Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen Erkrankungen wie Sepsis. Entzündungsstörungen verursachen oft eine veränderte Funktion der vaskulären Endothelbarriere und einen übermäßigen Leukozytentransport, der zu Organschäden führen kann. Der biomimetische mikrofluidische Assay, was wir bMFA nennen, reproduziert die Topographie und die Strömungsbedingungen von in-vivo mikrovaskulären Netzwerken und ermöglicht die Echtzeitbewertung von rollenden, festen Adhäsionen, Ausbreitung und Migration von Neutrophilen in das Gewebekompartiment.
Eine Stärke des biomimetischen mikrofluidischen Assays ist die Fähigkeit, primäre menschliche Zellen und klinisch relevante Patientenproben zu verwenden, um die klinische Translation zu erhöhen und potenzielle Therapeutika schnell zu screenen. Herr Qingliang Yang, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter meines Labors, wird die Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit dem Einführen des etwa einen Zoll langen Rohrs in die Anschlüsse mit einer feinen Pinzette, mit Ausnahme eines Einlassanschlusses.
Klemmen Sie mit Backenklemmen die beiden Auslassanschlüsse und das Gewebefach zusammen. Verdünnen Sie die Fibronektin-Stammlösung mit PBS auf 100 Mikrogramm pro Milliliter. Laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen 24-Gauge-Nadel verbunden ist, mit der verdünnten Fibronektinlösung und verbinden Sie die Spritze mit einem vier Zoll langen Schlauch.
Führen Sie den Schlauch in den offenen Einlassanschluss ein, drücken Sie dann den Kolben, bis menschliches Fibronektin aus einem anderen Einlassanschluss freigesetzt wird, und klemmen Sie es ein. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Ports, bis alle Kanäle, das Gewebefach und der Schlauch mit der menschlichen Fibronektinlösung gefüllt sind. Entfernen Sie die Nadel, aber halten Sie den vier Zoll langen Schlauch eingelegt und ungeklemmt.
Um die Entgasung durchzuführen, schließen Sie den ungeklemmten Schlauch an den pneumatischen Primer an, der mit einem komprimierten Stickstofftank mit einem Druck von fünf Pfund pro Quadratzoll für 15 Minuten verbunden ist. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob keine Luftblasen im Kanal oder Gewebefach eingeschlossen sind, und schließen Sie das Gerät wieder an, wenn die Luftblasen vorhanden sind. Nehmen Sie das Gerät aus dem pneumatischen Primer und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Verwenden Sie vorerwärmte mikrovaskuläre Endothelzellkulturmedien der menschlichen Lunge, spülen Sie alle Kanäle und das Gewebekompartiment. Nach der Ernte der Endothelzellen, wie im Textmanuskript beschrieben, pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang durch Zentrifugation bei 150-facher G.In der programmierbaren Spritzenpumpe, montieren Sie eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie den Schlauch an der stumpfen Nadel. Ziehen Sie etwa 20 Mikroliter der Zellsuspension in den Schlauch, ohne sie in den Spritzenzylinder zu lassen.
Entfernen Sie die Klemme aus dem Auslassanschluss des Geräts. Schließen Sie den Schlauch an den Einlassanschluss an, ohne Luftblasen in den Kanal einzuführen. Stoppen Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von vier bis acht Mikrolitern pro Minute und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop.
Stoppen Sie die Pumpe, wenn die Kanäle mit Zellen gefüllt sind. Klemmen Sie den Auslass und schneiden Sie den Einlassschlauch ab. Stellen Sie das Gerät vier Stunden lang bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius in den Inkubator.
Bereiten Sie nach vier Stunden Inkubation eine weitere Spritze vor und füllen Sie sie mit frischen Zellkulturmedien. Montieren Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und schließen Sie sie an den Einlassanschluss an. Entfernen Sie die Klemme aus dem Steckdosenanschluss.
Führen Sie die frischen Medien etwa fünf Minuten lang mit vier bis acht Mikrolitern pro Minute durch das Gerät, um die schwebenden oder nicht angeschlossenen Zellen zu entfernen. Bereiten Sie eine Spritze vor, indem Sie sie mit frischen Zellkulturmedien füllen. Montieren Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und schließen Sie sie an einen Einlassanschluss an, während der Auslassanschluss offen bleibt.
Stellen Sie das Gerät bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einen Inkubator. Programmieren Sie die Spritzenpumpe für die Kultivierung von Endothelzellen im Fluss, wie im Textmanuskript beschrieben. Überprüfen Sie bMFA mit einem Mikroskop nach 48 Stunden Kultur unter Fluss.
Die konfokale Mikroskopie zeigte, dass alle Oberflächen der Gefäßkanäle von Endothelzellen bedeckt waren, die ein vollständiges 3D-Lumen in bMFA bildeten. Nach der Herstellung von drei verschiedenen bMFA-Geräten laden Sie drei Ein-Milliliter-Spritzen mit Zellkulturmedien oder TNF-alpha oder TNF-alpha in Kombination mit PKC-Delta-Inhibitor, wobei TNF-alpha und entzündliches Zytokin zur Stimulation von Endothelzellen und Neutrophilen verwendet werden. PKC-Delta-Inhibitor ist ein neuartiger entzündungshemmender Hemmer.
Verbinden Sie die drei geladenen Spritzen mit drei bMFA-Geräten. Mit Puffer TNF-alpha oder TNF-alpha mit zugesetztem Inhibitor behandeln Sie menschliche lungenmikrovaskuläre Endothelzellen vier Stunden lang mit 0,1 Mikrolitern pro Minute. Nach der Isolierung der menschlichen Neutrophilen, wie im Textmanuskript beschrieben, suspendieren Sie die Neutrophilen in 999 Mikroliter HEPES-Puffer und fügen Sie der Suspension einen Mikroliter 10-millimolare CFDA SE-Farbstoff-Stammlösung hinzu, was zu einer 10-mikromolaren Arbeitslösung von CFDA SE führt, und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit HEPES-Puffer, indem Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 315 mal G zentrifugieren.Nach dem Zählen der Zellen bei 2 Millionen Neutrophilen pro Milliliter in Zellkulturmedien oder TNF-alpha oder TNF-alpha mit PKC-Delta-Inhibitor zentrifugieren und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren. Füllen Sie die Spritze mit einem Mikromolar eines Chemo-Lockstoffs, fMLP, der in Zellkulturmedien hergestellt wird. Öffnen Sie einen Einlass- und einen Auslassanschluss des bMFA.
Entfernen Sie den Anschlussschlauch aus dem Gewebefach und setzen Sie den fMLP-Schlauch ein. Injizieren Sie etwa 20 Mikroliter fMLP in das Gewebekompartiment für alle bMFA, wobei das mit Zellkulturmedien behandelte Mikroliter übrig bleibt. Schneiden Sie den Schlauch ab und klemmen Sie ihn ein.
Füllen Sie die Spritze mit ca. 200 Mikrolitern Neutrophilensuspension auf und montieren Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe. Nachdem Sie das Gerät auf einen inversen Mikroskoptisch gestellt haben, stellen Sie die Durchflussrate auf einen Mikroliter pro Minute ein und starten Sie die Pumpe. Warten Sie, bis ein kleiner Tropfen der Neutrophilensuspension aus dem Schlauch kommt und führen Sie den Schlauch in den Einlassanschluss ein.
Fluoreszenzmarkierte Neutrophile fließen in die Gefäßkanäle und interagieren mit Endothelzellen und den physiologisch relevanten Strömungsbedingungen. Öffnen Sie nach 10 Minuten nach Beginn des Experiments die Bildanalysesoftware, schalten Sie das Objektiv auf 10x um und verwenden Sie den Bühnenjoystick, um das Gerät unter dem Mikroskop zu zentrieren. Um die Adhäsionskarte zu erhalten, gehen Sie zu Erfassen und klicken Sie auf Großes Bild scannen.
Ein neues Fenster öffnet sich. Wählen Sie 10x Objektiv und stellen Sie die Feldoption ein, z. B. 5 x 3. Klicken Sie auf Scannen, klicken Sie auf Datei, und speichern Sie die Klebezuordnung.
Um die Migrationskarte für die Migrationsanalyse zu erhalten, zentrieren Sie das Gerät mit dem Bühnenjoystick unter dem Mikroskop. Klicken Sie auf Ansicht, Erfassungssteuerung, ND-Erfassung. Ein neues Fenster öffnet sich.
Legen Sie den Pfad fest, um die Datei zu speichern, und geben Sie den Dateinamen ein. Überprüfen Sie die Funktion "Großes Bild" und stellen Sie den Scanbereich ein, z. B. 5 x 3. Überprüfen Sie die Zeitfunktion, legen Sie das Intervall auf fünf Minuten und die Dauer auf 60 Minuten fest.
Machen Sie Zeitrafferbilder des Gewebekompartiments, wobei in der nächsten Stunde alle fünf Minuten ein Bild aufgenommen wird. Die CFD-Simulation zeigt das laminare Strömungsmuster in Gefäßkanälen, mit Ausnahme von Bifurkationsbereichen, in denen das Strömungsmuster gestört ist. Nach der Durchführung des biomimetischen Mikrofluid-Assays zeigten Phasenkontrastbilder, dass die Oberflächen der Gefäßkanäle nach 48 Stunden Kultur mit Endothelzellen bedeckt und in Richtung Scherfluss ausgerichtet waren.
Die Fluoreszenzbildgebung wurde mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt, was darauf hindeutet, dass die Endothelzellen in bMFA ein vollständiges dreidimensionales Lumen bilden Eine neutrophile Adhäsionskarte wurde erhalten, die zeigte, dass es eine signifikante Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen in bMFA gibt. Die Neutrophilenmigrationskarte in bMFA zeigte, dass bei der TNF-alpha-Aktivierung eine beträchtliche Migration von Neutrophilen innerhalb des Gewebekompartiments auftritt, während keine solche Migration ohne TNF-alpha-Aktivierung beobachtet wurde. Eine Adhäsionskarte, die die räumliche Verteilung von Neutrophilen mit der Scherrate korreliert, zeigte, dass die Neutrophilenadhäsion bevorzugt in Gefäßen mit geringer Scherrate und in der Nähe von Bifurkationsregionen auftrat.
Darüber hinaus erhöht die TNF-alpha-Behandlung signifikant die Adhäsion, die mit dem PKC-Delta-Inhibitor gehemmt wurde. Die Analyse von Zeitrafferbildern zeigte, dass die TNF-Aktivierung von Endothelzellen die Neutrophilenmigration als Reaktion auf fMLP erhöht, während die Behandlung mit dem PKC-Delta-Inhibitor die Migration im Vergleich zu TNF-alpha-behandelten Zellen reduzierte. So kann bMFA verwendet werden, um die Wirksamkeit eines neuartigen Therapeutikums zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen zu testen.
Der bMFA kann auch verwendet werden, um die Endothelintegrität zu untersuchen, indem Variablen wie Permeabilität und transendothelialer elektrischer Widerstand, sogenannter TEER und Adhäsionsmolekülexpression während einer Entzündung gemessen werden. Der biomimetische mikrofluidische Assay kann die Mikroumgebung verschiedener Organe nachahmen und ist nicht auf einzelne Zelltypen oder Spezies beschränkt, sondern kann auch die Zell-Zell-Kommunikation modellieren, die für die Organfunktion entscheidend ist, und verschiedene Krankheiten modellieren.
