt zu ähnlichen Ergebnissen zu etablierten ip Injektion Modelle, die Nutzen aus der Rattengekröse 9. Die 20 Minuten Exteriorisation Zeit wurde experimentell bestimmt, um eine robuste angiogene Reaktion zu erzeugen. Während dieses Zeitraums konnte variiert werden, gestattet aber die für die lokale Anwendung von angiogenen Inhibitoren 4 für mechanistische Studien und direkte Anwendung von exogenen Zellen für die Zelllinie Studien. Machbarkeit der Zelle Einbau in Umbau mesenterialen Gewebe wird durch Voruntersuchungen in unserem Labor mit voretikettiert Knochenmarkszellen und mesenchymalen Stammzellen (Abbildung 7), und durch den Erfolg der Untersuchung des Schicksals der menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen Injektion IP 14 unterstützt . In unserem Labor haben wir dieses Modell verwendet, um Perizyten phen identifizierenotypic Veränderungen über den Zeitverlauf der angiogene Antwort 10 und die angiogene Potential bei pathologischen Bedingungen, wie Bluthochdruck 12 zu bewerten. Die angiogene Reaktion und Zell-Phänotyp bei diesem Modell Veränderungen verbunden sind, können auch in anderen Ratte mesenterica angiogenen Modelle einschließlich chronischer Hypoxie Exposition 10, 11 beobachtet werden. Eine Begrenzung der Exteriorisation Modells ist, dass die genauen Mechanismen der Angiogenese auszulösen unbekannt sind. Veräußerlichung des Mesenteriums hat Mastzelldegranulation und erhöhte Histamin-Spiegel 6 in Verbindung gebracht worden, dennoch sind weitere Untersuchungen nötig, um mehr Einblick zu gewinnen. Die angiogenen Stimulus ist zweifellos multifaktorielle und produziert einen robusten Umbau Reaktion über die Hierarchie eines mikrovaskulären Netzwerk. Während die unbekannte Mechanismen eine große Kritik an diesem Modell zu bleiben, machen ihre Reproduzierbarkeit und Einfachheit sie attraktiv für die Identifizierung von zellulären Dynamik INVOLved in der Natur aus komplex Kapillare Keimenprozeß. Die Reproduzierbarkeit des Modells wird durch angiogenen vergleichbar Metriken über den zeitlichen Verlauf der mikrovaskulären Netzwerk Wachstum über mehrere Rattenstämmen (männliche Wistar und weiblichen Sprague-Dawley) in zuvor veröffentlichten Studien aus unserem Labor 10, 12 unterstützt. Da die Mehrheit der erwachsenen Ratte mesenterica Gewebe vaskularisiert sind, erlaubt das Modell auch für mehrere Gewebe für jedes Tier untersucht werden. Leider ist dieses Modell nicht für offensichtlich genetische Mausmodelle als Maus mesenterialen Fenster weniger nativen Vaskularisierung haben und nach unserer Erfahrung, häufig fehlt es beobachtbar Verzweigung Netzwerke. Zukünftige Anwendungen umfassen die Untersuchung von Schiff-Funktionalität während der Angiogenese mit intra-vital-Mikroskopie zu bestimmten Zeitpunkten und die Untersuchung der damit verbundenen zellulären Dynamik in Lymphangiogenese und Neurogenese beteiligt. Obwohl das Ausmaß der nativen Vaskularisierung pro mesenterialen Fenster scheint rou seinHinzu kommen rd proportional mit dem Alter haben wir beobachtet, Verzweigung mikrovaskulärer Netzwerke in männlichen Wistar-Ratten im Alter von 4-5 Wochen alt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass das Modell auch konnte Exteriorisation angewandt, um die Unterschiede zwischen den Altersgruppen angiogenen zu vergleichen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Zusätzliche Kommentare </td></tr><tr><td> Drapieren </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Bio-Shield Regelmäßige Sterilisationstücher </td></tr><tr><td> Noyes Micro Scissor </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro Dissecting Frühling Schere; Gerade, spitz-stumpfen Spitzen; 13mm Cutting Edge; 0,25 mm Strichstärke, 4 1/2 &quot;Gesamtlänge </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5135 </td><td> Micro Dissektionszangen; Serrated; leichten Kurve, 0,8 mm Strichstärke; 4 &quot;Länge </td></tr><tr><td> Graefe Forcep </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-5130 </td><td> Micro Dissektionszangen, gezahnt, gerade, 0,8 mm Strichstärke; 4 &quot;Länge </td></tr&gt; <tr><td> 4-0 Naht </td><td> ETHICON </td><td> 699g </td><td> (1,5 metric) Ethilon Nylonnaht Schwarz Monofilament </td></tr><tr><td> 5-0 Naht </td><td> ETHICON </td><td> 8556 </td><td> (1,0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blau Monofilament </td></tr><tr><td> 7-0 Naht </td><td> ETHICON </td><td> 1647G </td><td> (0,5 metric) Ethilon Nylonnaht Schwarz Monofilament </td></tr><tr><td> Castroviejo Micro Nadelhalter </td><td> Fine Science Tools </td><td> 12060-02 </td><td> Tipp Breite: 0,6 mm Einspannlänge: 5mm Länge: 9cm Gerade Spitze </td></tr><tr><td> Castroviejo Nadelhalter </td><td> Fine Science Tools </td><td> 12565-14 </td><td> Tipp Form: Gerade Tipp Breite: 1.5mm Einspannlänge: 10mm Schere: Keine Anschluss: Ja Länge: 14cm Serrated: Ja </td></tr><tr><td> Skalpellgriff </td><td> Roboz für chirurgische Instrumente </td><td> RS-9843 </td><td> Skalpellgriff, # 3, Massive, 4 &quot;Länge </td></tr><tr><td> Sterile chirurgische Klinge </td><td> Cincinnati Surgical </td><td> 0110 </td><td> Edelstahl, Größe 10 </td></tr><tr><td> Petrischale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Abgeschrägte Ridge, rutschfähigen </td></tr></tbody></table> Tabelle der spezifischen chirurgischen Materialien und Werkzeugen. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Zusätzliche Kommentare </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Animal Health Corp Union (bestellt MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 011.168 </td><td> Wirkstoff: pro 100ml, 390 mg Pentobarbital-Natrium, 50mg Phenytoinnatrium </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Fort Dodge Animal Health (bestellt MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 000.680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> LLOYD. Inc. (Bestellt MWI Veterinary Supply) </td><td> MWI #: 009.307 </td><td> Anased 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Saline </td><td> Hospira Inc. </td><td> 94 bis 217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> Vectastain Elite ABC </td><td> Vector Laboratories </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vector Red Nova </td><td> Vector Laboratories </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle der spezifischen Reagenzien

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

Microvacular Netzwerk Wachstum und Umbau sind kritische Aspekte der Wundheilung, Entzündung, diabetische Retinopathie, Tumorwachstum und anderen Krankheitszuständen 1, 2. Netzwerk-Wachstum wird im Allgemeinen Angiogenese, wie das Wachstum neuer Gefäße aus bereits bestehenden Gefäßen definiert zugeschrieben. Die angiogenen Prozess wird auch direkt an Arteriogenese verbunden, definiert als der Kapillare Erwerb einer perivaskuläre Zelle Beschichtung und Behälter Erweiterung. Unnötig zu sagen, ist die Angiogenese komplex und beinhaltet viele Spieler auf zellulärer und molekularer Ebene 3. Zu verstehen, wie ein mikrovaskulären Netzwerk wächst erfordert die Ermittlung der räumlichen und zeitlichen Dynamik entlang der Hierarchie eines Netzwerks über den zeitlichen Verlauf der Angiogenese. Diese Informationen sind kritisch für die Entwicklung von Therapien zu manipulieren Schiff Wachstum ausgerichtet. Die Exteriorisation Modell in diesem Artikel beschrieben stellt ein einfaches, reproduzierbares Modell für stimuliertLating Angiogenese im Rattengekröse. Es wurde von Wundheilung Modelle der Rattengekröse 4-7 ausgebildet, und ist eine Alternative, um die Angiogenese im Mesenterium über ip Injektionen von pro-angiogenen Mittel 8, 9 zu stimulieren. Die Exteriorisation Modell ist attraktiv, weil es eine minimale chirurgische Eingriffe erfordern und für dramatische, reproduzierbare Erhöhung der Kapillare Sprossen, Gefäßbereich und Gefäßdichte innerhalb eines relativ kurzen zeitlichen Verlauf in einem Gewebe, das für die zweidimensionale Darstellung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken ermöglicht bis zu einzelnen Zellebene. Das stimulierte das Wachstum spiegelt natürliche angiogene Antworten in physiologischer Umgebung ohne Störungen von ausländischen angiogenen Molekülen. Mit immunhistochemischen Methoden Kennzeichnung, ist dieses Modell als äußerst hilfreich erwiesen bei der Identifizierung neuer zellulärer Ereignisse an der Angiogenese beteiligt. Forscher können leicht korreliert die angiogenen Metriken während des Zeitverlaufs der Umbau mit der Zeit specific Dynamik, wie zum Beispiel zellulare phänotypischen Veränderungen oder zelluläre Wechselwirkungen 4, 5, 7, 10, 11.

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Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Modell für die Stimulierung der Angiogenese im Rattengekröse. Das Modell stellt eine dramatische Steigerung der Kapillare sprießen, vaskulären Bereich und vaskuläre Dichte über einen relativ kurzen Zeit natürlich in einem Gewebe, das en face Visualisierung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken bis auf die Ebene einzelner Zellen ermöglicht.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K Aufrufe.  Tulane University. Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Modell für die Stimulierung der Angiogenese im Rattengekröse. Das Modell stellt eine dramatische Steigerung der Kapillare sprießen, vaskulären Bereich und vaskuläre Dichte über einen relativ kurzen Zeit natürlich in einem Gewebe, das en face Visualisierung der gesamten mikrovaskulären Netzwerken bis auf die Ebene einzelner Zellen ermöglicht.

Serie: Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Eine In-vitro-Modell für das Studium der Angiogenese (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Forschung

Biologie

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...