Diese Studie wurde zum Teil durch die Regierung von Victoria ist OIS Programm, das National Health and Medical Research Council of Australia Programm-und Projektmanagement Zuschüsse (JPF Chin-Dusting) und Postgraduate-Stipendium (D Michell) unterstützt.

1. Isolating Halsschlagadern <ol><li> Euthanase10 Wochen alte Sprague Dawley Ratten über CO 2 / O 2 Ersticken. </li><li> Excise links und rechts Arteria carotis communis mit Aorta und Herz sicherzustellen minimal Dehnung der Gefäße. </li><li> In eiskalten Krebs-Puffer trennen die Halsschlagadern aus der Aorta und Herz und führen in der Nähe Dissektion. </li><li> Halten Sie isolierten Gefäßen in Krebs auf Eis vor der Montage. </li></ol> Ca. Zeit = 45 Minuten 2. Priming des Schiffes Kammer <ol><li> An der proximalen und distalen Anschlüsse des Schiffes Kammer bündig Krebs-Puffer bei einem physiologischen pH durch Infusion Carbogen Gas (95% O 2, 5% CO 2) aufrechterhalten durch den Puffer bei 37 ° C. </li><li> Stellen Sie sicher, Schläuche und Kanülen sind komplett gespült und ausgerichtet sind. </li><li> Flush Kreb-Puffer durch das P1 (proximal) und P2 (distalen) Wandler. Close Hähne keine Luftblasen in den Wandlern zu gewährleisten. </li><li> Schließen Sie die Sensoren an den entsprechenden Anschlüssen und wieder bündig mehr Krebs-Puffer gewährleistet keine Luftblasen. Close abgreift, um die Kammer. </li></ol> Ca. Zeit = 15 Minuten 3. Durch das Aufdrücken des Schiffes Kammer <ol><li> Schalten Sie Druckgeräte: Druck Servo-, Druck-Monitor, Schlauchpumpe (Abbildung 1). </li><li> Mit der Schlauchpumpe auf Druck und der Druck auf Servo automatisch ablaufenden Krebs-Puffer durch den Schlauch bei 20 mmHg (Zifferblatt bei 1), sodass keine Luftblasen. </li><li> Die Leitungen zu den geschlossenen P2 Wandler. Der Druck wird sich stabilisieren. </li><li> Öffnen P2 tippen, um das Schiff Kammer zu spülen, keine Blasen schließen Sie dann ab. </li><li> Füllen Sie das Bad mit Krebs-Puffer (5 bis 7 mL). </li></ol> Ca. Zeit = 10 Minuten 4. Montage des Schiffes <ol><li> Unter einem Binokular statt schwarzem Polyester Bande auf jede Kanüle (Abbildung 2). </li><li> Bewegen Sie Kanülen und Kanüle Inhaber auseinander und montieren ¼ Gefäß (Aortenbogen Ende) auf die P1 Kanüle. Stellen Sie sicher nicht, das Schiff zu reißen. </li><li> Mit einer Spritze mit Krebs-Puffer gefüllt sanft spülen überschüssiges Blut aus dem Gefäß über P1 Wandler. Schließen Sie P1 an die Kammer. </li><li> Sichere Schiff in den P1 Kanüle mit dem Polyester Krawatte. </li><li> Bewegen Kanülen / Kanüle Inhaber näher für die Montage auf der P2-Kanüle. </li><li> Berg distale Ende des Schiffes (~ ¼ der Länge) auf distalen Kanüle. Sicherer mit Polyester-Krawatte. </li></ol> Ca. Zeit = 20 Minuten 5. Durch das Aufdrücken des Schiffes <ol><li> Passen Sie die Kanüle Inhaber keine beugen oder strecken in das Schiff zu sichern. </li><li> Mit P1 und P2 geschlossen, um die Kammer-Schalter der Druck Servo von automatisch auf manuell. Überprüfen Sie auf der Druck-Servo gibt es keine kontinuierliche Abnahme der Druck innerhalb von 10 Sekunden. Wenn ja, ist ein Leck auftritt und die Anschlüsse und Sensoren benötigen, um im Platz zu sichern. </li><li> Passen Sie den Druck Servo zurück zur automatischen öffnen P2 in die Kammer. Unter dem Mikroskop beobachten, das Schiff ausdehnen, wenn der Hahn in die Kammer geöffnet wird. </li><li> Schalten Sie den Druck Servo-Handbuch. Kontrollieren Sie wieder für eine kontinuierliche Abnahme des Drucks innerhalb von 10 Sekunden. Wenn ein Leck vorhanden ist dann ist das System nicht dicht Druck und es wird wahrscheinlich ein Loch in das Schiff sein. </li><li> Zurück zur automatischen Öffnen P1 in die Kammer. Auf die manuelle Einstellung zu überprüfen, dass der Druck stabil bleibt. </li><li> Wenn kein Leck, auf manuelle Einstellung zu erhöhen Rad 2 (40 mmHg). </li><li> Passen Sie die automatische und beobachten das Schiff unter dem Mikroskop. Wenn nötig, passen Sie die Kanülenhalter keinen Knick in der vessel.Check auf Undichtigkeiten auf manuelle Einstellung zu gewährleisten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,6 bis 5,7 erhöht die Wählscheibe auf 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) und so weiter, bis der gewünschte Druck erreicht ist. </li></ol> Ca. Zeit = 15 bis 30 Minuten 6. Inkubation des unter Druck stehenden Behälter <ol><li> Verbinden Sie den Temperaturregler eingestellt auf 37 ° C. </li><li> Mit einem zweiten Schlauchpumpe perfuse Krebs-Puffer (1 mL / min) in das Gefäß Kammer Bad. </li><li> Connect Aspirator an die Kammer sicher, dass nur die oberste Schicht des Bades entfernt wird. </li><li> Inkubieren unter Druck stehenden Behälter bei 37 ° C für 1 Stunde mit dem Druck auf automatisch. </li><li> Überprüfen Sie den Druck nicht undicht ist (Umschalten auf manuelle) in regelmäßigen Abständen. </li><li> Die Auswirkungen der verschiedenen pharmakologischen Interventionen können durch einfaches Hinzufügen der Verbindung zum Bad während der Inkubation beobachtet werden. </li></ol> Ca. Zeit = 1 Stunde 7. Perfusion der unter Druck stehenden Behälter mit Vollblut <ol><li> Während der Inkubation erhalten mindestens 7,5 mL Vollblut / Schiff in 40 U Heparin / ml Blut gesammelt. Inkubieren in einem 50 ml Falcon bei 37 ° C. </li><li> 10 Minuten vor dem Ende der ter Inkubation Label Blut mit VybrantDil (1:1000) für 10 Minuten bei 37 ° C im Dunkeln. </li><li> Nach 10 Minuten sammeln Blut in eine Spritze Clearing keine Blasen und legen auf eine Spritzenpumpe mit einem Heizmantel auf 37 ° C. </li><li> Schließen Sie P1 Wandler, um die Kammer / Schiff und verbinden Spritze und Ablaufschlauch. </li><li> Purge Blut bei 1000 ul / min durch den Ablaufschlauch keine Luftblasen zu entfernen. </li><li> Öffnen P1 in die Kammer. Der Druck Servo wird automatisch angepasst, um gewünschten Druck zu halten. </li><li> Perfundieren Blut bei 100 ul / min. </li><li> Mit einem Fluoreszenz-Mikroskop gekoppelt mit einer digitalen Kamera aufnehmen zwei Felder des perfundierten Gefäß für 15 Sekunden bei 1, 3, 5, 7,5 und 10 Minuten. </li><li> Beitrag Perfusion endothelialen Integrität und Funktion kann über pharmakologische Techniken wie Myographions und Adhäsionsmolekül Expression kann immunhistochemisch bestimmt werden, um weiter zu validieren die entzündliche Reaktion zu beurteilen. </li></ol> Ca. Zeit = 15 Minuten 8. Repräsentative Ergebnisse: Eine schematische Darstellung der Druckkammer Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Mit einer Digitalkamera gekoppelt mit einem Fluoreszenzmikroskop Ergebnisse können sofort per Live-Video-Aufnahmen sichtbar gemacht werden. Vertreter Videobilder werden in Abbildung 3, wo Leukozyten gelten als Anhänger des Endothels, wenn sie 10 Sekunden lang stationär geblieben zu sehen sind. Mit Video-Aufnahmen auf Endlosschleife eingehalten Zellen können als Mittelwert pro Feld gezählt werden. Während beide niedrig sind (Abbildung 3A) und hoch (Abbildung 3B) Druck ein gewisses Maß an Haftung verursachen einen signifikanten Anstieg der Leukozyten-Adhäsion an der höheren intraluminalen Druck gesehen, und das ist auch quantitativ (Abbildung 4) demonstriert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> Abbildung 1. Unter Druck ex vivo Schiff Kammer schematisch. Ein kanülierten Schiff verbunden mit einem proximalen (P1) Wandler und einem distalen (P2) Wandler, dass der Blutdruck ermöglicht, innerhalb des Behälters manipuliert werden. Perfusion wird durch die P1 Wandler und Druck über P2 Wandler gewartet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> Abbildung 2. Cannuala mit Krawatten. Schwarze Polyester-Verbindungen sind zu jeder Kanüle befestigt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter von Videobildern. Dynamische Zelladhäsion (roter Pfeil) unter Fluoreszenz bei 80 mmHg (A) und 120 mmHg (B) nach 10 Minuten Perfusion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> Abbildung 4. Leukozytenadhäsion in Sprague Dawley Halsschlagadern nach 1 Stunde Inkubation bei niedrigen (80 mmHg) und hohem Druck (120 mmHg). *** P &lt;0,001, wie 2-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferroni post hoc Test analysiert.

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	<li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors.">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li><li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension.">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 .</li><li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall.">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li><li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+not+hemodynamic,+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res.">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li><li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment.">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li><li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation.">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li><li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling.">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li><li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator.">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li></ol>

Das Studienprotokoll wurde von der Alfred Medical Research and Education Precinct Animal Ethics Committee und der Alfred Hospital Ethics Committee genehmigt.

Dies ist eine modifizierte Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in intakten isolierten Blutgefäßen unter Druckbedingungen in Echtzeit zu studieren. Perfusion des Schiffes Kammer allein ermöglicht eine schnelle Validierung von pro-inflammatorischen Stämme von großen Mäusen und Ratten Schiffe. Aktivieren Druck Manipulation ermöglicht dynamische Zell-Interaktionen von niedrig bis sehr hoch intraluminalen Druck, damit eine bessere Mimik-Ing physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen eingehalten werden. Durchmesser der Gefäße können ebenfalls gemessen mit einer ausreichenden Zell-Imaging-Programm und damit Scherströmung und kann ermittelt werden und somit manipuliert werden. Mit seiner Myographions Fähigkeiten, fügen pharmakologische Interventionen in das Bad gelegt weitere Dimension der experimentellen Bedingungen möglich mit diesem Modell ermöglicht Untersuchungen von mechanistischen und Signalwege. Während endothelial Erhaltung kann nicht während der Druck Manipulation bestätigt werden, können Reaktionen auf ACh und PE post Perfusion 9 geführt werden. Anzumerken ist, dass dieses Setup die Auswirkungen der intraluminale Druck auf Zell-Zell-Interaktionen nicht die Auswirkungen des pulsierenden Blutflusses noch systolische oder diastolische Druck zeigt werden. Hinzu kommt, dass akute Druckänderungen auf Leukozytenadhäsion beobachtet wurden, kann dieses Setup auch genutzt werden, um bei chronischen Druck-Effekte (dh die Erhöhung Inkubationszeiten und mit einem chronischen Druck Tiermodell) zu suchen. Sprague Dawley Arteria carotis communis werden in dieser Einrichtung aber gezeigt, andere Stämme und Arten können mit entsprechenden Anpassungen an die Kanüle Größe verwendet werden. In der Tat ist es wichtig zu beachten, dass das Alter und Gewicht der Tiere Gefäßgröße beeinflussen und damit, dass die Einrichtung muss für jedes Schiff individuell angepasst werden. Close und sorgfältige Dissektion des Bindegewebes kann Visualisierung der Leukozyten immens verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> SteREO Discovery V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Digitalkamera und Controller </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Beleuchtungssystem </td><td> Lumen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Vessel Kammer </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Pressure Servo Controller und Schlauchpumpen </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Perfusion Pressure Monitor </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x Druckaufnehmer </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil Zell-Kennzeichnung Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Verwenden 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

Worldwide, Bluthochdruck wird berichtet, dass in etwa ein Viertel der Bevölkerung und ist der führende biomedizinische Risikofaktor für die Mortalität weltweit. In den Gefäßen Hypertonie ist mit einer endothelialen Dysfunktion und erhöhte Entzündung führt zu Arteriosklerose und verschiedenen Krankheiten wie chronischen Nierenerkrankungen 2, 3 und Schlaganfall Herzinsuffizienz 4 zugeordnet. Ein erster Schritt in Gefäßentzündungen führt zu Arteriosklerose ist die Haftung Kaskade, die die Rollen, Anbindehaltung, die Einhaltung und anschließende Transmigration von Leukozyten durch das Endothel handelt. Rekrutierung und Akkumulation von Leukozyten an das Endothel wird durch eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen wie vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intrazelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) und E-Selektin sowie Erhöhungen in vermittelter Zytokin-und Chemokin-Freisetzung und eine Hochregulation von reaktiven Sauerstoff-Spezies 5. In-vitro-Methoden wie z. B. statische Haftung Assays helfen, die Mechanismen der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sowie die Analyse von Zell-Adhäsionsmoleküle zu bestimmen. Methoden in der früheren in vitro Studien verwendet haben gezeigt, dass akute Erhöhungen der Druck auf das Endothel kann Monozytenadhäsion, eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen und Entzündungsmarker 6 hingegen, ähnlich wie bei vielen in-vitro-Assays, diese Erkenntnisse noch nicht in Echtzeit durchgeführt führen unter physiologischen Strömungsverhältnisse, noch mit Vollblut. Daher sind in-vivo-Untersuchungen zunehmend in Tiermodellen genutzt werden, um vaskuläre Entzündungen und die Bildung von Zahnbelag zu demonstrieren. Intravital Mikroskopie ist mittlerweile weit verbreitet, um Leukozytenadhäsion, Walzgut, Migration und Transmigration 7-9 zu bewerten. Bei der Kombination der Auswirkungen von Druck auf die Leukozyten an endotheliale Adhäsion der in-vivo-Studien sind weniger umfangreich. Eine solche Studie untersucht die Echtzeit-Effekte von Strömungs-und Scherung auf arterielle Wachstum und Umbau, sondern Entzündungsmarker waren nur über Immunhistochemie 10 beurteilt. Hier präsentieren wir ein Modell für die Aufnahme Leukozytenadhäsion in Echtzeit in intakten Druck Blutgefäße mit Vollblut Perfusion. Die Methodik ist eine Modifikation eines Ex-vivo-Perfusion Schiff Kammer-Modell 9, die Echtzeit-Analyse von Leukozyten-Endothel-adhäsiven Wechselwirkungen in intakten Behältern ermöglicht. Unsere Modifikation ermöglicht die Manipulation der intraluminale Druck bis 200 mmHg Berücksichtigung Studie nicht nur unter physiologischen Strömungsverhältnisse, sondern auch Druckbedingungen. Während der Druck Myographie Systeme zuvor unter Beweis gestellt haben, um Gefäßwand und Lumen Durchmesser 11 sowie Gefäß Kontraktion zu beobachten ist dies das erste Mal zeigen, Leukozyten-Endothel-Interaktionen in Echtzeit. Hier zeigen wir die Technik mit Halsschlagadern von Ratten entnommen und Kanüle eingeführt, um eine maßgeschneiderte Flusskammer gekoppelt mit einem Fluoreszenzmikroskop. Das Schiff Kammer ist mit einem großen unteren Deckglas so einem großen Durchmesser Objektiv mit kurzer Arbeitsabstand zum Bild des Schiffes ausgestattet. Darüber hinaus können ausgewählte Agonisten und / oder Antagonisten eingesetzt zur weiteren Untersuchung der Mechanismen, die Zelladhäsion werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber Intravitalmikroskopie sind keine Beteiligung von invasiven Chirurgie und somit ein höherer Durchsatz erreicht werden kann. Diese Methode ermöglicht auch die Verwendung von lokalisierten Inhibitor Behandlung, um die gewünschte Gefäß während intravital nur ermöglicht systemische Inhibitor Behandlung.

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Dies ist eine Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in geerntet Druckbehälter zu visualisieren. Die Technik ermöglicht das Studium vaskulären Haftung unter Scherströmung mit unterschiedlichen intraluminale Drücke bis 200 mmHg damit nachahmen-Ing den pathophysiologischen Bedingungen des hohen Blutdrucks.

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Aufrufe.  Monash University. Dies ist eine Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in geerntet Druckbehälter zu visualisieren. Die Technik ermöglicht das Studium vaskulären Haftung unter Scherströmung mit unterschiedlichen intraluminale Drücke bis 200 mmHg damit nachahmen-Ing den pathophysiologischen Bedingungen des hohen Blutdrucks.

Serie: Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Biotechnik

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Entwicklungsbiologie

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

Source: Herr, N. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53077">Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

Intravitalmikroskopie zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Blutzellen und Endothel in einem Entzündungs-Mausmodell

Source: Herr, N. et al., Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice. J. Vis. Exp. ...

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo